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Practica No. 8 Pruebas Bioquímicas Cuestionario Previo 1. ¿Qué son las enzimas? Son sustancias de naturaleza proteica 2.

Define los siguientes términos: ✔ Enzima: Catalizadores de reacciones químicas que actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en diferentes moléculas, los productos. ✔ Sustrato: Es una especie química que se considera, de forma explícita, objeto de la acción de otros reactivos, como las enzimas. ✔ Sitio activo: La reacción específica que una enzima controla depende de un área de su estructura terciaria. ✔ Exoenzima: Son enzimas que son excretadas por las células microbianas al medio que las rodea. ✔ Endoenzima: Son enzimas que se encuentran en el interior de la célula microbiana 3. ¿Cuáles son y cómo afectan los factores físicos y químicos en la activación enzimática? ✔ El pH: Influye sobre las cargas eléctricas y puede alterar la estructura del centro activo y, por lo tanto, también influirá sobre la actividad enzimática. ✔ La temperatura: Al aumentar la temperatura se desnaturaliza las moléculas proteicas por lo que los sitios activos se ven modificados. ✔ Concentración del sustrato: La enzima se satura a cierta concentración. 4. Explique el fundamento de las siguientes pruebas bioquímicas:
Prueba Medio de cultivo CLPBC Propósito Inoculación e incubación Sembrar por asada Incubar: 24-48 hrs/37ºC Sembrar por estría recta Incubar: 24-48 hrs/37ºC Sembrar por asada Incubar: 24-48 Tratamiento postincubacion Ninguno Resultados Positivo Negativo Ácido: Amarillo Base: Azul o guinda

Caldo lactosa Indicador: Purpura de bromocresol Hidrólisis de Almidón Revelador: lugol Degradación de urea Indicador:

Fermentación de lactosa

Agar almidón

Producción de la exoenzima: α-amilasa

2 a 3 gotas de Iodo que cubran todo el medio de cultivo Ninguno

Área blanca alrededor del cultivo

Color negro alrededor del cultivo

Caldo Urea

Producción de la enzima: Ureasa

Base: Rosa intenso/

Ácido: amarillo

Rojo de fenol Rojo de metilo Voges Proskauer Indicador: Rojo de metilo Caldo RM-VP Rojo de Metilo: Determinar la habilidad de las bacterias para producir y mantener sustancias ácidas (formación de ácidos mixtos) VogesProskauer: Determinar la capacidad de transformar sustancias acídicas a no acídicas (formación de acetoina) Oxidación fermentación Indicador: azul de bromotimol Medio Hugh & Leifson Exponer las vías óxidativa y/o fermentativa a partir de carbohidratos y teniendo ácido pirúvico como producto

hrs/37ºC Sembrar por asada Incubar: 37ºC RM: 7días VP: 48 hrs. A las 48 hrs. se divide el cultivo en dos RM: Dejar en la incubadora por 7 días, luego añadir 5 gotas de rojo de metilo VP: Se añaden 10 gotas de αnaftol y 5 gotas de KOH 40%. Esperar 30 min

rojo RM: Rojo Presencia de acido (pH 4) VP: Rosa intenso/ rojo RM: Amarillo el ácido fue transforma do a sustancias no acídicas. VP: Amarillo/ marrón claro

Sembrar dos tubos por picadura Incubar: 24-48 hrs/37ºC

Después de inocular agregar parafina a uno de los tubos

Tubo c/parafina: verde Tubo s/nada: Amarillo OXIDACIÓN Tubo c/parafina: amarillo Tubo s/nada: amarillo

Tubo c/parafina: verde Tubo s/nada: verde

FERMENTACIÓ N

Fermentación de Glucosa y lactosa Indicador: rojo de fenol

Kligler

Determinar si el microorganis mo es capaz de fermentar la glucosa y lactosa, producción de gas y de H2S.

Sembrar por picadura y estría ondulada Incubar: 24-48 hrs/37ºC

Ninguno

Prueba de

Medio

La coagulasa es un enzima

Sembrar por

Ninguno

Formación

Medio

coagulasa Indicador: Ninguno

CCC con plasma

capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. Se busca el factor de aglutinación de los moos cuando estos se mezclan con el plasma.

asada Incubar: 24-48 hrs/37ºC

de un coagulo o medio semisólido

liquido sin presencia de coágulos

Fermentación de manitol Indicador: rojo de fenol Catalasa Indicador: H2O2 Oxidasa Indicador: Reactivo de oxidasa

CMRF c/tubo Durham

Evidenciar la presencia de la enzima manitolasa Determinar la presencia de la enzima catalasa Determinar si la presencia de la enzima oxidasa

Sembrar por asada Incubar: 24-48 hrs/37ºC Sembrar por estría recta Incubar: 24-48 hrs/37ºC Sembrar por estría recta Incubar: 24-48 hrs/37ºC

