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tRNA-Ribosoma

Marco Nardini
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Universit di Milano

Struttura Acidi Nucleici


RNA, DNA
acidi nucleici = polinucleotidi (polimeri di nucleotidi) in cui un gruppo
fosforico fa da ponte fra le posizioni 3 e 5 di due unit
ribosio vicine
- legame fosfodiestere (2 legami esteri con 2
unit ribosio)
- gruppi fosforici acidi (a pH fisiologico gli
acidi nucleici sono polianioni
- estremit 5
residuo con posizione C5 non
impegnata con altro nucleotide
- estremit 3
residuo con posizione C3 libera

Struttura Acidi Nucleici


RNA, DNA
- le propriet fisiche del polimero variano rispetto al monomero e
dipendono dalle dimensioni (es: carica, solubilit)
- il polimero (formato da monomeri non identici) rispetto al monomero
contiene una informazione relativa alla sequenza
RNA nessuna regola sulla composizione nucleotidica
DNA n A = T e n G = C

(Regole di Chargaff) natura doppia


elica del DNA

- composizione in basi del DNA molto variabile tra organismi diversi


Es: G + C dal 25% -75%
(ma ~costante in specie correlate: es. 39% -46% nei mammiferi)

Acidi Nucleici: DNA e RNA

Struttura RNA
- catene di DNA ad elica singola sono rare (materiale genetico virale)
- lRNA si trova prevalentemente sotto forma di catena singola
non in forma estesa ma in una strutture compatte
catene di RNA a doppia elica in materiale genetico virale
- una catena di RNA (identica al DNA a meno di U al posto di T e per
la presenza di 2-OH) pu formare accoppiamenti di basi con una
catena complementare di RNA o DNA
- laccoppiamento di basi (GC e AU)
avviene spesso intramolecolarmente
il singolo filamento di RNA pu ripiegarsi in
modo che sequenze complementari di basi
formino uno stelo con loop a singolo filamento
(struttura a stelo e ansa o a forcina)

Struttura RNA
- RNA a doppia elica non pu assumere una conformazione simile
al DNA B per interferenze steriche che coinvolgono i gruppi 2-OH
- conformazione simile al DNA A possibile elica destrorsa, passo
dellelica 30.9 , nucl/giro 11.9, inclinazione basi/asse elica ~16.7
- doppie eliche ibride RNA-DNA: strutture tipo DNA A o intermedie fra
DNA A e DNA B
- corte doppie eliche ibride durante linizio
della replicazione del DNA e durante la
trascrizione del RNA sul DNA
10-bp RNADNA hybrid helix consisting of
d(GGCGCCCGAA) in complex with r(UUCGGGCGCC)

Struttura RNA
- la struttura del RNA stabilizzata dalle stesse forze che stabilizzano il
DNA
- la flessibilit conformazionale dellRNA limitata in modo analogo al
DNA (pu essere anche pi rigido a causa delle interazioni con
molecole di H2O dei suoi gruppi 2-OH)
- tuttavia lRNA ha forme e dimensioni maggiormente variabili
rispetto al DNA
- la potenziale complessit strutturale del RNA si riflette nel fatto che
lRNA non mantiene e trasmette solo linformazione genetica ma pu
legare piccole molecole e catalizzare reazioni chimiche

Il mondo ad RNA
Evidenze:
- gli acidi nucleici possono dirigere la propria sintesi
- nelle cellule esistono molti enzimi proteici in grado di interagire col
DNA ma pochi con lRNA
- molti coenzimi coinvolti in percorsi biosintetici e di immagazzinamento
di energia sono ribonucleotidi (ATP, NAD+, FAD, CoA)
- molecole di RNA hanno attivit enzimatiche: ribozimi
(es: catalisi della formazione del legame peptidico nei ribosomi)
- nei virus a RNA (a singola o doppia catena) linformazione genetica
codificata dalRNA
Ipotesi:
in tempi pre-cellulari, gli RNA erano i catalizzatori biologici originali
mondo ad RNA

