FACULTAD DE CIENCIAS

ACTIVIDAD PRÁCTICA
N°4
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y CURVA DE
PROGRESO

Integrantes: Javier Flores Plaza
Nicolás Fuentes Ugarte
Carrera: Ing. En biotecnología molecular
Profesores: Victoria Guixé
Ana Peller
Fecha: Jueves 02 de Octubre de 2014

pero a la vez se pueden usar sustratos artificiales como él o-nitrofenil-β-galactósido que es hidrolizado por la β-galactosidasa en onitrofenol que es un compuesto cromogénico que absorbe a 420nm. analizando términos como unidad de enzima. por lo cual será utilizado el ONFG dado a que la reacción produce ONF.0) (3. Definir medio de incubación o las condiciones experimentales para ensayar un sistema enzimático. un compuesto que cumple con las características mencionadas anteriormente. para lo cual se hará uso de la curva de calibración obtenida del primer practico. velocidad y actividad enzimática. Objetivos    Determinación de la actividad enzimática de la β-galactosidasa. Por lo cual en esta actividad practica utilizaremos este sustrato artificial para el estudio de la actividad de la enzima en cuestión.Introducción La β-galactosidasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de compuestos galactósidos en monosacáridos. Para dicho análisis mencionado anteriormente es fundamental tener un compuesto que sea de fácil identificación y cuya concentración pueda ser determinada.0) (2. además de realizar una curva de progreso para la reacción de dicha enzima y su sustrato artificial.0) . en las condiciones de incubación que serán descritas posteriormente. Estudiar la velocidad de la hidrólisis enzimática del o-nitrofenil-β-galactósido en función del tiempo de incubación (curva de progreso) Ecuaciones a utilizar (1. siendo identificado por la coloración que presenta y además podemos medir su concentración a través de un espectrofotómetro el cual mide absorbancia la cual está relacionada con la concentración.

15 - Carbonato (mL) 0.0mL se procedió a medir absorbancia Tabla I: Componentes del medio enzimático Tubo A Blanco enzima Blanco sustrato Enzima (mL) 0.1M 0. A la vez se realizaron dos blancos. se incubo el sistema a temperatura ambiente y se agrego el sustrato para iniciar la reacción. tras lo cual al transcurrir 11minutos se agregó carbonato para detener la reacción y posteriormente agua hasta completar 3.01M 0.1 Se asigno un volumen de incubación de 1.β-galactósido (ONFG) o-nitrofenol (ONF) Carbonato de sodio β -galactosidasa Gradilla Tubos de ensayo Agua Cronometro Espectrofotómetro 0.3 0.45 0.2 o-nitrofenil.15 0.0mL.Materiales y métodos Materiales [1] Experimentos 1.05 ONFG (mL) 0.45 Agua (mL) totales 1.9 2. Tras detener la reacción y completar el volumen de 3.3 .2           Amortiguador fosfato de sodio pH 7.2 0.0M Métodos Se procedió de la forma indicada en la guía de trabajos prácticos y el protocolo adjuntado Resultados brutos Protocolo Experimento 1.5mM 1.2 Buffer (mL) 0.1 2.1 y 1.45 0.5mL donde se agregaron los componentes del medio enzimático. un blanco enzima y un blanco sustrato.3 0.