Ninguno

Ácido: Amarillo

Base: Rosa intenso

Agar nutritivo

2 ó 3 gotas de H2O2 sobre el crecimiento

Efervescenc ia

Se queda igual

Agar nutritivo

Tomar una asada sobre un papel filtro y agregar una gota de reactivo oxidasa Ninguno

Azul/purpur a (el cambio es notable en menos de 15 segundos) Halo alrededor de la siembra

Se queda igual

Caseínasa Indicador: Ninguno

Agar leche descrema da

Determinar si el microorganis mo es capaz de degradar la caseína Determinar si el microorganis mo utiliza el citrato como única fuente de carbono Diferenciar los moos. que producen descarboxilaci ón de la lisina

Sembrar por estría recta Incubar: 24-48 hrs/37ºC

Se queda igual

Utilización del citrato Indicador: azul de bromotimol Descarboxilaci ón de lisina Indicador: púrpura de bromocresol

Citrato de Simmons

Sembrar por asada Incubar: 18-24 hrs/37ºC

Ninguno

Ácido: Color amarillo

Base: Color azul/ verde

Agar de Hierro y lisina (LIA)

Sembrar por picadura y estría ondulada Incubar: 18-24 hrs/37ºC

Ninguno

Descarboxilaci ón de ornitina Indicador: Purpura de bromocresol Desaminación de la fenilalanina Indicador: FeCl3

MIO

Determinar si el moo. tiene la enzima ornitina descarboxilas a Determinar la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa

Sembrar por picadura Incubar: 48 hrs/37ºC

Agregar 4 gotas de reactivo de Ehrlich o Kovacs Agregar 4 gotas de FeCl3 10%

Base: Morado intenso

Ácido: Amarillo

Agar fenilalanin a

Sembrar por estría ondulada sobre pico de flauta Incubar: 18-24 hrs/37ºC

Color verde intenso

Color marrón

Sacarosa Indicador: Ninguno

CSPB

Determinar la presencia de la enzima invertasa

Sembrar por asada Incubar: 18-24 hrs/37ºC

Ninguno

Ácido: Amarillo

Base: Morado intenso

DNAsa Indicador: HCl

Agar DNAsa

Determinar la capacidad de un moo. de producir la enzima desoxirribonucleasa (DNAsa)

Sembrar por estría recta Incubar: 24248hrs/37ºC

4 gotas de HCL

Halo alrededor de la siembra

Sin halo

Proteínas, aminoácidos y enzimas Indicador:

SIM

4 gotas de reactivo de Kovac o Erlich

1.Rojo en presencia de indol ( el triptófano fue degradado) 2. Precipitado negro presencia

1. Amarillo (el microorganismo no puede degradar el triptófano) 2. El medio se queda igual

de H2S 3. Difuminació n del crecimiento del microorganismo hacia los lados (movilidad)

3. El microorganismo solo crece en la línea de iniculación (no es móvil)

5. Busca una tabla de indicadores ácido-base
Indicador Amarillo de alizarina gg Azul de bromofenol Azul de bromotimol Fenolftaleína M-cresolpúrpura Naranja de metilo Púrpura de bromocresol Rojo congo Rojo de bromofenol Rojo de cresol Rojo de fenol Rojo de metilo Rojo neutro Timolftaleína Tornasol Violeta de metilo 4-dimetilaminobenzol (F) esculina Color ácido Amarillo claro Amarillo Amarillo Incoloro Amarillo Rojo Amarillo Azul violeta Naranja amarillo Amarillo Amarillo Rojo Azul rojizo Incoloro Rojo Amarillo Rojo Índigo débil Ph viraje 10,0 - 12,1 3,0 - 4,6 6,0 - 7,6 8,2 - 9,8 7,4 - 9,0 3,1 - 4,4 5,2 - 6,8 3,0 - 5,2 5,2 - 6,8 7,0 - 8,8 6,4 - 8,2 4,4 - 6,2 6,4 - 8,0 8,6 - 10,0 5,0 - 8,0 0,1 - 1,6 2,9 - 4,0 1,0 - 1,5 Color básico Rojo castaño Violeta Azul Violeta / rosa Púrpura Amarillo naranja Púrpura Rojo naranja Púrpura Púrpura Rojo Amarillo naranja Naranja amarillo Azul Azul Azul / violeta Amarillo naranja Azul intenso

(F) beta-naftilamina (F) alfa-naftilamina (F) fluoresceína (F) eosina (F) eritrosina (F) acridina (F) umbeliferona (F) cumarina (F) beta-metil umbeliferona

Incoloro Incoloro Azulado Incoloro Incoloro Verde Incoloro Incoloro Índigo débil

2,8 - 4,4 3,4 - 4,8 3,8 - 4,3 3,9 - 4,5 3,7 - 4,6 5,3 - 6,4 6,2 - 8,3 9,2 - 10,5 6,9 - 7,1

Violeta Azul Azul intenso Amarillo naranja Amarillo verdoso Violeta Azul intenso Verde amarillo Azul intenso

6. Busca tablas de identificación de microorganismos en base a pruebas bioquímicas