Il mondo ad RNA
Domande:
1) perch durante levoluzione i catalizzatori proteici hanno sostituito i
ribozimi?
2) perch il DNA ha sostituito lRNA per la codifica
dellinformazione genetica?
Risposte:
1) i 20 aa contengono una variet di gruppi
funzionali (ossidrilici, sulfidrilici, ammidici,
carbossilici) non presenti nel RNA
2) il DNA pi stabile del RNA perch lRNA
pi suscettibile allidrolisi catalizzata da
una base (il DNA non possiede il gruppo
2-OH)

Traduzione e sintesi delle proteine


- la sintesi proteica non diretta immediatamente dal DNA perch, almeno negli
eucarioti, DNA e ribosomi non sono mai in contatto
- RNA lintermediario fra DNA ed il sistema di sintesi delle proteine
- 3 tipi principali di RNA
rRNA: RNA ribosomiale (2/3 della massa ribosomiale)
tRNA: RNA di trasferimento (piccole molecole compatte che portano gli aa ai
ribosomi per la sintesi proteica)
mRNA: RNA messaggero (la cui sequenza nucleotidica dirige la sintesi
proteica)
- altre specie di piccoli RNA coinvolti nella regolazione dellespressione genica
e processamento dei trascritti di RNA
- tutti gli RNA sono trascritti da stampi di DNA
- la trascrizione del DNA in RNA viene eseguita dalle RNA polimerasi (RNAPs)

Traduzione e sintesi delle proteine


- un mRNA non riconosce direttamente un aa, ma lega in modo assolutamente
specifico molecole di tRNA che trasportano uno specifico aa
- il tRNA contiene una sequenza di 3 nucleotidi detta anticodone
complementare ai codoni del mRNA
- durante la traduzione gli aa trasportati dal tRNA si uniscono tra loro nellordine
con cui gli anticodoni del tRNA si legano ai codoni del mRNA sul ribosoma

tRNA
- molecole adattatrici che trasportano aa legati da reazioni enzimatiche specifiche
- molecole formate da 60-95 nucleotidi (18-28 kD).
La maggior parte contiene 76 nucleotidi
- struttura secondaria a trifoglio con propriet comuni
1) gruppo fosforico allestremit 5
2) stelo accettore o stelo dellamminoacido
stelo di 7 bp che comprende il nucleotide 5-terminale
laa trasportato legato al gruppo OH 3terminale
3) braccio D (insieme stelo + ansa)
stelo di 3-4 bp che termina con unansa di 5-7 basi
spesso contenente il residuo modificato diidrouridina (D)
4) braccio dellanticodone
stelo di 5 bp che termina con lansa che contiene lanticodone

Struttura terziaria del tRNA


5) braccio TC (o braccio T)
stelo di 5 bp che termina con lansa che contiene
la sequenza TC ( pseudouridina)
6) sequenza 3 CCA con il gruppo ossidrilico 3 libero
(a seconda della specie la sequenza -CCA pu
essere determinata geneticamente o aggiunta
enzimaticamente ad un tRNA immaturo)
- presenza nei tRNA di un alto numero (25%) di basi
modificate dopo la trascrizione (80 diverse modificazioni
trovate in 60 posizioni diverse del tRNA)
(a) nessuna modificazione essenziale per mantenere lintegrit strutturale dei
tRNA e per il legame coi ribosomi
(b) le basi modificate possono partecipare al legame dellaa con lo stelo
accettore e rinforzare le interazioni codone-anticodone

Struttura terziaria del tRNA


Le molecole di tRNA hanno forma a L in cui lo stelo accettore e lo stelo T
formano un braccio della lettera e lo stelo D e dellanticodone laltro braccio
- i bracci sono entrambi lunghi ~60
- lanticodone ed il sito accettore dellaa sono
alle estremit opposte della molecola (~75)
- spessore relativamente piccolo (~20-25 )
essenziale per la funzione biologica, poich
durante la sintesi proteica 2 tRNA si legano
simultaneamente a codoni adiacenti sul mRNA
- la struttura terziaria stabilizzata da interazioni
derivanti dallesteso impilamento ed appaiamento
delle basi allinterno e tra gli steli elicoidali
- di solito le basi coinvolte nelle interazioni
trasversali sono invarianti (no W&C)
tutti gli tRNA hanno struttura simile

