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Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA

MANUAL DE MICROBIOLOGIA
CLNICA PARA O CONTROLE
DE INFECO RELACIONADA
ASSISTNCIA SADE
Mdulo 5: Tecnologia em Servios de
Sade: descrio dos meios de cultura
empregados nos exames microbiolgicos

Copyright 2012 Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria.


Todos os direitos reservados. permitida a reproduo parcial ou total dessa obra, desde que citada a fonte e que no seja para venda
ou qualquer fim comercial.
A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra da rea tcnica.
A Anvisa, igualmente, no se responsabiliza pelas idias contidas nessa publicao.
1 edio 2010
Elaborao, distribuio e informaes:
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA
SIA Trecho 5, rea Especial 57
CEP: 71205-050 Braslia DF
Tel.: (61) 3462-6000
Home page: www.anvisa.gov.br
Diretoria
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Jos Agenor lvares da Silva

Redao:
Julia Taeko Utiyama Yoshida Instituto Adolfo Lutz (IAL) -SP.
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Rosngela Aparecida Mendes Silva Centro Infantil Boldrini-SP

Adjuntos de Diretor
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Reviso tcnica Anvisa:


Andr Anderson Carvalho
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Magda Machado de Miranda
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Gerncia Geral de Tecnologia em Servios de Sade GGTES


Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira
Gerncia de Vigilncia e Monitoramento em Servios de Sade GVIMS
Magda Machado de Miranda

Projeto Grfico e Diagramao


All Type Assessoria Editorial Ltda

Coordenao Tcnica:
Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa
Carlos Emlio Levy Universidade de Campinas-SP

Ficha Catalogrfica
Brasil. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
Manual de Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia Sade. Mdulo
5 :Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos/Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2013.
99p..: il.9 volumes
ISBN
1. Infeco Hospitalar Controle. 2. Infeco em Servios de Sade. 3. Microbiologia Clnica. 4. Vigilncia
Sanitria em Servios de Sade. 5. Resistncia microbiana. I. Ttulo.

Sumrio
Apresentao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Introduo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.1 Procedimentos gerais para preparao e distribuio de meios de cultura. . . . . . . . . . . 8
1.2 Controle de qualidade de esterilidade e crescimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3 Recomendaes gerais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1 Cary Blair . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.2 Salina tamponada. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.3 Meio Stuart. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.4 gar nutriente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1 gar chocolate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2 gar Thayer-Martin chocolate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.3 gar Salmonella-shigella (SS). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4 Caldo selenito com novobiocina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.5 Caldo tetrationato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.6 Meio de Tioglicolato com indicador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.7 Meio de Tioglicolato sem indicador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.8 gar Mac Conkey . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.9 gar sangue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.10 gar Cled Cystine Lactose Electrolyte Deficient. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.11 Caldo BHI Brain Heart Infusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.12 Lwenstein Jensen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.13 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.14 gar Mycosel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.15 gar Sabouraud Dextrose. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.1 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2 gar Citrato Simmons. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3 gar Bile-Esculina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.4 gar Sangue CAMP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.5 Caldo Base de Moeller. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.6 gar Dnase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.7 gar Esculina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.8 gar Fenilalanina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.9
3.10
3.11
3.12
3.13
3.14

CTA Cystine Tryticase gar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56


Caldo Triptona e SIM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Caldo Malonato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
Caldo Nitrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Meio Base Para Oxidao e Fermentao OF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
M.E.V.A.G. (Milieu pour ltude de la voie dattaque ds glucides - Hugh & Leifson,
1953). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.15 gar TSI Triplo Acar Ferro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.16 gar Base Uria (Christensen). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.1 Prova de catalase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2 Prova de coagulase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.3 Prova de gelatinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4 Prova de Lecitinase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.5 Prova de oxidase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.6 Fermentao de carboidratos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.7 Prova PYR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.8 Crescimento a 42 E 44C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.9 Teste de motilidade. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.10 Prova de tolerncia ao NaCl 6,5% . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Captulo 5: Discos para Identificao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.1 Bacitracina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.2 Novobiocina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5.3 Optoquina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
Referncias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Apresentao
A resistncia microbiana um grave problema mundial, estando associada ao aumento do
tempo de internao, dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos
pacientes. O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no ambiente hospitalar reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a
disseminao da resistncia microbiana.
Nesse contexto, insere-se o Laboratrio de Microbiologia, que tem como objetivo no apenas apontar o responsvel por um determinado estado infeccioso, mas tambm indicar,
atravs do monitoramento de populaes microbianas, qual o perfil dos micro-organismos
que esto interagindo com o organismo humano, possibilitando a indicao de tratamentos mais adequados. Para o desempenho satisfatrio dessa funo, fundamental que os
laboratrios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informaes sobre
a melhor amostra biolgica, reconhecer a microbiota e os contaminantes, identificar micro-organismos associados infeco ou com propsitos epidemiolgicos, obter resultados
rpidos em casos de emergncia, realizar o transporte rpido das amostras e manter uma
educao contnua em relao aos aspectos da infeco relacionada assistncia sade.
Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia um campo muito dinmico, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Anvisa, em cooperao com a Organizao Pan-Americana da Sade OPAS, prope a terceira reviso do Manual de Procedimentos
Bsicos em Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco Relacionada Assistncia
Sade, buscando atualizar informaes nos temas considerados essenciais e contando com
um seleto e conceituado corpo editorial. O manual composto por nove mdulos, a saber:
Mdulo 1 Biossegurana e manuteno de equipamentos em laboratrio de microbiologia clnica; Mdulo 2 Controle externo da qualidade; Mdulo 3 Principais Sndromes Infecciosas; Mdulo 4 Procedimentos laboratoriais: da requisio do exame anlise microbiolgica e laudo final; Mdulo 5 Tecnologias em Servios de Sade: descrio dos meios
de cultura empregados nos exames microbiolgicos; Mdulo 6 Deteco e identificao
de bactrias de importncia mdica; Mdulo 7 Deteco e identificao de micobactrias
de importncia mdica; Mdulo 8 Deteco e identificao de fungos de importncia mdica e Mdulo 9 Infeces virais.
A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicao contribuir para que os laboratrios de microbiologia possam assimilar e alcanar novos nveis de complexidade laboratorial, atendendo s
exigncias e caractersticas prprias de cada unidade hospitalar, alm de subsidiar a adoo
de procedimentos bsicos padronizados nesses servios.

OPAS/OMS Anvisa/MS 5

Introduo

Introduo

1.1 Procedimentos gerais para preparao e distribuio de meios de


cultura

Usar EPIs para o preparo de meios de cultura (mscaras, jaleco de manga longa e
touca).
Observar os riscos indicados nos rtulos dos frascos de meios de culturas e de
reagentes qumicos e fazer uso de EPIs especficos (mscaras, culos de proteo
e luvas).
Usar vidrarias limpas, secas e sem trincos ou defeitos. Utilizar vidraria (balo de fundo chato, Placa de Petri, tubo de ensaio, frasco, pipeta e outras Vidrarias auxiliares)
em vidro neutro temperado, termo resistente com parede uniforme e reforado.
Esterilizar a vidraria pelo processo de calor seco (forno Pasteur) 170C por 120 minutos ou 180C por 60 minutos.
Usar gua destilada, deionizada, ou produzida por osmose reversa na preparao
de meios de cultura e solues.
Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de gua at
que todo o meio fique mido e s depois deve-se acrescentar o restante da gua.
Os meios comerciais e preparados no comerciais devem ser pesados separadamente em papel manteiga e adicionados em uma vidraria adequada, hidratar em
pequena quantidade de gua at que todo o meio fique mido. Agitar firmemente
por alguns segundos at obter uma suspenso homognea. Escorrer o restante da
gua pela parede para retirar qualquer material aderente.
Ajustar o pH dos meios preparados no comerciais com soluo de HCl e NaOH
0,1N ou 1N. Nos meios contendo gar, pesar o gar separadamente e acrescentar
aps o ajuste do pH para no obstruir o eletrodo. O pH dos meios comerciais, normalmente, no precisa ser reajustado mas deve ser verificado a cada lote.
Dissolver os meios lquidos e solues com agitao e leve aquecimento (no abrir
fervura).
Aquecer os meios contendo gar at ferver com constante agitao. A parede da
vidraria deve estar lisa sem pontos de gar. Caso observe pontos, a fervura no foi
suficiente para a total dissoluo. Retornar ao fogo para finalizar o procedimento.
Sempre que for necessrio o aquecimento dos meios, usar vidro termo resistente
tipo Pyrex e aquecer sobre a tela de amianto ou similar e trip, no bico de Bunsen
ou em placa aquecedora.
Usar sempre luvas trmicas apropriadas para laboratrio para manipular vidrarias
quentes.
Normalmente, quando for usado o termo esterilizar em autoclave, o tempo
de esterilizao de 15 minutos e a temperatura de 121C. Observar as recomendaes contidas no rtulo ou manual do fabricante.
Sempre que for usado o termo esterilizar por filtrao, usar membrana composta por steres de celulose ou polmeros plsticos e com porosidade de 0,22m
de dimetro, recomendado para reter partculas bacterianas. A esterilizao por

8 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

filtrao utilizada quando o material sensvel ao calor, como alguns meios de


cultura, solues de acares, solues de antibiticos e outros.
Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos no precisam estar esterilizados.
Quando distribuir o meio aps a autoclavao, os tubos, frascos, placas, pipetas e
vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estreis.
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a esterilizao seja por igual em todo o contedo dos tubos. Tampas fechadas no permitem a entrada do vapor.

1.2 Controle de qualidade de esterilidade e crescimento

Avaliar sistematicamente os meios de culturas e solues quanto qualidade de


crescimento, seletividade, checagem de caractersticas bioqumicas diferenciais e
caractersticas fsicas.
Para todos os meios confeccionados, colocar no mnimo 10% do lote preparado na
estufa 35 1C por 24 horas para o controle de esterilidade.
No deve haver mudana de cor nem crescimento de qualquer colnia.
Para o controle de crescimento, sempre que possvel usar cepas ATCC, que so
cepas de referncias de origem e padro definido de provas para a sua caracterizao.
Usar cepas de microrganismos de referncia obtidas diretamente de uma coleo
nacional ou internacional reconhecida ou culturas comerciais com propriedades
equivalentes comprovadas para avaliao de desempenho dos meios de cultura e
de outras solues preparadas no laboratrio.
Manter instruo de manuteno e preparo de cultura de trabalho no laboratrio.
(consultar ISO 11133-1 anexo B - guia de preservao e manuteno de cultura de
referncia).
Controlar a eficcia da autoclave ou estufa, realizando semanalmente teste biolgicos para essa finalidade. Os testes biolgicos para autoclaves a vapor so os que
contm 106 Geobacillus stearothermophilus e os testes biolgicos para estufa de
calor seco contm 106 Bacillus subtilis.

1.3 Recomendaes gerais

No usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados ou
vencidos.
A validade dos meios preparados, mantidos nas condies definidas de armazenamento, deve ser determinada e controlada.
Observar com ateno para as instrues dos rtulos pois, dependendo do fabricante, podem ter o mesmo nome, mas composio diferente e portanto ser diferente a
quantidade de meio a ser usada.
OPAS/OMS Anvisa/MS 9

Introduo

Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento


rpido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente so de 10X100 mm,
16x150mm e 20x150mm). A validade citada nesse documento indicada para
meios de cultura distribudos em tubos com tampa de rosca.
As placas de Petri so de 50, 90 ou 150 mm de dimetro.
Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o
nome, data de fabricao, nmero de lote interno do laboratrio, data de validade
e tipo de armazenamento.
Todos os meios em placa devem ser embalados na posio invertida e em pacote
de filme plstico PVC transparente e de papel grau cirrgico para evitar o ressecamento.
Evitar o uso de sacos plsticos para embalar as placas, pois a gua de condensao
formada facilita a proliferao de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar
em sacos plsticos, procurando tirar o excesso de ar.

10 OPAS/OMS Anvisa/MS

Captulo 1:
Meios de Cultura para Transporte e Conservao

Rosngela Aparecida Mendes Silva


Biomdica do Laboratrio de Microbiologia,
Centro Infantil Boldrini / Campinas SP

Maria Carmen Gonalves Lopes


Biloga - Laboratrio Microbiologia, Centro
Infantil Boldrini / Campinas SP

Julia Taeko Utiyama Yoshida


Farmacutica Bioqumica Seo de Meios de
Cultura Instituto Adolfo Lutz So Paulo

Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao

1.1 Cary Blair


1.1.1

Princpio
Meio de Cary Blair foi formulado a partir do meio de Stuart, uma vez que
microrganismos patognicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem
nesse meio.
A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente a multiplicao de microrganismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles.
O que difere esse meio do meio de Stuart a adio de uma soluo salina balanceada de tampo fosfato inorgnico e a retirada da frmula o
azul de metileno.

1.1.2

Utilidade
Transporte de material fecal e consequente conservao dos microrganismos.

1.1.3

Frmula/produto
Meio comercial: Meio de transporte Cary Blair.

1.1.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Fundir completamente.
Distribuir 7 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para solidificar.
pH: 8,0 +/- 0,5 (BBL) (25C).

1.1.5

Controle de qualidade
Crescimento bom (com, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexnerii
ATCC 12022.

1.1.6

Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas.

1.1.7

Inoculao
Introduzir um swab estril de madeira nas fezes recm-coletadas.
Aps a coleta, introduzir imediatamente o swab no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique
no meio de cultura.
Fechar o tubo.

12 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios seletivos adequados.

1.1.8

Interpretao
Cor original do meio: Branco opalescente.
Como esse um meio de transporte, no h evidncia de crescimento
bacteriano.

1.1.9

Recomendaes
No deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta aps a semeadura.
No semear fezes coletadas com mais de 6 horas.

1.2 Salina tamponada


1.2.1

Princpio
Meio lquido tamponado que mantm a bactria vivel.

1.2.2

Utilidade
Meio de transporte de fezes.

1.2.3

Frmula/produto
Frmula:
NaCl 4,2 g.
Fosfato dipotssico anidro 3,1 g.
Glicerina bidestilada 300 mL.
gua destilada 700 mL.

1.2.4

Procedimentos
Distribuir 10 mL em cada tubo de 16 x 160 mm.
Esterilizar em autoclave.

1.2.5

Controle de qualidade
Shigella flexneri ATCC 12022.

1.2.6

Inoculao
Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar.
Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas.

1.2.7

Interpretao
O crescimento indicado pela turbidez do meio.

OPAS/OMS Anvisa/MS 13

Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao

1.2.8

Aps incubao semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS e/


ou MacConkey.