9 ONFG (mL) 0.008 0.15 0. los cuales tuvieron diferentes tiempos de incubación según lo indicado en la tabla II.45 0.9 1.3 0.384 0.1 pero esta vez se realizaron seis tubos.15 0.616 .2 0.1 Tras realizar lo indicado en el protocolo se midió la absorbancia a 420nm de los tubos colectados.9 1.15 0.3 0.3 0. Tabla II: Protocolo experimento 1.15 0.45 0.45 0.15 0.2 0.837 1.3 0. Tabla IV: Resultados experimentales del experimento 1.612 0.3 0.Experimento 1.197 0.2 Realizado lo indicado en el protocolo.9 1.9 1.2 Tubo 1 2 3 4 5 6 Tiempo de incubación (min) 0 5 15 30 40 60 Absorbancia a 420nm 0.45 Agua (mL) totales 1.2 Buffer (mL) 0.2 0.2 Se procedió de igual forma que en el experimento 1.022 0.9 1.3 Tiempo (min) 0 5 15 30 40 60 *La temperatura de incubación fue de 16°C Resultados Experimento 1.45 0.2 Tubo 1 2 3 4 5 6 Enzima (mL) 0. se obtuvieron las siguientes absorbancias para los diversos tiempos de incubación. obteniéndose los resultados ilustrados en la tabla III Tabla III: Resultados experimentales del experimento 1.032 1.2 0.2 0.15 Carbonato (mL) 0.004 Experimento 1.1 Tubo A Blanco enzima Blanco sustrato Absorbancia a 420nm 0.45 0.

a una temperatura de incubación de 16°C.1M. en un tiempo de incubación de 11minutos.622 0.175 3 15 0.021 0.0) es de 0.020 0.0) nos indica una concentración de 0. lo cual nos indica que en los 3mL tenemos 0. Las condiciones del medio fueron: ONF 0.096 0.0) nos indica que en el medio de incubación tenemos 0. Experimento 1. Dado a que en el medio de incubación tenemos 0. buffer fosfato pH 7.2 15mM y carbonato de sodio 0. se obtiene una nueva absorbancia de 0.104 0.771 1.Análisis de resultados Experimento 1.134 0.150mM.134 0.027 0.010 6 60 1.150 µmoles/mL.590 y utilizando la curva de calibración del practico 1 donde se tiene un coeficiente de extinción para el ONF igual a 3.0409 unidades de enzima o 0. .450 µmoles de ONF.216 Unidades de Actividad enzima (U) (U/ml) 0 0 0.0mL. en un volumen final de 3.594 a µmoles de ONF 0 0.019 0. Y con lo cual si aplicamos (2.2 Tubo Tiempo de Absorbancia incubación (min) 420nm 1 0 0 2 5 0.092 0.2 Descontando el blanco enzima a las absorbancias obtenidas en la tabla IV y si además utilizamos (1.0409 unidades de enzima.362 4 30 0.1 Tras descontar la absorbancia del blanco enzima a la obtenida en el tubo A.815 5 40 1.101 Con los µmoles de ONF y el tiempo de incubación podemos confeccionar una grafica que relacione los µmoles de ONF producidos en función del tiempo.276 0.205 U/mL de proteína.0409 µmoles/min.018 0. y con dichos datos podemos confeccionar la tabla V Tabla V: Análisis de datos experimento 1. esto nos indica que la actividad de la β –galactosidasa aplicando (3.0) para obtener las concentraciones de ONF.9325 y aplicando (1.

020 0.010 Velocidades iniciales 0. Velocidad µmoles/min Velocidades iniciales 0.Grafica 1: µmoles de ONF respecto el tiempo.000 0 10 20 30 40 Tiempo (min) 50 60 70 . entonces podemos graficar la evolución de la velocidad en función del tiempo.025 0. lo que queda ilustrado en la grafica 2 : Grafica 2: Evolución de la velocidad de reacción con el tiempo.015 0. Dado a que unidad de enzima también significa velocidad (µmoles/min).005 0.030 0.