Amminoacilazione del tRNA


amminoacil-tRNA sintetasi (aaRS)
legame di uno specifico aa allossidrile 3 terminale
del ribosio del tRNA formando un amminoacil-tRNA
2 reazioni:
a) attivazione dellamminoacido mediante una reazione
con ATP a formare un amminoacil-adenilato
(amminoacil-AMP)
b) lamminoacil-AMP reagisce con tRNA per formare lamminoacil-tRNA
amminoacil-AMP + tRNA
amminoacil-tRNA + AMP
Reazione completa:
amminoacido + ATP + tRNA amminoacil-tRNA + AMP + PPi
portata a compimento dallidrolisi di PPi generato nella prima fase della reazione

Ribosomi
- piccoli organelli sito della sintesi proteica
- grandi dimensioni (~2.5 106 D nei batteri e 3.9-4.5 106 D negli eucarioti)
- grande complessit (dozzine di proteine differenti e parecchie grandi molecole
di RNA)

Ribosomi
funzioni vitali del ribosoma:
1) lega lmRNA in modo che i suoi codoni siano letti con alta fedelt
2) contiene siti di legame specifici per le molecole di tRNA (lamminoacil-tRNA
entrante, il peptidil-tRNA che ha legato a s la catena proteica nascente, il
tRNA che ha donato il suo gruppo amminoacilico)
3) favorisce le interazioni fra fattori proteici non-ribosomiali necessari per iniziare
la catena polipeptidica, per allungarla e per terminarla
4) catalizza la formazione del legame peptidico fra il peptidil-tRNA e
lamminoacil-tRNA entrante
5) in grado di traslocare lmRNA ed il peptidil-tRNA con la catena nascente in
modo da leggere in modo sequenziale i codoni

Struttura del Ribosoma nei procarioti


- componenti ribosomiali descritti in termini della loro velocit di sedimentazione
(in Svedbergs) in ultracentrifuga (che correla ~ con le loro dimensioni)
- il ribosoma di E.coli intatto ha coefficiente di sedimentazione 70S e pu essere
dissociato in 2 subunit diverse fra loro :
1) subunit pi piccola, 30S: una molecola di rRNA 16S e 21 proteine diverse
2) subunit pi grande, 50S: 2 molecole di rRNA (5S e 23S) e 31 proteine
diverse
- convenzione: le proteine della subunit pi piccola indicate con S, quelle della
subunit pi grande L, seguite da un numero (che ~ aumenta
dalla pi grande alla pi piccola)
- proteine di 46-557 aa, tutte in copia singola tranne L12 (4 copie), con poche
omologie di sequenza, ma alto numero di residui basici e pochi residui aromatici
- i circa 20000 ribosomi in una cellula di E.coli rappresentano ~80% del suo RNA
totale ed il 10% delle proteine

Struttura del Ribosoma nei procarioti


numero delle proteine identifica la loro posizione in una gel elettroforesi
bidimensionale a partire dallalto a sinistra per arrivare in basso a destra

Struttura del Ribosoma

ribosoma

Struttura del Ribosoma nei procarioti


Struttura secondaria
16S rRNA (1542 nucleotidi)
- formato da 4 domini con 54% delle basi appaiate
- steli a doppia elica corti (<8 bp) e molti imperfetti
5S rRNA (120 nucleotidi) 2/3 delle basi sono accoppiate
23S rRNA (2904 nucleotidi) formato da 6 domini estesa struttura secondaria

Struttura del Ribosoma nei procarioti


Struttura tridimensionale
- prime strutture a bassa risoluzione con tecniche
di microscopia elettronica e crioelettronica (cryo-EM)
- struttura cristallografica (2.4 ) della subunit 50S del
batterio alofilico Haloarcula marismortui (~106 atomi)
- struttura cristallografica (~3.0 ) della subunit 30S del
batterio T. thermophilus
- struttura cristallografica dellintero ribosoma 70S di
T. thermophilus ed E.coli
struttura caratterizzata da numerosi lobi e rigonfiamenti
ed attraversata da canali e tunnel
struttura prevalentemente determinata dalla componente
ad RNA e non da quella proteica