Conservao e validade
Conservar de 4 a 8C por at 3 meses.

1.3 Meio Stuart


1.3.1

Princpio
A carncia de uma fonte de nitrognio impede consideravelmente a multiplicao de micro-organismos e a composio nutritiva garante a sobrevivncia deles.

1.3.2

Utilidade
Transporte de diversos materiais e consequente conservao dos micro-organismos.
Conservao de micro-organismos patognicos como: Haemophilus spp.,
Streptococcus pneumoniae, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.

1.3.3

Frmula/produto
Meio comercial: Meio de transporte STUART.

1.3.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Fundir completamente.
Distribuir 7 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
Aps retirar da autoclave, manter os tubos em posio vertical para que
solidifiquem.
pH: 7,4 +/- 0,2 (25C).

1.3.5

Controle de qualidade
Crescimento bom (com, 24 e 48 horas de crescimento):
Haemophilus influenzae ATCC 10211
Shigella flexneri ATCC 12022
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Bordetella pertussis ATCC 9340

1.3.6

Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por 1 a 2 semanas.

14 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

1.3.7

Inoculao
O material biolgico deve ser coletado com auxlio de um swab estril com
haste de madeira.
Aps a coleta, introduzir imediatamente o swab no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contm o algodo fique
no meio de cultura.
Fechar o tubo.
Manter em temperatura ambiente at o momento de semear nos meios
seletivos adequados.

1.3.8

Interpretao
Cor original do meio: Branco opalescente.
Como esse um meio de transporte, no h evidncia de crescimento
bacteriano.

1.3.9

Recomendaes
No deixar o meio com a tampa aberta ou semiaberta aps a semeadura.

1.4 gar nutriente


1.4.1

Princpio
O gar Nutriente um meio relativamente simples, de fcil preparao e
barato, muito usado nos procedimentos do laboratrio de Microbiologia.

1.4.2

Utilidade
gar Nutriente tem vrias aplicaes no laboratrio de Microbiologia, e
pode ser utilizado para anlise de gua, alimentos e leite como meio para
cultivo preliminar das amostras submetidas a exames bacteriolgicos e
isolamento de organismos para culturas puras.
Uso mais frequente para a conservao e manuteno de culturas em
temperatura ambiente nesse gar, como mtodo opcional para os laboratrios que no dispem do mtodo da crio conservao (congelamento
das cepas em freezer - 70C).
Usado para observar esporulao de espcies de bacilos Gram positivos.

1.4.3

Frmula/produto
Produto comercial: Nutriente gar
Frmula:
Extrato de carne 3 g
Peptona 5 g
gar 15 g
OPAS/OMS Anvisa/MS 15

Captulo 1: Meios de Cultura para Transporte e Conservao

gua destilada 1000 mL


pH: 6,8 +/- 0,2 (25C)

1.4.4

Procedimentos
Pesar e hidratar os componentes.
Fundir.
Distribuir 3-5 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45).

1.4.5

Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente:
Escherichia coli ATCC 25922
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

1.4.6

Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.

1.4.7

Inoculao
Estriar a superfcie inclinada do meio.
Incubar.

1.4.8

Interpretao
Cor original do meio: branco opalescente.
Positivo: Crescimento na superfcie do gar.
Negativo: por ser um meio geral, no cabe fazer controle negativo.

1.4.9

Recomendaes
Por ser um meio nutritivo, a ausncia de crescimento no dever ocorrer.

16 OPAS/OMS Anvisa/MS

Captulo 2:
Meios para Crescimento e Isolamento

Rosngela Aparecida Mendes Silva


Biomdica do Laboratrio de Microbiologia,
Centro Infantil Boldrini / Campinas SP

Maria Carmen Gonalves Lopes


Biloga - Laboratrio Microbiologia, Centro
Infantil Boldrini / Campinas SP

Julia Taeko Utiyama Yoshida


Farmacutica Bioqumica Seo de Meios de
Cultura Instituto Adolfo Lutz So Paulo

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.1 gar chocolate


2.1.1

Princpio
Meio de gar Chocolate amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresam nesse meio quase todos os tipos de
microrganismos.
base do meio adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho e levado para achocolatar em banho-maria a 80-85C por 15 minutos, o que
faz com que as hemcias lisem, liberando hemina e hematina, compostos
fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes.
Observao: se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de
cavalo, resfriar a base achocolatada a aproximadamente 50C e adicionar os
suplementos base de NAD (coenzima I) e cistena.

2.1.2

Utilidade
Crescimento de microrganismos exigentes Haemophilus spp., Neisseria
spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp.

2.1.3

Frmula/produto
Meios comerciais: BHI gar *, Columbia gar Base, Blood gar Base, Mueller
Hinton gar.
Sangue de cavalo, carneiro ou coelho desfibrinado.
Recomenda-se o uso da base de BHI gar, por apresentar melhor crescimento das cepas exigentes, principalmente cepas de Haemophilus spp.

2.1.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Esfriar a base temperatura de aproximadamente 80C.
Adicionar 5-10 mL de sangue desfibrinado de cavalo para cada 100 mL
de base; Recomenda-se, conforme o microrganismo, gar BHI chocolate
10% sangue de cavalo, gar Muller Hinton chocolate 5% sangue de coelho/carneiro/cavalo e gar chocolate 5% sangue de carneiro com base de
gar comum.
Levar para achocolatar em banho-maria a 80-85C por 15 minutos. Homogeneizar constantemente at lisar totalmente as hemcias e o meio apresentar
uma cor castanho escuro (chocolate).
Distribuir aproximadamente 20mL em placas de Petri estril de 90 mm
de dimetro ou 6mL em tubo estril 16x160mm e inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de
flauta (ngulo de 45).

18 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.1.5

Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae ATCC 10211.

2.1.6

Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C por 3 meses (tubos) e 1 ms (placas).

2.1.7

Inoculao
Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento.
Incubar a 35C por 24 horas.

2.1.8

Interpretao
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).
Colnias de tamanho pequeno a mdio, com pigmento amarelo: sugestivo
de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp.
Colnias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de
Haemophilus spp.

2.1.9

Recomendaes
Lembrar que um meio rico e crescem vrios tipos de microrganismos.
Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de
Gram, para confirmar se trata ou no de Neisseria spp., Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. (cocos Gram negativos reniformes) ou Haemophilus spp. (bacilos Gram negativos delicados e pleomrficos).
No usar sangue desfibrinado vencido.
Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em
geral costuma ser abundante. Sempre que necessrio, isolar a colnia em
estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de
trabalhar com cepas misturadas.

2.2 gar Thayer-Martin chocolate


2.2.1

Princpio
um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o
isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, pois contm
em sua frmula antibiticos que inibem o crescimento de bactrias do
gnero Neisseria saprfitas e outras bactrias, quando em amostras colhidas de stios contaminados.

OPAS/OMS Anvisa/MS 19

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.2.2

Utilidade
Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigao.

2.2.3

Frmula/produto
Meio comercial: Thayer-Martin gar Base.
Sangue desfibrinado de carneiro.
Suplemento I: mistura de inibidores (antibiticos VCN ou VCNT).
Suplemento II: mistura de fatores de crescimento.

2.2.4

Procedimentos
Dissolver os suplementos liofilizados conforme instrues do fabricante
com o diluente que acompanha o suplemento e reservar.
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante (normalmente prepara-se 250mL de base para cada frasco de suplementos I e II); existe no mercado frasco de suplemento para 500mL de base.
Esterilizar a base em autoclave.
Esfriar a base a 80C.
Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 mL de base.
Levar para achocolatar em banho-maria a 80-85C por 15 minutos. Homogeneizar constantemente. Homogeneizar bem at lisar totalmente as
hemcias e o meio apresentar uma cor castanho escura (chocolate).
Deixar resfriar a base a 50C.
Adicionar assepticamente base resfriada os suplementos previamente
dissolvidos.
Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas.
Distribuir 20-25mL em placas de Petri estril de 90 mm ou 4mL em tubo
e inclinar para a superfcie ficar em forma de bico de flauta (ngulo de
45). pH: 7,2 +/- 0,2.

2.2.5

Controle de qualidade
Positivo: Neisseria gonorrhoeae 43069 e Neisseria meningitidis 13090.
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

2.2.6

Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas).

2.2.7

Inoculao
Usar a tcnica de semeadura por esgotamento.
Incubar em CO2 e umidade (jarra com vela acesa e um chumao de algodo embebido em gua).
Incubao por 48 horas.

20 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.2.8

Interpretao
Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).
Colnias pequenas com pigmento creme: sugestivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.
Fazer esfregao de todas as colnias suspeitas e corar pela tcnica de
Gram, para confirmar se trata ou no de Neisseria (diplococos Gram negativos reniformes).
Confirmando a morfologia pelo Gram, seguir identificao com testes de
oxidase e provas de fermentao.

2.2.9

Recomendaes
Antes de semear o material biolgico aquecer o meio de cultura em estufa
35C, pois temperaturas baixas podem inibir o crescimento de Neisseria.
No usar meio, suplementos e sangue vencidos.
Se no for incubado em CO2 e no houver crescimento, pode ser um resultado falso-negativo, pois bactrias do gnero Neisseria necessitam de
atmosfera com o CO2 para o crescimento.
Se no houver crescimento, incubar at 5 dias.

2.3 gar Salmonella-shigella (SS)


2.3.1

Princpio
gar SS possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio) que inibem microrganismos Gram positivos.
A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo lactose positiva (bactrias que fermentam a lactose produzem cido
que na presena do indicador vermelho neutro resultando na formao
de colnias de cor rosa), e bactrias que no fermentam a lactose formam
colnias transparentes.
Tiossulfato de sdio e o citrato frrico permitem a deteco de H2S evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro.

2.3.2

Utilidade
Selecionar e isolar espcies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e gua.

2.3.3

Frmula/produto
Meio comercial: gar SS.

2.3.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
OPAS/OMS Anvisa/MS 21

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

Aquecer o meio at fundir o gar.


No autoclavar Este meio no precisa ser esterilizado.
Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 mL em placas de Petri 90 mm estreis.
Deixar em temperatura ambiente at resfriar; pH: 7,0 +/-0,2 (25C).
Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira
de 4 a 8C.

2.3.5

Controle de qualidade
Positivo: Salmonella typhimurium ATCC 14028.
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

2.3.6

Inoculao
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas.
Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.

2.3.7

Interpretao
Cor original do meio: vermelho alaranjado.
Colnias com centro negro (HS) ou colnias incolores: suspeita de Salmonella.
Colnias incolores: suspeita de Shigella spp.
Colnias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella
spp.
As bactrias no fermentadoras de lactose so incolores.
As bactrias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.

2.3.8

Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por 1 ms.

2.3.9

Recomendaes
Ausncia de crescimento ou crescimento escasso, reincubar a placa mais
24 horas.
No autoclavar, pois a alta temperatura degrada o acar contido no meio.

2.4 Caldo selenito com novobiocina


2.4.1

Princpio
Possui propriedades que inibem coliformes e outras espcies da flora intestinal como estreptococos.

22 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.4.2

Utilidade
Utilizado para o enriquecimento e isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos.

2.4.3

Frmula/Produto
Meio comercial: Caldo Selenito.

2.4.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer at levantar fervura, homogeneizando de vez em quando.
No autoclavar.
Aguardar esfriar e adicionar 0,04 g de novobiocina por litro de meio (novobiocina inibe o vu de Proteus spp.); pH: 7,0 +/- 0,2 (25C).
Esterilizar por filtrao.
Distribuir 7 mL em tubos estreis de 15x150 mm com tampa de rosca.

2.4.5

Controle de qualidade
A) Crescimento:
Preparar uma suspenso de Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella
typhimurium ATCC 14028 na escala 0,5 de Mac Farland.
Semear 0,01 mL da de cada suspenso nos tubos de Selenito com novobiocina. Incubar os tubos a 35 1C por 24 horas e semear 0,01 mL na
placa de SS.
Incubar a placa a 35 1C por 12 a 18 horas.
Positivo: crescimento da Salmonella typhimurium.
Negativo: crescimento parcial ou no h crescimento de Escherichia coli.
Consultar: BRASIL. Ministrio da Agricultura. Portaria n 101 de 11/08/1193.
Mtodos analticos para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes e mtodos microbiolgicos. Dirio Oficial da Unio. (Anexo-6.1.3
Avaliao do desempenho de caldo seletivo com uma mistura de culturas
desejadas e no desejadas).

2.4.6

Inoculao
Inocular 3 a 4 aladas da amostra de fezes no meio de cultura.
Incubar a 351C por 12 a 18 horas.

2.4.7

Interpretao
Cor original do meio: vermelho tijolo.

OPAS/OMS Anvisa/MS 23

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.4.8

Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por 3 meses.

2.5 Caldo tetrationato


2.5.1

Princpio
Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos
Gram positivos e a adio da soluo de iodo e de verde brilhante 0,1%
inibem a flora intestinal normal de espcies fecais.

2.5.2

Utilidade
Meio de enriquecimento para Salmonella spp.

2.5.3

Frmula/produto
Meio comercial: Caldo Tetrationato.
Soluo de Iodo para tetrationato: para ser adicionado no caldo antes
de semeada a amostra de fezes.
Iodo metlico 6,0 g
Iodeto de potssio 5,0 g
gua destilada 20,0 mL

2.5.4

Procedimentos
A) Caldo tetrationato
Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante.
Aquecer at ferver.
Distribuir 10 mL em tubos estreis com tampa de rosca.
No autoclavar. Conservar de 4-8C.
B) Soluo de iodeto de potssio
Macerar o iodeto de potssio e o iodo em um gral.
Adicionar gua aos poucos at dissolver completamente.
Colocar em frasco mbar.

2.5.5

Controle de qualidade
A) Crescimento:
Preparar uma suspenso de Salmonella typhimurium ATCC 14028 e uma
cepa de Escherichia coli ATCC 25922 na escala 0,5 de Mac Farland.
Semear 0,01 mL de cada suspenso nos tubos de caldo tetrationato.
Incubar os tubos a 35 1C por 24 horas e semear 0,01 mL na placa de

24 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

SS. Se houver crescimento de Salmonella e inibio de Escherichia coli,


liberar o lote para uso.
Consultar: BRASIL. Ministrio da Agricultura. Portaria n101 de 11/08/1193. Mtodos
analticos para controle de produtos de origem animal e seus ingredientes e mtodos
microbiolgicos. Dirio Oficial da Unio. (Anexo-6.1.3 Avaliao do desempenho de
caldo seletivo com uma mistura de culturas desejadas e no desejadas).
2.5.6

Inoculao
No momento da inoculao, adicionar 0,2 mL da soluo de iodo no tubo
e 0,1 mL da soluo de verde brilhante 1% por tubo.
Inocular 1 a 3 g da amostra de fezes e homogeneizar vigorosamente.
Incubar a 35 1C por 12 a 18 horas.