además en este tipo de grafico se espera que la velocidad disminuya paulatinamente hasta estar próxima a cero en el intervalo donde se está por alcanzar el equilibrio. Analizando el gráfico Velocidad v/s Tiempo. salvo algunos puntos que están por debajo o sobre lo esperado. en donde la velocidad de formación de es igual a la de la reacción inversa. lo que puede provocar un error en los resultados. Pero porque no se llego a este punto en este medio de reacción.2 Si analizamos la Curva de Progreso. además que las reacciones se realizaron en un tiempo determinado. con eso se obtienen las unidades de enzima. Pero hay que considerar que en la medición de absorbancia tanto para el blanco sustrato. o que los componentes de la reacción generen un absorbancia similar a la analizada. ya que pudo ocurrir que el carbonato de sodio. por lo cual a dicha temperatura debe transcurrir un mayor tiempo para que se alcance el equilibrio. uno de los motivos puede ser una mala práctica de las técnicas de laboratorio y un mal uso de los reactivos entregados. lo que nos puede indicar que sin la enzima puede existir producción de producto.Discusión Experimento 1. La adición del Carbonato de sodio. se puede ver una relación lineal proporcionalmente directa entre la cantidad de producto y el tiempo. agregando a eso que se conoce la cantidad (volumen en este caso) de enzima. vale decir el gráfico de Cantidad de Producto v/s Tiempo. . Experimento 1. podemos apreciar que de tiempo cero a 5 minutos hay una gran variación en la velocidad tendencia que sigue hasta los 15-20 min. tras lo cual baja y se estabiliza. siendo mencionadas la posibles causas en el párrafo anterior. también se calcula la actividad enzimática. Además en este tipo de grafico se observa una tendencia lineal entre la cantidad de producto y el tiempo. lo cual pudo producir una mayor formación de cantidad de producto que el esperado. no fueron cero. además otro factor es que en las condiciones de incubación especialmente la temperatura es una variable que influye en el equilibrio químico. pero se observa una tendencia lineal. cosa que no se pudo apreciar en este caso.1 Al tener los resultados de absorbancia al reaccionar la enzima con el ONFG y este resultado extrapolarlo con el gráfico de calibración del práctico n° 1. como para el blanco enzima. es posible obtener la concentración de ONF. también puede haber aumentado el margen de error de nuestros cálculos. no detuvo la reacción en el tiempo que se estimó debería realizarlo. hasta llegar a un tiempo donde la cantidad de producto se mantiene constante indicando que la reacción en cuestión llego al equilibrio químico.

interfieren con el método para medir el sustrato o los productos. y medir las velocidades de formación del producto. ¿Cómo podría comprobar que una reacción química determinada es una reacción enzimática? Para poder comprobar que una reacción química determinada es una reacción enzimática se puede hacer un grupo de control. Tiempo cero: Este control es utilizado para detectar cualquier interferencia debida a cualquiera de los componentes. y es útil para la cuantificación de la actividad enzimática . y así determinar si es una reacción química o enzimática Otra alternativa sería alterar el medio de reacción. y por consiguiente indicar que se trata de una reacción enzimática. al alcalinizar el medio denatura a la Galactosidasa 2. Blanco de enzima: Para poder determinar si el sustrato es inestable y da producto en ausencia de enzima. detiene la reacción.Cuestionario Experimento 1. variando la temperatura o el pH. luego si ocurre una disminución considerable en la velocidad de reacción podría indicar la presencia de una enzima es fundamental para la velocidad de reacción. inactivando a las enzimas. ¿Qué función cumple el carbonato de sodio en el sistema de ensayo de la -galactosidasa? El Carbonato de Sodio. 3.1: Determinación de la actividad enzimática de la -galactosidasa 1. con excepción del sustrato. Conociendo sus velocidades podemos determinar si se demora más en un sistema biológico que en el laboratorio. Si desea determinar la actividad enzimática cualquiera en un extracto de tejido: a) ¿Qué controles haría? b) ¿Qué consideración debe tener en cuenta para fijar el tiempo de incubación? a) Los controles que utilizados serian:    Blanco de sustrato: Para poder determinar si los componentes del sistema.