Struttura del Ribosoma nei procarioti


1) subunit 16S e 23S formate da elementi elicali connessi da loops
(spesso estensioni irregolari di eliche)
Strutture stabilizzate da interazioni tra eliche:
- impaccamento scanalatura minore - scanalatura minore
- inserimento di gruppi fosfato nella scanalatura minore
- inserimento di adenine conservate nelle scanalature minori
2) 16S: 4 domini distinti
i domini della subunit 30S si possono
23S: 6 domini interconnessi
muovere uno rispetto allaltro, mentre la
subunit 50S appare rigida

Struttura del Ribosoma nei procarioti


3) la distribuzione delle proteine nelle 2 subunit non uniforme
- la maggior parte delle proteine sono presenti nella faccia posteriore o ai lati
- le zone allinterfaccia di entrambe le subunit sono povere di proteine,
specialmente le regioni che legano lmRNA ed i tRNA
4) molte proteine consistono di un dominio globulare e di una coda
- se presente, il dominio globulare localizzato sulla superficie della subunit
- la coda priva di struttura secondaria, ricca di residui basici e si inserisce tra
le eliche di RNA infiltrandosi allinterno della subunit

Struttura del Ribosoma nei procarioti


- interazioni mediante ponti salini tra catene laterali code proteiche (+) ed atomi
di ossigeno dei gruppi fosfati dellRNA (-)
neutralizzazione delle interazioni repulsive carica-carica fra segmenti di RNA
vicini
- sequenze delle code proteiche meglio conservate rispetto ai domini globulari
ipotesi di un ribosoma primordiale interamente ad RNA. Le proteine
eventualmente acquisite per stabilizzare la sua struttura e modulare la sua
funzione

Struttura del Ribosoma nei procarioti


- nella struttura del ribosoma completo le subunit 30S e 50S mantengono la
stessa struttura che hanno quando isolate
- 12 posizioni di contatto (RNA-RNA, proteina-proteina, RNA-proteina) fra le 2
subunit (molte interazioni mediate da ioni Mg2+)
- alcune interazioni di contatto devono essere rotte e riformate per permettere al
ribosoma di funzionare
il ribosoma ha 3 siti di legame distinti per il tRNA
sito A: sito dellamminoacile che ospita lamminoacil-tRNA entrante
sito P: sito del peptidile che ospita il peptidil-tRNA a cui la catena polipeptidica
attaccata
sito E: sito di uscita che ospita il tRNA deacilato che deve uscire dal ribosoma

Struttura del Ribosoma nei procarioti


i 3 tRNA si legano al ribosoma tutti nello stesso modo:
- la subunit 30S lega le parti contenenti lanticodone
- la subunit 50S lega la porzione rimanente
- le interazioni consistono primariamente di contatti RNA-RNA e coinvolgono
i segmenti di tRNA universalmente conservati il ribosoma lega allo stesso
modo diverse specie di tRNA
50S

30S
P

grigio: RNA
magenta: segmenti di RNA che
partecipano a contatti intersubunit
blu: proteine
giallo: segmenti di proteina che
partecipano a contatti intersubunit

A
A

P E

Struttura del Ribosoma nei procarioti


- i 3 tRNA legati hanno struttura leggermente diversa col
tRNA nel sito A simile al tRNAPhe ed il tRNA nel sito E
distorto
- la catena polipeptidica nascente occupa un tunnel nella
subunit 50S che si estende dal sito P alla
superficie (100 , ~ 15 di diametro) formato da
residui prevalentemente idrofobici
largo a malapena per contenere una
-elica. E poco probabile che il folding
avvenga prima che la catena aa esca dal
ribosoma

Traduzione e sintesi delle proteine


Traduzione (punti fondamentali)
1) la sintesi della catena polipeptidica procede dal N-terminale al C-terminale
lattivit peptidil transferasica appende un aa al C-terminale della catena in
crescita
2) lelongazione della catena polipeptidica avviene legando lultimo residuo della
catena crescente legato al tRNA presente nel sito P allaa legato al tRNA
presente nel sito A
la catena nascente viene quindi trasferita
sul sito A lasciando nel sito P un tRNA
scarico
traslocazione della catena nascente
al sito P e del tRNA scarico al sito E
dove poi si dissocia dal ribosoma