2.5.7

Interpretao
Cor original do meio: lmpido com precipitado branco.
O crescimento indicado pela turbidez do meio.
Aps incubao, semear 3 a 4 aladas da amostra em uma placa de SS
e/ou Mac Conkey.

2.5.8

Conservao e validade
Tetrationato: Conservar de 4 a 8C por at 3 meses.
Soluo de iodo: Conservar em frasco mbar a temperatura ambiente
por at 12 meses.

2.6 Meio de Tioglicolato com indicador


2.6.1

Princpio
O meio de Tioglicolato d suporte para o crescimento de vrios microrganismos. O potencial de oxidao e reduo baixo do meio neutraliza
efeitos antibacterianos das espcies preservadas com mercrio.
A resazurina e o azul de metileno so indicadores da posio de oxidao
de aerbios e a dextrose includa na frmula para os microrganismos
que apresentam crescimento vigoroso na presena do carboidrato.

2.6.2

Utilidade
Usado para o cultivo de microrganismos aerbios, microaerfilos e anaerbios.
Usado para controle de esterilidade bacteriana de diversos materiais.

2.6.3

Frmula/produto
Meio comercial: Meio de Tioglicolato caldo com indicador
OPAS/OMS Anvisa/MS 25

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.6.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer em bico de Bunsen, abrir fervura devido ao gar na sua composio (0,5g/L) at dissolver completamente.
Distribuir 5 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
pH: 7,2 +/- 0,2 (25C)

2.6.5

Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente: Bacillus subtil is ATCC 6633, Streptococcus
pyogenes ATCC 19615.

2.6.6

Conservao e validade
Conservar embalado a temperatura ambiente por 3 meses.

2.6.7

Inoculao
Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at a metade do tubo.
Retirar a ala sem agitar o tubo.
Incubar 35 1C por 24 horas.

2.6.8

Interpretao
Cor original: amarelo claro.
Presena de crescimento: turvao do meio.
Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado.
Crescimento de microrganismos anaerbios: crescimento na profundidade do meio.
Crescimento de microrganismos aerbios: crescimento na superfcie do
meio.

2.6.9

Recomendaes
No usar o meio quando mais de 30% do tubo estiver com cor rosa ou
esverdeado na superfcie, pois indica a presena de oxignio no meio.
Recomenda-se o uso do meio recm-preparado, porm, se no houver a
presena de oxignio, pode-se usar um perodo maior.
No usar meios que estejam turvos.
No utilizar o meio quando o indicador atingir a metade do volume do
meio.

26 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.7 Meio de Tioglicolato sem indicador


2.7.1

Princpio
As substncias redutoras tioglicolato, cistena e sulfito de sdio produzem
uma anaerobiose suficiente para microrganismos anaerbios exigentes.

2.7.2

Utilidade
Usado para o cultivo de microrganismos anaerbios.

2.7.3

Frmula/Produto
Meio comercial: Meio de Tioglicolato caldo sem indicador.

2.7.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer em bico de Bunsen, at dissolver completamente.
Distribuir 5 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
pH: 7,2 +/- 0,2 (25C).

2.7.5

Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente: Clostridium perfringens ATCC 10543.

2.7.6

Conservao e validade
Conservar embalado a temperatura ambiente por 3 meses.

2.7.7

Inoculao
Com auxlio da ala bacteriolgica, inocular o material biolgico introduzindo a ala at o fundo do tubo.
Retirar a ala sem agitar o tubo.
Incubar 35 1C em jarra com gerador de anaerobiose durante 48 horas.

2.7.8

Interpretao
Cor original: amarelo claro.
Presena de crescimento: turvao do meio.
Ausncia de crescimento: meio permanece inalterado.

2.7.9

Recomendaes
No usar meios que estejam turvos.
Se necessrio, incubar um perodo superior 48 horas.

OPAS/OMS Anvisa/MS 27

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.8 gar Mac Conkey


2.8.1

Princpio
O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos
especialmente enterococos e estafilococos.
A concentrao de sais de bile relativamente baixa em comparao com
outros meios, por isso no to seletivo para Gram negativos como, por
exemplo, o gar SS.

2.8.2

Utilidade
Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a fermentao ou no da lactose.

2.8.3

Frmula/Produto
Meio comercial: gar MacConkey.

2.8.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao at fundir o gar completamente.
Esterilizar em autoclave.
Resfriar at 50C e distribuir 20 a 25 mL em placas de Petri 90 mm estreis.
Deixar em temperatura ambiente at resfriar.
Embalar as placas com plstico PVC transparente e guardar em geladeira
de 4 a 8C.

2.8.5

Controle de qualidade
Positivo: Proteus mirabilis ATCC 12453 (no fermentador de lactose).
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922 (fermentador de lactose).
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.

2.8.6

Inoculao
Inocular as placas e incubar por 18 a 24 horas.
Se negativo aps 24 horas, reincubar por mais 24 horas.

2.8.7

Interpretao
Cor original do meio: rosa avermelhado.
Crescimento de bacilos Gram negativos.
Colnias cor de rosa: fermentadoras de lactose.
Colnias incolores: no fermentadoras de lactose.
No h crescimento de cocos Gram positivos.

28 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.8.8

Conservao e validade
Conservar as placas embaladas de 4 a 8C por at 3 meses.

2.9 gar sangue


2.9.1

Princpio
O meio de gar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece timas condies de crescimento a maioria dos microrganismos. A
conservao dos eritrcitos ntegros favorecem a formao de halos de
hemlise ntidos, teis para a diferenciao de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.

2.9.2

Utilidade
Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos.
Verificao de hemlise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
Usado na prova de satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp.).

2.9.3

Frmula/Produto
Meio comercial: Blood gar Base, Columbia gar Base, BHI gar, Mueller
Hinton gar.
Sangue desfibrinado de carneiro ou coelho: 5 mL para cada 100 mL de
meio base.
pH: 6,8 +/- 0,2 (25C).

2.9.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Esfriar a base +/- 50C.
Adicionar 5 mL de sangue desfibrinado de carneiro para cada 100 mL de base.
Homogeneizar delicadamente para no formar bolhas.
Distribuir em placas de Petri de 90 mm de dimetro.

2.9.5

Controle de qualidade
Hemlise beta hemoltica: Streptococcus pyogenes ATCC 19615 ou Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Hemlise alfa hemoltica: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus
pneumoniae ATCC 6305.
Hemlise gama (sem hemlise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.

OPAS/OMS Anvisa/MS 29

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.9.6

Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C por 20 a 30 dias.

2.9.7

Inoculao
Estriar a superfcie do meio, usando a tcnica de semeadura para isolamento.
No final da semeadura, picar o meio com a ala para verificar hemlise em
profundidade.
Incubar 35C 24 horas.

2.9.8

Interpretao
Cor original do meio: vermelho.
Beta hemlise: presena de halo transparente ao redor das colnias
semeadas (lise total dos eritrcitos).
Alfa hemlise: presena de halo esverdeado ao redor das colnias
semeadas (lise parcial dos eritrcitos).
Gama hemlise (sem hemlise): ausncia de halo ao redor das colnias
(eritrcitos permanecem ntegros).

2.9.9

Recomendaes
No usar sangue de carneiro vencido, pois o meio fica hemolisado ou com
cor muito escura, dificultando o estudo de hemlise.
No usar sangue humano, pois alguns microrganismos no apresentam
hemlise.
No adicionar o sangue na base do meio quente, pois as hemcias rompem-se, dificultando o estudo de hemlise.

Por ser um meio rico, o crescimento a partir de materiais biolgicos em geral costuma
ser abundante, sempre que necessrio, isolar a colnia em estudo para os procedimentos de identificao, para no correr o risco de trabalhar com cepas misturadas.

2.10 gar Cled Cystine Lactose Electrolyte Deficient


2.10.1 Princpio
Usado para isolamento e quantificao de microrganismos presentes em
amostras de urina. A deficincia de eletrlitos inibe o vu de cepas de
Proteus.
2.10.2 Utilidade
Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.

30 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.10.3 Frmula/Produto
Meio comercial: gar Cled.
2.10.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Resfriar +/- 50C e distribuir de 20 a 25 mL em placas de Petri 90 mm
estreis.
Deixar em temperatura ambiente at resfriar.
pH: 7,3 +/- 0,2 (25C)
2.10.5 Controle de qualidade
Positivo:
Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado
a denso, colnias mdias ou grandes amareladas, aps 48 horas de incubao.
Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colnias azuis translcidas.
Negativo: ausncia de crescimento.
2.10.6 Inoculao
Verificar tcnica de semeadura quantitativa.
2.10.7 Interpretao
Cor original do meio: azul claro.
Colnias lactose positiva: cor amarela.
Colnias lactose negativa: cor azul.
A) Caractersticas de crescimento:
Escherichia coli: colnias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de dimetro, as no fermentadoras de lactose colnias azuis.
Espcies de Klebsiella: colnias muito mucosas, cor varivel de amarelo
a branco azulado.
Espcies de Proteus: colnias azul translcidas, geralmente menor que
E.coli.
Espcies de Salmonella: colnias planas, cor azul.
Enterococcus faecalis: colnias amarelas, com cerca de 0,5 mm de dimetro.
Staphylococcus aureus: colnias amarelas, com cerca de 0,75 mm de
dimetro.
Staphylococcus coagulase negativa: colnias amarelo palha e brancas.
OPAS/OMS Anvisa/MS 31

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

Corynebacterium: colnias pequenas e cinza.


Lactobacilos: colnias pequenas e com superfcie rugosa.
Pseudomonas aeruginosa: colnias verdes, com superfcie prateada e
periferia rugosa.

2.10.8 Conservao e validade


Conservar embalado e refrigerado (entre 4 a 8C) por at 3 meses (tubos)
e 1 ms (placas).
2.10.9 Recomendaes
Organismos que fermentam lactose baixam o pH e mudam a cor do meio
de verde para amarelo, podendo assim verificar se o microrganismo lactose negativa ou positiva.
Espcies de Shigella no crescem em meios deficientes em eletrlitos.

2.11 Caldo BHI Brain Heart Infusion


2.11.1 Princpio
um meio derivado de nutrientes de crebro e corao, peptona e dextrose.
A peptona e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas.
A dextose um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentao.
2.11.2 Utilidade
Meio para cultivo de estreptococos, pneumococos, meningococos, enterobactrias, no fermentadores, leveduras e fungos.
Pode ser utilizado na preparao do inculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos,
Para realizao de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento
bacteriano a 42 e 44C, para teste de motilidade em lmina.
2.11.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao).
2.11.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Distribuir 3,0 mL em tubos com tampa de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
32 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

pH: 7,4 +/- 0,2 (25C).

2.11.5 Controle de qualidade


Positivo: Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 e Candida albicans ATCC
10231.
Negativo: meio sem inocular.
2.11.6 Inoculao
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia ou o
material a ser testado-realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas.
Incubar a 35C 2 por 24 a 48 horas.
Para isolamento de fungos incubar por at 5 dias.
2.11.7 Interpretao
Cor original do meio: amarelo claro, lmpido.
Positivo: presena de turvao = crescimento bacteriano.
Negativo: ausncia de turvao.
2.11.8 Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C por 6 meses.
2.11.9 Recomendaes
Para cultivo de anaerbios, acrescentar 0,1% de gar.
Para crescimento de Haemophilus e outros fastidiosos necessrio adio
de suplementos a base de L-cistena, NAD (fator V) e hemina (fator X).

2.12 Lwenstein Jensen


2.12.1 Princpio
A base do meio constituda por ovos integrais, o que permite amplo
crescimento das micobactrias e o crescimento satisfatrio para o teste
de niacina (que positivo para Mycobacterium tuberculosis).
2.12.2 Utilidade
Isolamento primrio das micobactrias.
2.12.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou Lwenstein Medium Base.
Ovos de galinha frescos.

OPAS/OMS Anvisa/MS 33

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

A) 1 Etapa:
Meio base
Fosfato monopotssico 1,2 g
Sulfato de magnsio 0,12 g
Citrato de magnsio 0,3 g
L-asparagina 1,8 g
Fcula de batata 15,0 g
Glicerol 6,0 mL
Verde malaquita 0,2g
gua destilada estril qsp 320mL
Vide orientaes do fabricante
B) 2 ETAPA:
Ovos totais 500 mL
2.12.4 Procedimentos
A) Preparao dos ovos:
Escovar os ovos, um a um, com escova de cerdas macias.
Deixar os ovos submersos em gua e detergente comum, durante 30 minutos.
Enxaguar com gua corrente cuidadosamente um a um.
Deixar os ovos submersos em lcool etlico a 70% durante 30 minutos.
Retirar os ovos cuidadosamente e secar com pano estril.
Reservar os ovos.
B) Meio comercial:
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Resfriar a base a 45 - 50C.
Quebrar os ovos, um a um, cuidadosamente em copo de bquer estril e
transferir, um a um, para uma proveta estril de 500 mL.
Completar a proveta com ovos at completar 500 mL.
Transferir os ovos para um copo de liquidificador estril - se no tiver liquidificador prprio para laboratrio, transferir os ovos para um balo de
1000 mL contendo prolas de vidro de tamanho mdio, ambos estreis.
Homogeneizar os ovos.
Passar os ovos para o balo que contm a base fria, filtrando em funil e
gaze estril.
Homogeneizar bem.
Distribuir 10 a 12 mL por tubo de rosca estril.

34 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Colocar os tubos no coagulador inclinados com a superfcie em forma de


bico de flauta (ngulo de 45) durante 50 minutos a 85C - se no tiver
coagulador, pode-se coagular os ovos em banho de areia 85C colocado
em estufa de esterilizao, tambm por 50 minutos, tendo o cuidado de
verificar a temperatura constantemente.