2. la saturación provoca la pérdida de la proporcionalidad. y en el caso de que la concentración de sustrato es pequeña. el intervalo de tiempo durante el cual se mide la velocidad inicial es menor. porque la concentración de sustrato es menor. esto es porque mientras no ha ocurrido la saturación de la enzima por el sustrato.2: Estudio de la velocidad de hidrólisis enzimática del onitrofenil-β-galactósido en función del tiempo de incubación (curva de progreso). ¿Cómo afectan la forma de una curva de progreso: la concentración de sustrato. la concentración de enzima? La concentración de sustrato. es decir con una concentración de sustrato mayor tendremos una pendiente mayor. y la velocidad máxima también será mayor. ya que sólo en este intervalo la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de enzima. 1. es por esto que el sustrato deben estar en exceso. que es el intervalo en donde la concentración de producto aumenta linealmente con el tiempo. la actividad es proporcional al tiempo de incubación.b) Para fijar el tiempo de incubación para determinar una actividad enzimática se debe considerar que en ese intervalo de tiempo se consuma una cantidad mensurable de sustrato. Por lo tanto si tengo la misma concentración de sustrato y coloco el doble de enzima. pero no se debe confundir la situación en que se alcanza la saturación con la situación en que se ha agotado el sustrato. se espera que la velocidad inicial sea menor y por lo tanto la pendiente será menor y llegará antes al equilibrio. variará la pendiente. afecta a la pendiente de la curva de progreso. aunque la velocidad máxima será la misma. Experimento 1. Siempre se debe garantizar que exista un exceso de sustrato en la solución. Una reacción enzimática se detiene espontáneamente después de transcurrido un cierto tiempo: a) ¿Qué explicación podría dar para este fenómeno? b) ¿Cómo podría comprobar experimentalmente su hipótesis? . En el caso de una variación en la concentración de enzima. va a llegar en un menor tiempo al equilibrio y la pendiente va a ser mayor y si tengo la misma concentración de enzima con dos concentraciones distintas de sustrato.

un gráfico de absorbancia en función de la concentración de ONF.19 . Concluyendo el método efectuado para estudiar la reacción enzimática de la  -galactosidasa fue efectiva. Guía de Trabajos Prácticos y de Ejercicios. b) Para comprobar experimentalmente esta hipótesis. Curso de Bioquímica. 2014. realizado en el primer practico. la cual tiene una tendencia lineal de formación de producto en función del tiempo total de incubación. la cual nos permitió determinar la concentración de o-nitrofenol. Universidad de Chile. 16 . ya que sólo en este intervalo la velocidad es proporcional a la concentración de enzima. pero no se pudo apreciar una dependencia hiperbólica con la concentración de sustrato y la velocidad. lo que debería restablecer el equilibrio en el caso de que la enzima no estuviera inactiva. Conclusiones      A partir de la curva de calibración. Analizando nuestra curva de progreso. indica el intervalo de tiempo en el cuál se puede medir la reacción que es sólo el intervalo de tiempo en que la concentración de un sistema enzimático. siendo este el intervalo de relación lineal. dado a que pendiente de esta curva al inicio de la reacción también indica la velocidad inicial de la reacción.a) Que la reacción enzimática se detenga espontáneamente puede deberse a que la reacción alcanzó su equilibrio. la cual permitió calcular los moles y determinar la actividad enzimática de la β-galactosidasa.. ya que obtuvimos resultados dentro de un intervalo posible. pudimos ver un aumento de producto a medida que avanza el tiempo. Peller A. posteriormente la reacción llegará al equilibrio. La Curva de Progreso. Facultad de Ciencias. pudimos obtener una ecuación de la recta. Bibliografía [1] Guixé V. lo que significa que la concentración de sustrato variará muy poco. un estado en donde la velocidad de formación de productos se iguala a la formación de sustrato. Además la Curva de progreso también nos permite calcular la velocidad de la reacción. Págs. podemos agregar más sustrato a la reacción. posteriormente ocurre una saturación de la enzima. pero no se alcanzo a apreciar el comportamiento hiperbólico que dicta la ecuación Michaelis-Menten..