Traduzione e sintesi delle proteine


Traduzione (punti fondamentali)
3) i ribosomi leggono lmRNA nella direzione 53
poich lmRNA viene anchesso sintetizzato nella direzione 53
nei procarioti i ribosomi possono iniziare la traduzione appena lmRNA in
fase di sintesi emerge dalla RNA polimerasi
negli eucarioti ci non accade perch la membrana nucleare separa il sito di
trascrizione (nucleo) dal sito di traduzione (citosol)
4) la traduzione avviene su poliribosomi (o polisomi)
nei procarioti ed eucarioti pi di un ribosoma si lega ad una singola catena di
mRNA (singoli ribosomi separati da intervalli di 50-150 )
una volta che un ribosoma attivo ha
lasciato libero il sito di inizio di della
traduzione, un secondo ribosoma pu
accedere a quel sito e iniziare la sintesi

0.1 m

Struttura del Ribosoma negli eucarioti


- struttura e funzione simile a quella dei procarioti
- differenza in molti dettagli
a) massa 3.9-4.5 106 D (vs 2.5 106 D nei procarioti) e coefficiente di
sedimentazione 80S
b) 2 subunit diverse:
40S (leggera, 33 polipeptidi unici e 18S rRNA)
60S (pesante, 49 polipepdtidi diversi e 3 rRNA, 28S, 5.8S e 5S)
- rRNA eucariotici 18S e 28S simili in struttura secondaria ai procariotici 16S e
23S (le sequenze nucleotidiche sono meno conservate)
- rRNA 5.8S presente nella subunit pesante forma un complesso per
appaiamento di basi con lrRNA 28S
- rRNA 5.8S ha sequenza omologa allestremit 5 dellrRNA 23S dei procarioti
derivazioni da mutazioni che hanno alterato il processo di mutazioni
posttrascrizionali dellrRNA 23S portando alla formazione di un 4 rRNA

Struttura del Ribosoma negli eucarioti


- differenze rispetto ai procarioti associate alle
parti aggiuntive, ma anche le parti comuni
possono avere strutture leggermente diverse
- 16 interazioni intersubunit, 12 delle quali
corrispondono alle 12 trovate negli procarioti
importante conservazione evolutiva

Complessit addizionale probabilmente dovuta al fatto di

ribosoma di lievito: crio-EM,


risoluzione di 15

- dover passare dal nucleo (dove si forma) al citoplasma (dove avviene la


traduzione)
- ha un meccanismo di inizio della traduzione pi complesso
- il macchinario con cui partecipa al percorso secretorio pi complicato

Autocostruzione subunit ribosomiali


- le prime tappe nella costruzione delle subunit ribosomiali sono indipendenti
dal legame di alcune proteine allrRNA 16S
il complesso che si genera costituisce la struttura portante a cui si associano
le altre proteine
- similmente per la subunit pesante
- lautocostruzione in vivo dei ribosomi richiede la presenza di rRNA e proteina in
quantit appropriate espressione coordinata di rRNA e proteine
- nelle cellule eucariotiche richiesto anche il trasporto nel nucleo delle proteine
ribosomiali prodotte nel citosol
- le cellule regolano la concentrazione dei ribosomi sulla base della velocit a cui
devono sintetizzare le loro proteine nelle condizioni di crescita
- in E.coli meccanismo di risposta stringente

Autocostruzione subunit ribosomiali


- in E.coli meccanismo di regolazione mediante risposta stringente
meccanismo che agisce quando uno qualsiasi dei tRNA carichi viene a limitare la
velocit di sintesi proteica (che determina una condizione di crescita rallentata o
stringente)
- un ribosoma lega un tRNA scarico
segnala la carenza dellaa stimolando la proteina fattore stringente a
catalizzare la sintesi del nucleotide (insolito) ppGpp
AMP + ppGpp
ATP + GDP
ppGpp agisce come messaggero cellulare
- riduce di 10-20 volte la velocit di trascrizione dei geni per gli rRNA e tRNA
- stimola la trascrizione dei geni coinvolti nella biosintesi degli aa
- reprime la trascrizione dei geni coinvolti nella replicazione del DNA e biosintesi
dei carboidrati
ppGpp potrebbe agire alterando la specificit del promotore della RNA polimerasi
(essendo ppGpp capace di attivare o reprimere la trascrizione genica)