2.12.5 Controle de qualidade


Esterilizao: colocar todos os tubos em estufa.
Crescimento bom a excelente:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618
Mycobacterium avium ATCC 25291
2.12.6 Conservao e validade
Conservar entre 4 a 8C por 3 meses.
2.12.7 Inoculao
Para materiais biolgicos de stios contaminados, fazer descontaminao
prvia pelas tcnicas desejadas (Petroff, NALC, Lauryl sulfato de sdio,
Corper & Stoner modificado).
Semear 5 gotas ou mais, cobrindo bem a superfcie do meio.
Manter os tubos inclinados com a tampa semiaberta at secar bem o inculo.
Depois de seco o inculo, rosquear os tubos e incubar 60 dias 35C.
Semanalmente, abrir as tampas prximo ao bico de Bunsen para ventilar
os cultivos e observar a presena ou no de crescimento.
2.12.8 Interpretao
Cor original do meio: verde claro.
Positivo: Crescimento de colnias amarelas.
Negativo: ausncia de crescimento.
2.12.9 Recomendaes
Como um meio rico em protenas, bactrias proteolticas contaminam
o meio, liquefazendo-o, para isto, deve-se fazer uma leitura com 24 horas de incubao para tirar as culturas que possam ter contaminado.
No usar ovos velhos.
No quebrar mais que um ovo por vez, pois pode ter algum estragado e contaminar os demais.
Manter sempre mais que um bquer estril para o caso de haver algum
ovo estragado.
No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao,
pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente.
OPAS/OMS Anvisa/MS 35

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar ser um Bacilo lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes
podem crescer com pigmento amarelo.

2.13 Meio bifsico: Lwenstein e Middlebrook


2.13.1 Princpio
O meio constitudo de duas fases, uma slida que o meio de Lwenstein Jensen e uma lquida, que o meio 7H-9, juntos fornecem os nutrientes necessrios para o desenvolvimento das micobactrias isoladas
de materiais nobres.
2.13.2 Utilidade
Sistema desenvolvido para o isolamento de micobactrias do sangue e
de materiais paucibacilares, como lquor, lquido pleural, bipsias, entre
outros.
2.13.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Lwenstein Jensen ou
Lwenstein Medium Base.
Meio comercial: Middlebrook 7H-9 broth.
Meio comercial: Middlebrook Enrichment (suplemento para enriquecimento).
Ovos de galinha frescos.
2.13.4 Procedimentos
A) Fase slida:
Meio de Lwenstein Jensen: procedimento igual ao j descrito. Distribuir 12 mL do meio em frascos estreis com capacidade para 100 mL
com tampo de algodo e levar ao coagulador na posio inclinada a
85C por 50 minutos.
B) Fase lquida:
Meio Middlebrook 7H-9 broth:
.. Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante.
.. Adicionar o glicerol, conforme instrues do fabricante.
.. Esterilizar em autoclave.
.. Resfriar a base 50C.
.. Adicionar o suplemento Middlebrook Enrichment, conforme instrues do fabricante.
.. Homogeneizar bem.
36 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

C) Fase slida + lquida:


Distribuir 15 mL do Meio Middlebrook 7H-9 em cada frasco de Lwenstein Jensen inclinado e coagulado.
Fazer o controle de qualidade de esterilidade.
Retirar o tampo de algodo e lacrar os frascos com tampa de borracha
(previamente submersas em lcool etlico 70% durante 30 minutos) e
lacre de alumnio. As tampas e os lacres podem ser autoclavados num
recipiente e retirados com pina estril.
pH: 6,6 +/- 0,2
2.13.5 Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente:
Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294 e Mycobacterium fortuitum
ATCC 6841.
2.13.6 Conservao e validade
Conservar os frascos embalados de 4 a 8C por at 3 meses.
2.13.7 Inoculao
Por serem materiais estreis, no necessrio a descontaminao.
Colher assepticamente 5 mL de sangue e inocular no frasco.
Se for outro material, inocular at 5 mL de material.
Incubar durante 60 dias 35 1C.
Banhar o meio slido semanalmente.
2.13.8 Interpretao
Cor original do meio: parte slida: verde clara, parte lquida: mbar claro.
Positivo: turvao do meio lquido e crescimento de colnias amarelas no
meio slido.
Negativo: ausncia de turvao e crescimento nos meios lquido e slido.
2.13.9 Recomendaes
No usar frascos com meio lquido turvo.
Volumes de inculos inferiores a 2,5 mL podem resultar em culturas falso
- negativas.
No liberar culturas negativas com tempo inferior a 60 dias de incubao,
pois as micobactrias desenvolvem-se lentamente.
Fazer um esfregao do crescimento e corar pela tcnica de Ziehl para confirmar
ser um Bacilo
lcool cido Resistente, pois alguns contaminantes podem crescer com
pigmento amarelo.

OPAS/OMS Anvisa/MS 37

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.14 gar Mycosel


2.14.1 Princpio
A Cicloheximida, um dos componentes do meio, serve para selecionar
dermatfitos. O cloranfenicol inibe o crescimento de bactrias e alguns
fungos filamentosos.
2.14.2 Utilidade
Isolamento de fungos patognicos, principalmente dermatfitos, a partir
de material de investigao contaminado.
2.14.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Mycosel gar, Mycobiotic gar ou gar seletivo para fungos patognicos.
2.14.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 mL
por tubo ou 20mL por tubo de 20x200mm.
Se distribuir em tubos, distribuir antes da esterilizao e deixar solidificar
com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 6,9 +/- 0,1.
2.14.5 Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente: Trichophyton verrucosum ATCC 36058, Candida albicans ATCC 10231.
Crescimento inibido: Aspergillus niger ATCC 16404, Candida tropicalis, Penicillium spp.
2.14.6 Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas).
2.14.7 Inoculao
Inocular sempre dois tubos ou placas.
Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa.
Se em tubo: estriar na superfcie inclinada do meio.
Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente (25C) e o
outro a 37C.
Observar diariamente a presena ou no de crescimento.
Incubar 40 dias.

38 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

2.14.8 Interpretao
Cor original do meio: amarelo claro opalescente.
Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que
cresceu.
2.14.9 Recomendaes
A ausncia de crescimento no indica uma cultura negativa para fungos,
pois alguns fungos podem ter o crescimento inibido nesse meio.
Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas.

2.15 gar Sabouraud Dextrose


2.15.1 Princpio
Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos.
2.15.2 Utilidade
Cultivo e crescimento de espcies de Candidas e fungos filamentosos,
particularmente associados a infeces superficiais.
Caracterizao macroscpica do fungo filamentoso (colnia gigante).
2.15.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Sabouraud Dextrose gar.
2.15.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Resfriar +/- 50C e distribuir em placas de 90 mm de dimetro ou 4 mL
por tubo ou 20mL por tubo de 20x200mm.
Se distribuir em tubos, distribuir antes da esterilizao e deixar solidificar
com inclinao em forma de bico de flauta (ngulo de 45). pH: 5,6 +/- 0,1.
2.15.5 Controle de qualidade
Crescimento bom a excelente: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus
niger ATCC 16404.
2.15.6 Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses (tubos) e 1 ms (placas).

OPAS/OMS Anvisa/MS 39

Captulo 2: Meios para Crescimento e Isolamento

2.15.7 Inoculao
Inocular sempre dois tubos ou placas.
Se em placa: semear com a tcnica de semeadura quantitativa.
Se em tubo: semear na superfcie inclinada do meio.
Incubar um dos meios semeados em temperatura ambiente (25C) e o
outro 37C.
Observar diariamente a presena ou no de crescimento.
Incubar 40 dias.
2.15.8 Interpretao
Cor original do meio: amarelo claro opalescente.
Aps o crescimento, deve-se seguir a identificao do microrganismo que
cresceu.
2.15.9 Recomendaes
Recomenda-se o uso de meios em tubos, pois a incubao demorada resseca com facilidade o meio contido em placas.
No usar meios vencidos e/ou ressecados.
Para suspeitas de Histoplamasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis, semear em BHI gar.

40 OPAS/OMS Anvisa/MS

Captulo 3:
Meios Comerciais para Provas de Identificao

Rosngela Aparecida Mendes Silva


Biomdica do Laboratrio de Microbiologia,
Centro Infantil Boldrini / Campinas SP

Maria Carmen Gonalves Lopes


Biloga - Laboratrio Microbiologia, Centro
Infantil Boldrini / Campinas SP

Julia Taeko Utiyama Yoshida


Farmacutica Bioqumica Seo de Meios de
Cultura Instituto Adolfo Lutz So Paulo

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.1 Base de nitrognio para leveduras Yeast Nitrogen Base


3.1.1

Princpio
Determina a capacidade das leveduras de assimilar carboidratos, utilizando um meio a base de Nitrognio, livre de carboidratos e discos de papel
impregnados com carboidratos, nos quais observa presena de crescimento ao redor, aps um perodo de incubao.

3.1.2

Utilidade
Identificar as espcies de leveduras atravs da prova de assimilao de
carboidratos.

3.1.3

Frmula/Produto
Meio comercial: Yeast Nitrogen Base ou Base de nitrognio para leveduras.
Discos comerciais de carboidratos.
Discos preparados no laboratrio, impregnados com solues de carboidratos a 1%:
Carboidrato 1 g.
gua destilada 100 mL.

3.1.4

Procedimentos
A) Para os discos de carboidratos:
Se for preparar os discos com carboidratos, preparar 2 dias antes de
fazer o meio.
Usar discos estreis disponveis para compra ou esterilizar papel de filtro de 10 mm de dimetro em autoclave.
Pesar o carboidrato (cada carboidrato em frasco separado) e adicionar
gua, homogeneizar bem at completa dissoluo - carboidratos utilizados: glicose, maltose, sacarose, lactose, galactose, melibiose, celobiose, inositol, xilose, rafinose, trealose, dulcitol.
Esterilizar por filtrao (cada um em frasco separado).
Impregnar os discos previamente estreis (embeber totalmente os discos).
Deixar os discos em estufa 37C at secarem totalmente.
B) Para meio base de nitrognio:
Pesar e hidratar conforme instruo do fabricante; acrescentar metade
do volume de gua; Esterilizar por filtrao e reservar.
Pesar gar bacteriolgico (13g/l) e acrescentar a outra metade de gua.
Esterilizar em autoclave e resfriar.
Misturar as duas partes e distribuir 20mL em tubos 20x150 com tampa
estreis.

42 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.1.5

Controle de qualidade
POSITIVO

NEGATIVO

Glicose

Candida albicans

Candida krusei

Maltose

Candida albicans

Candida krusei

Sacarose

Candida tropicalis

Candida krusei

Lactose

Candida kefyr

Candida krusei

Galactose

Candida albicans

Candida krusei

Melibiose

Candida guilliermondii

Candida krusei

Celobiose

Candida guilliermondii

Candida krusei

Inositol

Cryptococcus neoformans

Candida krusei

Xilose

Candida albicans

Candida krusei

Rafinose

Candida guilliermondii

Candida krusei

Trealose

Candida albicans

Candida krusei

Dulcitol

Candida guilliermondii

Candida krusei

3.1.6

Conservao e validade
Conservar os tubos de 4 a 8C por at 3 meses.
Discos: refrigerado e se possvel em dessecador durante 1 ano ou mais.

3.1.7

Inoculao
Aquecer o tubo contendo 20 mL de meio base de nitrognio at fundir
totalmente.
Resfriar a base 47 - 48C.
Fazer uma suspenso das leveduras na escala 4 ou 5 de McFarland em 4
mL de gua destilada estril,, usando um cultivo de leveduras de 24 a 72
horas.
Despejar a suspenso de leveduras no tubo contendo a base de nitrognio.
Homogeneizar bem.
Despejar o contedo homogeneizado (meio base + suspenso de leveduras) em placa de Petri de estril de 150 mm de dimetro.
Esperar solidificar em temperatura ambiente.
Colocar os discos impregnados com carboidratos com auxlio de uma pina flambada.
Incubar 30C durante 18 a 24 horas.

3.1.8

Interpretao
Cor original do meio: amarelo palha.

OPAS/OMS Anvisa/MS 43

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.1.9

Positivo: halo de crescimento ligeiramente opaco ao redor dos discos, que


significa a assimilao do acar pela levedura.
Negativo: Ausncia de halo de crescimento. O meio permanece inalterado.

Recomendaes
No usar cultivos de leveduras superiores a 72 horas.
No usar inculo inferior ao recomendado, pois pode resultar em prova
falso - negativa.
No adicionar a suspenso de leveduras base com temperatura superior
a 48C, pois pode inativar as clulas e resultar em prova falso - negativa.
Aps homogeneizar o meio base e suspenso de leveduras, despejar imediatamente na placa de Petri, pois solidifica rapidamente.

3.2 gar Citrato Simmons


3.2.1

Princpio
Verifica a capacidade da bactria de utilizar o citrato de sdio como nica
fonte de carbono, juntamente com sais de amnia, alcalinizando o meio.

3.2.2

Utilidade
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.

3.2.3

Frmula/Produto
Meio comercial: gar Citrato Simmons.

3.2.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio segundo instrues do fabricante.
Ajustar o pH para 6,9 0,2.
Aquecer sob agitao at fundir o gar.
Distribuir em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes, para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar
solidificar em temperatura ambiente.

3.2.5

Controle de qualidade
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

44 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.2.6

Inoculao
Com o auxlio de um fio bacteriolgico, inocular na superfcie a colnia, no
furar a base.
Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas.

3.2.7

Interpretao
Cor original do meio: verde
Positivo: cor azul ou crescimento no local do inculo.
Negativo: no h crescimento e a cor permanece inalterada.
Se houver crescimento visual na rea do inculo sem mudana de cor, o teste
pode ser considerado positivo, reincubar por 24 at 72 horas, a incubao poder
mudar a cor do meio para azul (alcalino).
A) Leitura inicial com 24 horas:
Se resultado positivo: encerrar o teste.
Se resultado negativo ou houver dvida: reincubar por mais 24/48 horas.
B) Leitura com 48 horas:
Se houver crescimento visvel na rea do inculo sem mudana de cor,
o teste pode ser considerado positivo, (encerrar o teste).
Se resultado negativo ou houver dvida, reincubar por 24 at 72 horas,
a incubao poder mudar a cor do meio para alcalino (azul).

3.2.8

Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas.
Aps esse perodo realizar controles negativo e positivo semanalmente.

3.2.9

Recomendaes
Manter a tampa do tubo frouxa, o meio necessita de oxignio.
No se devem transportar colnias de meios que contenham glicose ou outros
nutrientes/substratos, pois podem entrar em contato com o meio de citrato,
podendo dar um resultado falso positivo.
Se algum resultado estiver duvidoso, inocular um novo tubo e incubar em
temperatura ambiente (22 a 25C) por at 7 dias.
No usar repiques de caldo.
Deixar o tubo em temperatura ambiente antes de inocular a bactria.
Para fazer o inculo flambar o fio bacteriolgico.
No fazer inculo muito denso (pode acidificar o meio deixando-o amarelo).

OPAS/OMS Anvisa/MS 45

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.3 gar Bile-Esculina


3.3.1

Princpio
A prova de Bile-Esculina baseada na capacidade de algumas bactrias
hidrolisarem esculina em presena de blis. A esculina um derivado glicosdico da cumarina. As duas molculas do composto (glicose e 7-hidroxicumarina) esto unidas por uma ligao ster atravs do oxignio.
A esculina incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares.
As bactrias Bile-Esculina POSITIVAS, so capazes de crescer em presena de
sais biliares. A hidrlise da esculina no meio resulta na formao de glicose e
esculetina. A esculetina reage com ons frricos (fornecidos pelo composto
inorgnico do meio - o citrato frrico), formando um complexo negro.

3.3.2

Utilidade
Separao dos Streptococcus Bile-Esculina positiva dos Bile-Esculina negativa.
Identificao dos Enterococcus spp., que so Bile-Esculina positiva.
Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores e enterobactrias, usar o meio sem blis (vide prova de esculina).

3.3.3

Frmula/Produto
Meio comercial: gar Bile-Esculina
Frmula: Peptona 5 g
Extrato de carne 3 g
Blis 40 g
Esculina 1 g
Citrato frrico 0,5 g
gar 15 g
gua destilada 1000 mL
pH = 6,8 +/- 0,2 (25C)

3.3.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Fundir o meio.
Distribuir 2,5 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
Aps retirar da autoclave, inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45).

3.3.5

Controle de qualidade
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.

46 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.3.6

Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C por 3 meses.

3.3.7

Inoculao
Estriar a superfcie inclinada do meio.
Incubar a 35C 24 horas.

3.3.8

Interpretao
Cor original do meio: acinzentado.
Positivo: Enegrecimento em pelo menos metade ou mais do meio.
Negativo: Ausncia de enegrecimento ou crescimento de menos da metade do meio aps 72 horas de incubao.

3.3.9

Recomendaes
Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de
incubao maior (48 horas).
Alguns Streptococcus do grupo viridans (cerca de 3%) podem hidrolisar a
esculina em presena de blis se incubados em atmosfera de CO2.

3.4 gar Sangue CAMP


3.4.1

Princpio
Consiste na interao da beta hemlise secretada pelo Staphylococcus
aureus com o microrganismo em estudo, que secreta uma protena, denominada fator CAMP, produzindo aumento de hemlise no local da
inoculao.

3.4.2

Utilidade
Separao do Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de
Lancefield (S. agalactiae) e da Listeria monocytogenes (CAMP positivos)
dos demais Streptococcus beta hemolticos e espcies de Listeria.

3.4.3

Frmula/Produto
Para essa prova utiliza-se:
Placa de meio gar Sangue.
Cepa de Staphylococcus aureus produtora de beta hemolisina ATCC
25923.

3.4.4

Controle de qualidade
Positivo: Streptococcus agalactiae ATCC 13813.
Negativo: Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
OPAS/OMS Anvisa/MS 47

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.4.5

Inoculao
Com auxlio do fio bacteriolgico, semear na superfcie de meio gar Sangue a cepa de Staphylococcus aureus com uma nica linha reta.
Novamente com o fio bacteriolgico (flambado), tocar nas colnias em
estudo.
Semear uma nica linha reta na superfcie do meio gar Sangue, perpendicularmente linha de semeadura do S. aureus, sem tocar no inculo do
S. aureus.
Logo em seguida, sem flambar o fio, picar o meio gar Sangue duas vezes,
uma de cada lado da semeadura da cepa em estudo, sem tocar nas duas
linhas de inculo j feitos (a do S. aureus e da cepa em estudo).
Incubar 35C 24 horas.
(a) Inculo do S. aureus.
(b) Inculo da cepa em estudo.

3.4.6

Interpretao
Positivo: Aumento da rea de hemlise em forma de flecha no local onde
esto mais prximas as duas estrias de crescimento.
Negativo: Ausncia de aumento da hemlise. Observa-se nitidamente a
hemlise do S. aureus e da cepa em estudo, inalteradas.

3.4.7

Recomendao
No utilizar cepas velhas de S. aureus, pois podem no produzir beta hemolisina.
No tocar as estrias da semeadura das cepas, para no dar um resultado
falso negativo.
No utilizar placas de gar Sangue velhas que dificultem a leitura da prova, j que baseada na hemlise das cepas.

3.5 Caldo Base de Moeller


3.5.1

Princpio
As descarboxilases so um grupo de enzimas com substrato especfico,
capazes de reagir com o grupo carboxila dos aminocidos para formarem
aminas alcalinas. Essa reao, conhecida como descarboxilao, origina
dixido de carbono como produto secundrio.
Emprega-se normalmente trs aminocidos para identificao dos microrganismos: lisina, ornitina e arginina. A base de Moeller a mais utilizada. Os
produtos aminados especficos, so:
Lisina: Cadaverina.

48 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Ornitina: Putrescina.
Arginina: Citrulina.
A converso da arginina em citrulina uma atividade de diidrolase, e no
descarboxilase, na qual o grupo NH2 retirado da arginina como primeira
etapa. Em seguida, a citrulina convertida em ornitina, que sofre descarboxilao para formar putrescina.
A incubao deve ser em anaerobiose e para isso adicionado 1 mL de
leo mineral estril aps a inoculao. No incio da incubao, a glicose
contida no meio fermentada e ocorre viragem de cor prpura para o
amarelo. Quando o aminocido descarboxilado, as aminas alcalinas formadas revertem a cor do meio para prpura original.

3.5.2

Utilidade
Verificar a capacidade de microrganismos usarem enzimas, auxiliando na
identificao.
Utilizado principalmente para identificaes de enterobactrias, bacilos
Gram negativos no fermentadores, estafilococos.

3.5.3

Frmula/Produto
Meio base comercial: Caldo Base de Moeller para Descarboxilase.
Aminocidos: L lisina ou DL lisina, L ornitina ou DL ornitina, L arginina ou
DL arginina.

3.5.4

Procedimentos
Preparar os meios com a Base de Moeller e aminocidos.
Preparar o meio apenas com a Base de Moeller, sem aminocidos, que
ser usada como controle.
Seguir as recomendaes do fabricante para pesar o meio Base de Moeller.
Se usar aminocido L (levgiro), adicionar 1 grama do aminocido para
cada 100 mL de meio base.
Se usar aminocido DL (dextrgiro), adicionar 2 gramas do aminocido
para cada 100 mL de meio base.
Homogeneizar bem o meio.
Acertar o pH para 6,0 com HCl 1 N.
Distribuir 2 mL por tubo (usar tubos de rosca).
Esterilizar em autoclave.

3.5.5

Controle de qualidade
Positivo:
Lisina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Enterobacter aerogenes ATCC
13047.
OPAS/OMS Anvisa/MS 49

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

Ornitina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Serratia marcescens ATCC


13880.
Arginina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Enterobacter sakazakii.
Negativo:
Lisina: Enterobacter cloacae ATCC 13047 ou Citrobacter freundii ATCC
8454.
Ornitina: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 ou Citrobacter freundii
ATCC 8454.
Arginina: Enterobacter aerogenes ATCC 13047 ou Klebsiella pneumoniae
ATCC 13883.

3.5.6

Conservao e validade
Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses.

3.5.7

Inoculao
A partir de crescimento recente, inocular a colnia em estudo no tubo
contendo o aminocido e no tubo controle.
Colocar aproximadamente 1 mL de leo mineral estril em cada tubo.
Incubar 35 +/- 1C em aerobiose.

3.5.8

Interpretao
Cor original do meio: prpura.
Positivo:
Tubo controle (sem aminocido): amarelo e turvo - indica que o microrganismo vivel e o pH do meio abaixou o suficiente para ativar as
enzimas descarboxilase.
Tubo com aminocido: prpura e turvo indica a formao de aminas
a partir da reao de descarboxilao.
Negativo:
Tubos controle e com aminocido: prpura.

3.5.9

Recomendaes
Verificar se o inculo foi satisfatrio para o crescimento, pois a cor original
do meio - prpura, sem apresentar turvao, no significa positividade e
sim, ausncia de crescimento bacteriano.
Como a reao ocorre em anaerobiose, imprescindvel a adio de leo
mineral.
Pode-se autoclavar o meio j com o leo mineral ou adicionar aps a inoculao
do microrganismo.
Para alguns microrganismos, como bacilos Gram negativos no fermentadores, necessrio um perodo de incubao prolongado (24 a 72 horas).

50 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.6 gar Dnase


3.6.1

Princpio
Cepas de alguns microrganismos produzem DNase e endonuclease termoestvel. Essas enzimas hidrolisam cido desoxirribonuclico (DNA)
contido no meio de cultura aps um perodo de incubao. Posteriormente esse meio acidificado com HCl 1N para a revelao da prova.

3.6.2

Utilidade
Prova de identificao que separa os principais microrganismos de importncia clnica, entre eles:
DNase positivos: Staphylococcus aureus, Serratia spp. e Proteus spp., Stenotrophomonas maltophilia, Cryseobacterium meningosepticum, Moraxella catarrhalis.
DNase negativos: Staphylococcus coagulase negativa, demais enterobactrias, demais bacilos Gram negativos no fermentadores.

3.6.3

Frmula/Produto
Meio comercial: DNase gar.

3.6.4

Procedimentos
Pode-se revelar a prova de duas maneiras:
Com uma soluo de cido clordrico 1 N
Adicionando base do meio de cultura azul de Toluidina O.
Para a revelao com cido clordrico 1N:
Preparar e esterilizar o meio conforme instrues do fabricante.
Esfriar o meio a aproximadamente 50C.
Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro.
Preparar uma soluo de HCl 1N, seguindo a frmula abaixo:
N = C1
(Nmero de equivalentes grama de soluto)


V
(volume da soluo)
C1 = M1

E
E =

(Peso molecular do soluto)


(Volume da soluo)

M
x

x:
para bases: OH desprendido na reaopara cidos: H+ ionizveis
para oxidantes/redutores: variao do NOX
para sais normais: valncia do ction ou nion
Para a revelao com azul de Toluidina O:
OPAS/OMS Anvisa/MS 51

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.


Acrescentar para cada 1000 mL de base 0,1g de azul de Toluidina O.
Esterilizar em autoclave.
Esfriar o meio a aproximadamente 50C.
Distribuir em placas de petri de 50 mm de dimetro.

3.6.5

Controle de qualidade
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Serratia marcescens ATCC
13880.
Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 ou Escherichia coli ATCC
25922.

3.6.6

Conservao e validade
Meio: 4 a 10 C por 1 meses.
cido Clordrico 1N:
Guardar em frasco mbar, em temperatura ambiente, ao abrigo de luz,
calor e umidade.
Validade: 6 meses.

3.6.7

Inoculao
Para as duas tcnicas de preparao, a inoculao a mesma:
Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer
um esfregao circular e denso na placa de DNase.
Incubar 35 +/- 1C 24 horas.

3.6.8

Interpretao
A) Revelao com HCl 1 N:
Cor original do meio: amarelo claro.
Colocar sobre o crescimento bacteriano HCl 1 N at banhar totalmente
a superfcie do meio.
Aguardar aproximadamente 3 minutos ou at que o meio fique opaco.
Positivo: Presena ntida de halo claro na parte inferior e em volta da
colnia.
Negativo: Ausncia de halo claro em volta da colnia.
B) Revelao com azul de toluidina O:
Cor original do meio: azul claro
Positivo: Presena de colorao rosa na parte inferior e em volta da colnia.
Negativo: Ausncia de cor rosa. O meio permanece com a cor original,
azul.

52 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.6.9

Recomendaes
Usar sempre uma cepa controle positivo para facilitar a leitura da prova.
Em uma mesma placa, pode-se fazer at 4 testes (placas de 50 mm de
dimetro).
armazenamento incorreto e uso com validade vencida do HCl 1 N pode dar
leituras falso negativas.
Para a deteco da atividade de DNase no necessrio que haja crescimento, por isso que semeadura deve ser de forma circular densa e no
de estria.
Para o meio preparado com Azul de Toluidina O, algumas cepas requerem
um perodo maior de incubao (at 48 horas) para produzirem DNase.
Usar cultura jovem (at 24 horas).

3.7 gar Esculina


3.7.1

Princpio
Verifica se a bactria capaz de hidrolisar a esculina.
A esculetina exige sais de ferro formando precipitado marrom escuro ou
preto.

3.7.2

Utilidade
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
Para identificao de Streptococcus e Enterococcus, usar o meio com
blis, vide prova de Bile- Esculina.

3.7.3

Frmula/Produto
gar trptic de soja (TSA) ou base de gar sangue 4 g.
Citrato frrico 0,05 g.
Esculina 0,1 g.
gua destilada 100 mL.

3.7.4

Procedimentos
Pesar o TSA ou a base de gar sangue, o citrato frrico e a esculina e colocar tudo no mesmo Erlenmeyer.
Colocar gua destilada.
Ajustar o pH para 7,0.
Aquecer lentamente at fundir o gar e dissolver o citrato frrico (lentamente porque o citrato frrico demora a dissolver).
Distribuir 3 mL do meio em tubos com tampa de rosca.
Esterilizar em autoclave.

OPAS/OMS Anvisa/MS 53

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar
solidificar em temperatura ambiente.

3.7.5

Controle de qualidade
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

3.7.6

Inoculao
Inocular colnias de crescimento recente (18 24 h).
Picar o meio e semear na superfcie do gar.
Incubar a 35 C por 24 horas.

3.7.7

Interpretao
Cor original do meio: palha.
Positivo: marrom escuro ou preto.
Negativo: inalterado (palha).

3.7.8

Conservao e validade
Conservar de 4 a 8C, de 6 a 8 semanas.
Aps esse perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.

3.7.9

Recomendaes
A enzima glicosidase responsvel pela hidrlise da esculina em todas
as enterobactrias exceto a Escherichia coli. A Escherichia coli no possui a
enzima glicosidase sendo necessrio usar a lactose, outro dissacardeo ou
outra fonte de carbono. Fazer um inculo leve com agulha bacteriolgica
e interpretar aps 18-24 horas.
A produo de piocina pela Pseudomonas aeruginosa pode escurecer o
meio, isso no uma reao positiva.
Resultado falso positivo pode ocorrer pela produo de H2S em no fermentadores, semelhante ao bacilo da bactria Shewanella putrefaciens.

3.8 gar Fenilalanina


3.8.1

Princpio
Verifica a capacidade da bactria de produzir cido fenilpirvico a partir
da fenilalanina por ao enzimtica.

3.8.2

Utilidade
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias.

54 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.8.3

Frmula/Produto
Meio comercial: gar Fenilalanina:
Soluo de cloreto frrico.
Cloreto frrico 10 g.
Adicionar 100 mL de gua destilada.
Colocar em frasco mbar.
Validade: 6 meses.
A soluo de cloreto frrico 10% utilizada para revelar a atividade da
enzima fenilalanina desaminase no meio de fenilalanina.

3.8.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob constante agitao at fundir o meio.
Ajustar o pH para 7,3 0,2.
Distribuir em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo 45). Deixar
solidificar em temperatura ambiente.

3.8.5

Controle de qualidade
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 8427 ou Proteus mirabilis ATCC 12453.
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

3.8.6

Inoculao
Fazer um inculo denso.
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas.
Incubar a 35C por 18 a 24 horas.

3.8.7

Interpretao
Adicionar diretamente o cloreto frrico no tubo inoculado, antes da interpretao do resultado e distribuir o reagente sobre a superfcie do meio.
Cor original do meio: amarelo palha.
Positivo: formao de uma colorao esverdeada na superfcie do meio
aps a adio do cloreto frrico.
Negativo: o meio permanece inalterado.

3.8.8

Conservao e validade
Conservar de 4 a 8C, de seis a oito semanas.

OPAS/OMS Anvisa/MS 55

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.8.9

Recomendaes
Um resultado positivo deve ser interpretado imediatamente aps a adio do reagente, pois a cor verde desbota rapidamente. A interpretao
deve ser feita em at 5 minutos.

3.9 CTA Cystine Tryticase gar


3.9.1

Princpio
CTA um meio semi-slido, recomendado para o estudo de fermentao
de carboidratos de microrganismos exigentes.

3.9.2

Utilidade
Usado para diferenciar espcies de Haemophilus spp., Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Corynebacterium spp.

3.9.3

Frmula/Produto
Meio comercial Cystine Tryticase gar Medium.
Carboidratos mais utilizados: glicose, maltose, lactose, sacarose, frutose,
manose.
Carboidrato 10 g
gua destilada 100 mL
pH: 7,3 +/- 0,2

3.9.4

Procedimentos
Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar.
Pesar o CTA conforme instrues do fabricante, acrescentar 900 mL de gua e
homogeneizar bem.
Esterilizar em autoclave.
Esfriar a base a aproximadamente 50C.
Adicionar o 100mL de soluo de carboidrato a 1% esterilizado por filtrao.
Distribuir em 3 mL por tubo.
Deixar os tubos esfriar na posio vertical.

3.9.5

Controle de qualidade

Glicose
Maltose
Lactose
Sacarose
Frutose
Manose
56 OPAS/OMS Anvisa/MS

POSITIVO
Neisseria sicca
Neisseria sicca
Neisseria lactamica
Neisseria sicca
Neisseria sicca
Haemophilus parainfluenzae

NEGATIVO
Branhamella catarrhalis
Branhamella catarrhalis
Neisseria sicca
Branhamella catarrhalis
Branhamella catarrhalis
Haemophilus influenzae

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.9.6

Conservao e validade
Temperatura ambiente por 3 meses.

3.9.7

Inoculao
Fazer um inculo bem denso, no centro do meio.
Incubar 35C em jarra com vela acesa e gaze embebida em gua de torneira para manter a umidade da atmosfera.

3.9.8

Interpretao
Cor original do meio: alaranjado.
Positivo: cor amarela, indicando acidificao (fermentao) do meio e turvao.
Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, alaranjado, e sem turvao.

3.9.9

Recomendaes
Para provas negativas, incubar um perodo maior (72 horas).
No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode
degradar o carboidrato.
Fazer inculo denso, pois inculos fracos podem dar resultado falso negativo.

3.10 Caldo Triptona e SIM


3.10.1 Princpio
Determinam a habilidade do microrganismo de metabolizar o triptofano
em indol. Triptofano um aminocido que pode ser oxidado por certas
bactrias resultando na produo de indol, aps a adio de reagentes de
Erlich ou Kovacs.
3.10.2 Utilidade
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores, Haemophilus e anaerbios.
3.10.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Caldo Triptona.
Meio comercial: SIM (sulfato/indol/motilidade gar).
Reativo Erlich
Paradimetilaminobenzaldedo 1 g
lcool etlico (95%) 95 mL
OPAS/OMS Anvisa/MS 57

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

cido clordrico concentrado 20 mL


Guardar em frasco mbar em temperatura ambiente (22-25C).
Cor original do reativo de Erlich: amarelo
Ou
Reativo de Kovacs (pode ser adquirido comercialmente pronto para uso)
ou ser preparado no laboratrio:
lcool isoamlico 150 mL
Paradimetilaminobenzaldedo 10,0 g
cido clordrico concentrado 50 mL
Dissolver o aldedo em lcool e adicionar lentamente o cido clordrico.
Guardar em frasco mbar e no refrigerador quando no estiver em uso.
Obs.: No conservar em temperatura ambiente por longo perodo, a cor pode
ser alterada de amarelo palha para marrom, perdendo assim a sensibilidade.
Xilol: pode ser adquirido comercialmente pronto para uso.

3.10.4 Procedimentos
A) Meio Caldo Triptona
Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao, at fundir o meio.
Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar esfriar em temperatura ambiente na posio vertical.
B) Meio SIM
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao, at fundir o meio.
Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
3.10.5 Controle de qualidade
Microrganismo

H2S

INDOL

MOTILIDADE

Proteus vulgaris

POS

POS

POS

Shigella sonnei

NEG

NEG

NEG

Escherichia coli

NEG

POS

POS

3.10.6 Controle qualidade para meio Caldo Triptona:


Positivo: Escherichia coli ATCC 25922.
Negativo: Enterococcus faecalis ATCC 29212.
58 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.10.7 Controle qualidade para meio SIM:


Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia coli
ATCC 25922
3.10.8 Inoculao
A) Meio Caldo Triptona
Fazer um inculo leve com colnia pura de cultura de 18-24 horas
(para enterobactrias, bacilos Gram negativos no fermentadores ou
anaerbios).
Fazer um inculo denso com colnia pura de cultura de 18-24 horas
(para Haemophilus).
Incubar a 35C por 24 horas (enterobactrias) ou at 48 horas (bacilos
Gram negativos no fermentadores ou anaerbios) em aerobiose ou
anaerobiose, respectivamente.
B) Meio SIM
Com o auxlio da agulha, inocular uma colnia no meio na posio
vertical, lentamente at a base.
Afastar a agulha seguindo a linha inicial do inculo.
Incubar a 35C por 18-24 horas.
3.10.9 Interpretao
Cor original do meio.
Aps incubao, revelar com reagente de Ehrlich ou Kovacs.
A escolha entre os reagentes de Ehrlich ou Kovacs depende da preferncia dos Gram negativos no fermentadores ou anaerbios, que podem
produzir mnima quantidade de indol.
Revelao com reativo de Ehrlich ou Kovacs no meio de Caldo Triptona
Colocar 1mL de xilol no tubo com crescimento bacteriano, homogeneizar
vigorosamente e aguardar 1 minuto.
Adicionar pela parede do tubo 0,5 mL do reativo de Erlich e realizar a leitura.
Indol positivo: aparecer um anel vermelho logo abaixo da camada de
xilol.
Indol negativo: permanecer um anel amarelo logo abaixo da camada
de xilol.
Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM.
Realizar a leitura da motilidade e do H2S.
Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do tubo
no meio contendo o crescimento bacteriano.
Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.
OPAS/OMS Anvisa/MS 59

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do inculo e difundem-se no meio causando turbidez.
Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha do inculo, em volta continua lmpido.
HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra.
HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada.
Indol positivo aparecer um anel vermelho.
Indol for negativo aparecer um anel amarelo.

3.10.10 Conservao e validade


Caldo Triptona: 6 meses se conservado de 2 a 8C.
Meio SIM: 6 meses se conservado de 2 a 8C em tubos com tampas de
rosca, tubos com tampo de algodo o meio pode ressecar antes deste
prazo.
3.10.11 Recomendaes
Um timo pH para triptofanase levemente alcalino (pH 7,4-7,8), um pH
cido pode baixar a produo do indol indicando um resultado falso negativo ou positivo fraco.
Cultura para ser testada produo de indol deve ser incubada em aerobiose, a baixa tenso de oxignio baixa a produo de indol.
Indol positivo se perde aps 96 horas de incubao.
Alguns microrganismos formam indol, mas se quebram ou baixam rapidamente a produo, podendo ocorrer um resultado falso negativo. Ocorre
principalmente entre algumas espcies de Clostridium spp.
Pequenas modificaes podem ser necessrias para testar a produo de
indol em no fermentadores (fracos produtores de indol), como a utilizao de um meio enriquecido, como o meio BHI enriquecido com 2% de
soro de coelho ou isovitalex, extrao com xilol e revelao com reagente
de Ehrlich.
Na extrao de indol com o reagente xilol, colocar pequena quantidade
de xilol para evitar a diluio do indol tornando-o fraco positivo ou negativo.
Algumas cepas de Cardiobacterium hominis, Kingella spp., Sutonella indologenes, Eikenella corrodens, necessitam de inculo denso no caldo de
triptona, incubao de 48 horas, extrao com xilol e revelao com reagente de Ehrlich.

60 OPAS/OMS Anvisa/MS

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3.11 Caldo Malonato


3.11.1 Princpio
Determina a habilidade do microrganismo de utilizar malonato de sdio
como nica fonte de carbono, resultando em alcalinizao do meio.
3.11.2 Utilidade
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias e no fermentadores.
3.11.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Caldo Malonato.
3.11.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Ajustar o pH 6,7 0,2.
Distribuir 1,5 mL em tubos com tampa de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.
3.11.5 Controle de qualidade
Positivo: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
3.11.6 Inoculao
Inocular colnias puras de 18 a 24 horas.
Inculo leve.
Incubar a 35C de 24-48 horas, observando o cultivo diariamente.
3.11.7 Interpretao
Cor original do meio: verde.
Positivo: azul.
Negativo: inalterado (verde).
3.11.8 Conservao e validade
Conservar de 4 a 10C de 6 a 8 semanas.
Aps esse perodo realizar controle positivo e negativo semanalmente.
3.11.9 Recomendaes
Alguns resultados negativos produzem cor amarela, isso porque a fermentao da glicose aumenta a acidez.
Alguns microrganismos malonato positivo produzem uma fraca alcalinizao, dificultando a interpretao. Se o resultado for duvidoso incubar
OPAS/OMS Anvisa/MS 61

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

um tubo sem inculo para comparao, junto com o teste em questo, se


no aparecer nenhum trao azul, incubar por mais 24 horas, liberando o
resultado negativo aps incubao de 48 horas.
Cuidado ao interpretar resultados aps incubao prolongada. Cor azul
fraco (azul esverdeado) pode parecer uma reao fraca positivo podendo
ser ignorado.

3.12 Caldo Nitrato


3.12.1 Princpio
Determina a habilidade do microrganismo de reduzir o nitrato (NO) a nitrito (NO) ou gs nitrognio (N) (denitrificao).
3.12.2 Utilidade
Diferenciar gneros e espcies de enterobactrias, no fermentadores,
anaerbios, Haemophilus, Neisseria e Mycobacterium.
3.12.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Caldo Nitrato.
Reagentes para revelao da reao.
A) Soluo A
cido sulfanlico 0,8 g
cido actico 5N 100 mL
B) Soluo B
N,N-dimetil-l-naftilamina 0,6 g
cido actico 5N* 100 mL
* cido actico 5N:
cido actico glacial 40 mL
gua destilada 100 mL
Zinco em p (pronto para uso)
3.12.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Acertar o pH 7,0.
Distribuir 3 mL do meio em cada tubo, contendo um tubo de Durhan invertido.
Esterilizar em autoclave.
Deixar o tubo esfriar na posio vertical.
Reagentes para revelao da reao.
62 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Soluo A
Dissolver o cido sulfanlico em uma parte do cido e depois completar com o restante do cido actico q.s.p. 100 mL.
Soluo B
Dissolver o N,N-dimetil-l-naftilamina com uma parte do cido e completar o restante do cido actico q.s.p. 100 mL.

3.12.5 Controle de qualidade


Resultado

Cepa

Resultado esperado

Nitrato reduzido a nitrito

Enterobactrias

Colorao vermelha

Nitrato a gs

Pseudomonas aeruginosa

Bolhas no tubo de Durhan

Nitrato no reduzido

Acinetobacter baumannii

Colorao vermelha somente


aps adio de p de zinco

3.12.6 Inoculao
Fazer um inculo denso, com colnias recentes (18 24 horas) no meio
com ala bacteriolgica.
No agitar o tubo aps inoculao.
Incubar 351C por 24 a 48 horas, sendo necessrio algumas vezes at 5
dias.
Verificar se existe crescimento aparente no meio antes de colocar os
reagentes para revelar a Reao.
Verificar a presena de bolhas dentro do tubo de Durhan.
3.12.7 Interpretao
Cor original do meio: incolor a palha.
Verificar se h bolhas de gs dentro do tubo de Durhan, se houver significa que a bactria reduziu nitrato a gs = denitrificao.
Adicionar 5 gotas dos reagentes A e B no meio, sem homogeneizar. Se
houver desenvolvimento de cor vermelho tijolo significa que a bactria
reduziu nitrato a nitrito.
Se aps a adio dos reagentes A e B o tubo continuar incolor, adicionar
uma pitada de p de zinco no tubo, se houver desenvolvimento de cor
vermelho tijolo significa que a bactria no reduziu nitrato a nitrito e o
nitrato ainda permanece no meio.
IMPORTANTE: algumas bactrias no conseguem reduzir nitrato a nitrito
e s conseguem reduzir nitrito, como por exemplo, Alcaligenes Faecalis e
Oligella Uretralis, havendo a necessidade de utilizar o caldo nitrito para
esse fim.

OPAS/OMS Anvisa/MS 63

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

RESULTADO

REAGENTES A e B

P DE ZINCO

GS NO TUBO DE
DURHAN

Reduziu nitrato a nitrito

Pos

No houve reao

No houve reao

No reduziu nitrato a nitrito

NEG

Pos

NEG

Nitrato reduzido a gs

NEG

NEG

POS

3.12.8 Conservao e validade


Caldo nitrato: conservar o meio de 4 a 8C por at 3 meses.
Solues A e B: guardar em frasco escuro na geladeira (4 a 8C) por at 12
meses.
cido actico 5N: Conservar de 4 a 8C por at 12 meses.
3.12.9 Recomendaes
Utilizar o tubo de nitrato sem inocular como controle negativo, para evitar
resultado falso positivo, devido alta sensibilidade do teste.
Quando for adicionado o p de zinco, no colocar em excesso, pode
resultar em falso negativo (incolor).

3.13 Meio Base Para Oxidao e Fermentao OF


3.13.1 Princpio
Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar os carboidratos pela
via oxidativa ou fermentativa.
3.13.2 Utilidade
Diferenciar bacilos Gram negativos quanto ao tipo de metabolismo
empregado em utilizar carboidratos.
3.13.3 Frmula/Produto
Meio comercial: Meio base de OF.
Carboidratos (dextrose ou glicose, lactose, sacarose, xilose, maltose, manitol etc).
Vaselina lquida estril.
3.13.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer o meio at dissolver todo o gar.
Separar volumes iguais em diferentes Bquer, dependendo do nmero de carboidratos que sero preparados.
Adicionar 1g do carboidrato para cada 100 mL de meio base e homogeneizar.
Distribuir 2 mL em tubos com tampa de rosca.
64 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Esterilizar em vapor fluente por 20 minutos (deixar a vlvula de presso da


autoclave aberta e, quando estiver saindo bastante vapor, comear marcar o tempo. Vapor fluente s pode ser feito em autoclave com tampas
regulveis para sada de vapor. Autoclaves horizontais no possuem controle de sada de vapor, so automticas).
Pode-se tambm esterilizar a base e adicionar os acares esterilizados
por filtrao em filtros Millipore 0,45 0,22m (90 mL de base autoclavada
e 10 mL de acar esterilizado por filtrao).
Deixar esfriar a temperatura ambiente na posio vertical.

3.13.5 Controle de qualidade


RESULTADO

CEPA

Resultado Esperado

OF-GLICOSE
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Pseudomonas aeruginosa
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F- amarelo
A/F- inalterado

OF-FRUTOSE
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Stenotrophomonas maltophilia
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F- amarelo
A/F-inalterado

OF-LACTOSE
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Burkolderia cepacia
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F-amarelo
A/F- inalterado

OF-MALTOSE
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Stenotrophomonas maltophilia
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F-amarelo
A/F- inalterado

OF-MANITOL
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Burkolderia cepacia
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F-amarelo
A/F- inalterado

OF-SACAROSE
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Stenotrophomonas maltophilia
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F- amarelo
A/F-inalterado

OF-XILOSE
Oxidador
Fermentador
Inalterado

Burkolderia cepacia
Klebsiella pneumoniae
Alcaligenes faecalis*

A-amarelo, F-inalterado
A/F-amarelo
A/F- inalterado

A= tubo aberto; F= tubo fechado com vaselina lquida


Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
* Alcaligenes faecalis ATCC 8750 ou Moraxella catarrhalis ATCC 25238

OPAS/OMS Anvisa/MS 65

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.13.6 Inoculao
Inocular densamente at o fundo do tubo com a agulha bacteriolgica,
colnias provenientes de uma placa de crescimento de 18 a 24 h.
Inocular dois tubos, em um dos tubos acrescentar 1,0 mL de vaselina lquida estril, no outro tubo no colocar vaselina.
Incubar a temperatura de 35C por 48 horas ou mais.
Se resultado negativo, pode ser necessrio at 4 dias, excepcionalmente 14 dias, observando diariamente.
3.13.7 Interpretao
Cor original do meio: verde.
Oxidador: tubo aberto - desenvolvimento de cor amarela.
Tubo fechado - inalterado (verde).
Fermentador: tubo aberto e fechado - desenvolvimento de cor amarela.
Assacaroltico: tubo aberto e fechado - inalterado (verde).
3.13.8 Conservao e validade
Conservar de 4 a 8C por at 6 meses.
3.13.9 Recomendaes
Sempre antes de interpretar a reao verificar se h crescimento nos tubos, porque algumas bactrias no crescem no meio OF, sendo necessrio
enriquecimento do meio, acrescentando 2% de soro de coelho ou cavalo.
Importante deixar tampa frouxa no tubo aberto.

3.14 M.E.V.A.G. (Milieu pour ltude de la voie dattaque ds glucides


-Hugh & Leifson, 1953)
As bactrias podem utilizar os acares por 2 diferentes vias metablicas:
1) Via fermentativa reaes que podem ocorrer na ausncia de oxignio. Os cidos
que se acumulam, como produtos de degradao, abaixam sensivelmente o pH
do meio.
2) Via oxidativa o oxignio do ar obrigatoriamente utilizado, e cidos so formados.
O Mevag usado para o estudo dos acares que so utilizados pelas bactrias
oxidativas. Tambm pode ser utilizado para a determinao da via de ataque da
glicose.

66 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Caldo Comum

50 mL

25 mL

100 mL

KCl

5g

2,5 g

10 g

gar

3g

1,5 g

6g

Vermelho de fenol a 0,2%

10 mL

5 mL

20 mL

H2O destilada q.s.p.

1000 mL

500 mL

2000 mL

Frmula:
pH = 7,6-7,8
Distribuir em frascos.
Extrato de carne

0,5 g

2,5 g

Peptona

1g

5g

NaCl

0,5 g

2g

H2O dest.

100 mL

500 mL

Esterilizar a 121C por 15 min.


Caldo comum
Distribuir em tubos de 12 x 120mm.
Autoclavar a 121C/15 min.
Soluo vermelho de fenol a 0,2%
Vermelho de fenol

0,2 g

H2O destilada estril

100 mL

Utilizar NaOH para uma melhor dissoluo.


Dissolver o vermelho de fenol aos poucos na gua.

3.15 gar TSI Triplo Acar Ferro


3.15.1 Princpio
Este meio contm trs acares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose,
vermelho de fenol para deteco da fermentao de carboidratos e sulfato de ferro para deteco da produo de sulfato de hidrognio (indicado
pela cor preta na base do tubo).
A fermentao indicada pela mudana da cor do indicador de pH de
vermelho para amarelo. O gar fundido deixado solidificar, formando
uma superfcie inclinada.
Essa configurao origina duas cmaras de reao dentro do mesmo tubo.
A poro inclinada ou bico, exposta em toda sua superfcie ao oxignio
atmosfrico, aerbia. A poro inferior, denominada profundidade ou
fundo, est protegida do ar e relativamente anaerbia.

OPAS/OMS Anvisa/MS 67

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

Quando se prepara o meio, importante que o bico e a profundidade


tenham o comprimento igual ao redor de 3 cm cada um, de modo que o
efeito das duas cmaras seja conservado.

3.15.2 Utilidade
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentao de carboidratos, produo de sulfato de hidrognio e gs.
3.15.3 Frmula/Produto
Meio comercial: TSI (trplice acar ferro).
3.15.4 Procedimentos
Pesar o TSI conforme instrues do fabricante.
Ajustar o pH para 7,3 0,2.
Distribuir em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave e inclin-los ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie em forma de bico de flauta (ngulo de 45).
Deixar solidificar em temperatura ambiente.
3.15.5 Controle de qualidade
MICRORGANISMO

ATCC

SUPERFCIE

BASE

H2S

Escherichia coli

25922

cido

cido, gs

Neg

Shigella flexneri

12022

Alcalino

cido

Neg

Edwardsiella tarda

15947

Alcalino

cido

Pos

Pseudomonas aeruginosa

27853

Alcalino

Alcalino

Neg

3.15.6 Inoculao
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas.
Semear por picada at o fundo e na superfcie do meio.
Incubar 24 h a 35C, com a tampa semiaberta.
3.15.7 Interpretao
Cor original do meio: vermelho laranja, levemente opalescente.
Leitura: entre 18 e 24 horas.
Cor prpura = alcalino.
Cor amarelo = cido.
Reaes pice/base:
Prpura/amarelo = fermentao apenas da glicose (lactose e sacarose negativos).

68 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

Amarelo/amarelo = fermentao da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou


3 aucares).
Presena de gs (CO2) = bolhas ou meio fragmentado.
H2S positivo = presena de precipitado negro.
Pos.: positivo; Neg.: negativo; V.: varivel.

3.15.8 Conservao e validade


Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.
PICE

BASE

H2S

GS

Interpretao mais provvel

Vermelho

Vermelho

Neg

Neg

Sem crescimento: bactria exigente

Vermelho

Vermelho

Neg

Neg

Crescimento na superfcie: no fermentador ou Gram +

Amarelo

Vermelho

Neg

Neg

Crescimento na superfcie: Gram + ou esquecimento de picar


a base

Amarelo

Amarelo

Neg

Enterobactrias ou Aeromonas Lac neg

Amarelo

Amarelo

Pos

Salmonella, Proteus, Morganella,

Providncia e Citrobacter

3.15.9 Recomendaes
Quando h produo de HS significa que a base sempre cida.
No realizar leitura com menos de 18 ou mais de 24 horas, podendo resultar
em falsas reaes.
No utilizar alas bacteriolgicas para no fragmentar o meio, ocasionando falsa reao de gs, utilizar fio bacteriolgico.
Qualquer trao de escurecimento no meio deve ser indicado com HS positivo.

3.16 gar Base Uria (Christensen)


3.16.1 Princpio
Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a ureia em duas
molculas de amnia pela ao da enzima urease, resultando na alcalinizao do meio.
3.16.2 Utilidade
Bacilos Gram negativos fermentadores e no fermentadores, Staphylococcus
e Haemophilus.
3.16.3 Frmula/Produto
Meio comercial: gar Base Uria.
Soluo de ureia a 40% (40 g ureia + 100 mL de gua destilada).
OPAS/OMS Anvisa/MS 69

Captulo 3: Meios Comerciais para Provas de Identificao

3.16.4 Procedimentos
Pesar e hidratar o meio de ureia conforme instrues do fabricante.
Esterilizar em autoclave.
Resfriar at 50C e adicionar assepticamente 5 mL da soluo de ureia a
40% em 95 mL do meio base.
Homogeneizar e distribuir 3 mL do meio assepticamente em tubos estreis
com tampa de rosca.
Inclinar os tubos ainda quentes para que solidifiquem com a superfcie
em forma de bico de flauta (ngulo de 45). Deixar solidificar em temperatura ambiente.
Obs.: A soluo de ureia a 40% uma soluo hipertnica e o risco de
contaminao baixo, porm, pode-se esterilizar a soluo por filtrao
(filtro Millipore de 0,22 m).
3.16.5 Controle de qualidade
Esterilidade: colocar 100% do lote preparado na estufa 35 1C por 24
horas. Se no houver mudana de cor liberar para uso.
Positivo: Proteus vulgaris ATCC 13315.
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.
3.16.6 Inoculao
Inocular colnia pura de 18 a 24 horas.
Fazer um inculo denso.
Semear na superfcie do meio, no picar a base, pois a base pode servir
como controle.
Incubar 35C de 6 a 24 horas, podendo ser necessrio at 6 dias.
3.16.7 Interpretao
Cor original do meio: amarelo palha.
Positivo: alterao do meio para cor de rosa, pink.
Negativo: sem alterao de cor do meio.
A) Diferentes graus de hidrlise da ureia podem ocorrer:
Tubo inteiro cor pink.
Superfcie do tubo cor pink, base no muda de cor.
Fracamente positivo: pice cor pink, restante do tubo no muda de cor.
Positivo rpido: 1 6 horas para Proteus spp.
Positivo tardio: 24 horas a 6 dias ou mais tempo de incubao. Ex: algumas cepas de Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Haemophilus.
3.16.8 Conservao e validade
Conservar de 4 a 8C por at 6 meses.
Aps esse perodo realizar controle negativo e positivo semanalmente.
70 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

3.16.9 Recomendaes
No aquecer a soluo base da ureia, pois a ureia pode se decompor se
aquecida.
No utilizar a ureia de Stuart porque menos sensvel para detectar a presena de urease.
No deixar o meio em temperatura ambiente pode ocorrer autohidrlise.

OPAS/OMS Anvisa/MS 71

Captulo 4:
Produtos para Provas de Identificao

Rosngela Aparecida Mendes Silva


Biomdica do Laboratrio de Microbiologia,
Centro Infantil Boldrini / Campinas SP

Maria Carmen Gonalves Lopes


Biloga - Laboratrio Microbiologia, Centro
Infantil Boldrini / Campinas SP

Julia Taeko Utiyama Yoshida


Farmacutica Bioqumica Seo de Meios de
Cultura Instituto Adolfo Lutz So Paulo

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.1 Prova de catalase


4.1.1

Princpio
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em
gua e oxignio.

4.1.2

Utilidade
Para Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Listeria, Corynebacterium, Micrococcus, Bacillus, Moraxella catarrhalis.

4.1.3

Frmula/Produto
Perxido de Hidrognio (H2O2) 3%.

4.1.4

Controle de qualidade
Positivo: cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 ou Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
Negativo: cepa de Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae
ATCC 6305.

4.1.5

Conservao e validade
Perxido de hidrognio deve ser mantido em local seco, ao abrigo de luz
e calor.
Validade: ver recomendaes do fabricante.

4.1.6

Inoculao
Colocar uma gota de perxido de hidrognio (gua oxigenada) 3% sobre
uma lmina.
Com auxlio de fio bacteriolgico, agregar a colnia em estudo na gota de perxido de hidrognio.

4.1.7

Interpretao
Positivo: Presena imediata de bolhas - a produo de efervescncia indica a converso do H2O2 em gua e oxignio gasoso.
Negativo: Ausncia de bolhas ou efervescncia.

4.1.8

Recomendaes
Evitar o uso de meios contendo sangue, pois os eritrcitos podem
produzir reao fraca de catalase.
Para uso de outra cepa de Staphylococcus para o controle positivo, no
usar cepas de Staphylococcus saccharolyticus e Staphylococcus aureus
subsp. anaerobius, pois so catalase negativos.

74 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.2 Prova de coagulase


4.2.1

Princpio
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um cogulo, uma vez que a coagulase uma protena com atividade similar protrombina, capaz de converter o fibrinognio em fibrina,
que resulta na formao de um cogulo visvel.
Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre.
A coagulase conjugada (prova em lmina) tambm conhecida como
fator de aglutinao, encontra-se unida parede celular bacteriana e no
est presente em filtrados de cultivos.
Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma (fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma
de grumos visveis.
A coagulase livre (prova em tubo) uma substncia similar trombina
e est presente em filtrados de cultivos. secretada extracelularmente e
reage com uma substncia presente no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um complexo que, por sua vez,
reage com fibrinognio, formando fibrina (cogulos).
Quando uma suspenso em plasma do microrganismo produtor de coagulase preparada em tubo de ensaio, forma-se um cogulo visvel aps
o perodo de incubao.

4.2.2

Utilidade
Separar as espcies de Staphylococcus de importncia clnica, S. aureus
coagulase positiva, das demais espcies coagulase negativa.

4.2.3

Frmula/Produto
Plasma de coelho com EDTA liofilizado.

4.2.4

Controle de qualidade
Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.

4.2.5

Conservao e validade
Plasma antes e depois de reconstitudo, deve ser mantido refrigerado.
Validade: ver recomendaes do fabricante.

OPAS/OMS Anvisa/MS 75

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.2.6

Inoculao
A) Coagulase conjugada:
Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro.
Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estreis
dentro de cada crculo.
Com auxlio de um fio bacteriolgico agregar a colnia em estudo, homogeneizando delicadamente em cada crculo.
Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos
crculos.
No outro crculo, adicionar outra gota de gua destilada ou soluo
fisiolgica estreis, como controle.
Homogeneizar com palito de madeira.
Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs.
Observar presena de aglutinao.
B) Coagulase livre:
Com auxlio do fio bacteriolgico, suspender colnias em estudo em
caldo BHI e colocar em estufa 37C at que turve.
Se necessrio, acertar a turbidez at 0,5 da escala de MacFarland.
Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5 mL de plasma reconstitudo e
0,5 mL do caldo BHI com crescimento bacteriano recm turvado.
Incubar em estufa 35C 4 horas.
Verificar se h presena de cogulo.
Se no houver presena de cogulo, incubar o tubo em temperatura
ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubao.

4.2.7

Interpretao
A) Coagulase conjugada:
Positiva: formao de precipitado branco e aglutinao dos microrganismos da suspenso, aps 15 segundos, no crculo que contm o
plasma.
Negativa: ausncia de aglutinao no crculo que contm o plasma.
Controle sem plasma: dever ser leitoso e uniforme, sem presena de precipitado ou aglutinao.
A presena de precipitado ou aglutinao torna a prova inespecfica, devendo ser repetida a prova em tubo.
B) Coagulase livre:
Positiva: presena de qualquer grau de cogulo.
Negativa: ausncia de cogulo.

76 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.2.8

Recomendaes
Para a coagulase em tubo, as provas negativas aps 4 horas a 37C, os
tubos devem ser mantidos em temperatura ambiente, pois a incubao
prolongada a 37C podem produzir fibronolisinas, o que causa dissoluo
do cogulo durante a incubao.
Durante a leitura inclinar o tubo delicadamente e no agitar, pois a agitao pode desmanchar os cogulos parcialmente formados.
Recomenda-se o uso de plasma de coelho com EDTA.
No utilizar plasma citratado, pois os microrganismos capazes de metabolizar o citrato (como os Enterococcus), daro resultados positivos se, forem confundidos com estafilococos.
Plasma humano no recomendado, pois contm quantidades variadas
de Fator de Reao com a Coagulase e de anticorpos antiestafilococos,
podendo dar uma prova falso/negativa.

4.3 Prova de gelatinase


4.3.1

Princpio
Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolticas (gelatinase) que liquefaz/hidrolisa gelatina.

4.3.2

Utilidade
Identificar e classificar bactrias fermentadoras, no fermentadoras e
bacilos Gram positivos esporulados.

4.3.3

Frmula/Produto
Filme no revelado de Raio X.
Salina 0,9 % estril ou gua destilada estril.

4.3.4

Procedimentos
Cortar a fita de filme de Raio X em tamanhos de aproximadamente 5 mm
X 1 cm.
Armazenar em frasco estril.

4.3.5

Controle de qualidade
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922.

4.3.6

Inoculao
Em um tubo 13 x 100 mm, colocar 1,0 mL de salina 0,9% estril ou gua
destilada estril.
OPAS/OMS Anvisa/MS 77

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

Com o auxlio de uma ala bacteriolgica, fazer um inculo denso da bactria a ser testada, adicionar uma fita de Raio x. Fazer o inculo de colnias
de crescimento de 18 a 24 horas.
Realizar um tubo controle, com salina 0,9% estril ou gua destilada estril e a fita de Raio X, sem inculo.

4.3.7

Interpretao
Positivo: emulso de gelatina (cor verde) na poro submersa do filme torna-se transparente (clara).
Negativo: fita permanece verde, emulso esverdeada permanece na poro submersa do filme.

4.3.8

Conservao e validade
Fitas: seguir instrues do fabricante.

4.3.9

Recomendaes
Utilizar filme de Raio X no revelado.

4.4 Prova de Lecitinase


4.4.1

Princpio
Cepas produtoras de lecitinase produzem zona opaca ao redor do inculo.

4.4.2

Utilidade
Diferenciao de espcies de Bacillus e Clostridium.

4.4.3

Frmula/Produto
A) Frmula - meio base:
Gema de ovo de galinha depende do volume de meio base a ser utilizado
Proteose de peptona n 2 40 g
Fosfato dissdico 5 g
Fosfato de potssio 1 g
Cloreto de sdio 2 g
Sulfato de magnsio 0,1 g
Glicose 2 g
Soluo de hemina (5 mg/mL) 1 mL
gar 20 g
gua destilada 1000 mL
pH: 7,6

78 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

B) Soluo de gema de ovo a 50%:


Gema de ovo 1 mL
Soluo fisiolgica estril 1 mL
4.4.4

Procedimentos
A) Meio base:
Pesar e hidratar todos os componentes, exceto a soluo de gema de ovo.
Aquecer em bico de Bunsen at fundir o gar.
Distribuir 20 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
B) Meio para uso:
Resfriar a 50C e adicionar 1 mL da soluo de gema de ovo a 50%.
Homogeneizar bem e distribuir em placas de Petri de 90 mm.

4.4.5

Controle de qualidade
Positivo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens ATCC 13124.
Negativo: Bacillus subtilis ATCC 6633, Clostridium difficile ATCC 9689.

4.4.6

Conservao e validade
Meio base (para estoque): 4 a 8C fechado, durante 6 meses.
Meio para uso: 4 a 8C, embalado, durante 1 semana.

4.4.7

Inoculao
Com auxlio de um fio bacteriolgico, tocar nas colnias em estudo e fazer
um esfregao circular e denso sobre a superfcie do meio.
Incubar 37C 24 horas em aerobiose - para cepas de Bacillus spp.
Incubar 37C 48 horas em anaerobiose - para cepas de Clostridium spp.

4.4.8

Interpretao
Cor original do meio: amarelo.
Positivo: formao de halo branco ao redor das colnias.
Negativo: ausncia de halo, meio fica inalterada.

4.4.9

Recomendaes
No usar ovos velhos.
No usar meio vencido.

OPAS/OMS Anvisa/MS 79

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.5 Prova de oxidase


4.5.1

Princpio
O teste de oxidase baseado na produo intracelular da enzima oxidase
pela bactria.

4.5.2

Utilidade
Ajuda caracterizar espcies de Neisseria e diferenciar no fermentadores
(oxidase positiva) de enterobactrias (oxidase negativa). Diferencia algumas bactrias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.

4.5.3

Frmula/Produto
Reativo para teste de oxidase preparado no laboratrio:
N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato 1g
gua destilada 100 mL
Tiras impregnadas com o reativo (comercial pronto para uso).
Reativo de oxidase em ampolas (comercial pronto para uso), para ser revelado
em papel de filtro.

4.5.4

Procedimentos
A) Reativo para teste de oxidase:
Pesar 1g. de N,N,N,N-tetrametil-p-fenileno diamina mono-hidrocloridrato em um Bquer e adicionar 100 mL gua destilada, vagarosamente para no oxidar a soluo.
Colocar o papel de filtro cortado em tiras dentro do Bquer com o reativo.
Deixar o papel de filtro absorver o reativo. Desprezar o reativo que sobrou.
Colocar o papel na estufa a 35 1C para secar. Deixar o papel pendurado sobre um Bquer para juntar o excesso de reativo.
Cortar a fita em tamanhos menores e guardar em frasco escuro.
Obs.: No utilizar luvas para fazer o procedimento de preparo e corte das
fitas.

4.5.5

Controle de qualidade
Positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (desenvolvimento de cor
roxa).
Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 (sem alterao da cor).

80 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.5.6

Inoculao
Com auxlio de um palito de madeira ou plstico, espalhar a colnia a
ser testada sobre a fita de oxidase.
Observar se h formao de cor roxa de imediato.

4.5.7

Interpretao
Cor original: branca ou levemente azulada.
Oxidase positiva: produo de cor roxa imediatamente no local da inoculao da bactria.
Oxidase negativa: no h mudana da cor do papel no local da inoculao
da bactria.
No considerar alterao de cor tardia.

4.5.8

Conservao e validade
Fitas: 3 meses, quando conservadas em frasco escuro de 4 a 8C.
Reativo: deve ser preparado no momento de impregnar as fitas.

4.5.9

Recomendaes
No fazer o teste de colnias de crescimento de meios que contenham
glicose, a fermentao inibe a atividade da oxidase, podendo resultar em
falso negativo.
No fazer teste de oxidase de colnias de crescimento de meios seletivos (Mac
Conkey, XLD, EMB).
No usar ala ou agulha porque pode conter traos de ferro, podendo
oxidar a fita e resultar em falso positivo.
Utilizar colnias de meios no seletivos tais como: gar sangue e gar
chocolate.
Os reagentes para oxidase, se auto oxidam rapidamente com o ar, perdendo a sensibilidade.
No cortar o papel de filtro com tesoura, pois podem conter traos de
ferro.

4.6 Fermentao de carboidratos


4.6.1

Princpio
A fermentao de carboidratos amplamente utilizada para a diferenciao de gneros e identificao de espcies bacterianas.
A prova consiste em verificar a capacidade de o microrganismo fermentar
ou no um determinado carboidrato, permitindo assim verificar as suas
caractersticas que auxiliaram na identificao.

OPAS/OMS Anvisa/MS 81

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.6.2

Utilidade
Identificar e separar espcies de Enterococcus spp., Streptococcus spp. e
Staphylococcus coagulase negativa.

4.6.3

Frmula/Produto
Produto: Caldo para fermentao de carboidratos.
Carboidratos mais utilizados: arabinose, sorbitol, rafinose, trealose, manitol, entre outros.
Frmula (base): (O BHI caldo comercial o Brain Heart Infusion Broth que
contm glicose na sua composio. Usar o termo BHI caldo sem glicose
ou HIB-Heart Infusion Broth que so os caldos indicados para prova de
fermentao de carboidratos):
BHI caldo 22,5 g
Carboidrato 10 g
Indicador * 1 mL gua destilada 200 mL
gua destilada 900 mL
* Indicador prpura de bromocresol:
Prpura de bromocresol 1,6 g
Etanol a 95% 100 mL
Meio comercial: Caldo Base Vermelho de Fenol.

4.6.4

Procedimentos (meio comercial):


Esterilizar os carboidratos, separadamente, por filtrao e reservar.
Pesar o BHI em bquer, acrescentar a gua e homogeneizar bem.
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Adicionar o indicador e homogeneizar novamente.
Esterilizar em autoclave.
Aps esfriar a base, adicionar o carboidrato esterilizado por filtrao.
Distribuir 3 mL por tubo.

4.6.5

Controle de qualidade

CARBOIDRATOS

POSITIVO

NEGATIVO

Arabinose

Enterococcus faecium

Enterococcus faecalis

Rafinose

Enterococcus casseliflavus

Enterococcus faecalis

Sorbitol

Enterococcus faecalis

Enterococcus gallinarum

Maltose

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus schleiferi

Trealose

Staphylococcus lugdunensis

Staphylococcus epidermidis

4.6.6

Conservao e validade
Conservar entre 4 a 10 C por 3 meses.

82 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.6.7

Inoculao
Dissolver as colnias no caldo.
Incubar 35C 24 horas.

4.6.8

Interpretao (meio comercial):


Cor original do meio: prpura.
Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo.
Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao.
Cor original do meio: alaranjado.
Positivo: crescimento bacteriano (turvao do meio) com viragem do indicador para amarelo.
Negativo: ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original,
alaranjado e sem turvao.

4.6.9

Recomendaes
Para provas negativas, incubar um perodo maior (48 horas).
No autoclavar a base com o carboidrato, pois a alta temperatura pode degradar o carboidrato.

4.7 Prova PYR


4.7.1

Princpio
A prova de hidrlise PYR um teste enzimtico que consiste na hidrlise
do substrato L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide por uma enzima bacteriana,
a L-pyroglutamyl-aminopeptidase. A hidrlise do substrato libera -naphtylamide, que detectada com a adio do reagente, o N,N dimetilaminocinamaldedo, que forma uma base de Schiff, de colorao vermelha.

4.7.2

Utilidade
Teste presuntivo para identificar Streptococcus beta hemoltico presumvel
do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) e Enterococcus spp.
Identificao de algumas espcies Staphylococcus coagulase negativa.
Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.

4.7.3

Frmula/Produto
Teste comercial: PYR test.
Frmula - Caldo base de PYR (caldo de Todd-Hewitt):
Mod IV - 50
BHI caldo 500 g
OPAS/OMS Anvisa/MS 83

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

Neopeptona 20 g
Dextrose 2 g
Cloreto de sdio 2 g
Fosfato dissdico 0,4 g
Carbonato de sdio 2,5 g
gua destilada 1000 mL
Para cada 100 mL de caldo base, adicionar 0,01 mL de L-pyrrolidonyl-alfanaftylamide.
Reagente de PYR comercial: N,N-dimetilaminocinamaldedo a 0,01%.

4.7.4

Procedimentos
Pesar os componentes em bquer.
Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo.
Adicionar o L-pyrrolidonyl-alfa-naftylamide e homogeneizar novamente.
Distribuir 0,2 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.

4.7.5

Controle de qualidade
Positivo: Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield
(S. pyogenes ATCC 19615) ou Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae.

4.7.6

Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
Comercial: ver instrues do fabricante

4.7.7

Inoculao
Dissolver as colnias no caldo OU.
No caso de usar kits comerciais, com auxlio de uma pina flambada, colocar um disco impregnado com o substrato de PYR sobre as colnias em
estudo recm-isoladas.
Incubar 37C por 4 horas; ver instrues do fabricante de produtos comercializados.
Adicionar 1 gota do reagente PYR (se caldo) OU.
Retirar o disco e colocar sobre uma lmina e adicionar 1 gota do reagente
PYR.

4.7.8

Interpretao
Positivo: Desenvolvimento de cor vermelho cereja em 1 minuto (aps adicionar
o reagente de PYR).
Negativo: Sem alterao de cor (permanece amarela ou alaranjada).

84 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.7.9

Recomendaes
Para identificaes presuntivas do Streptococcus pyogenes ou de Enterococcus spp., confirmar se realmente so cocos Gram positivos/catalase
negativos, pois algumas cepas de Staphylococcusspp., Aerococos e Arcanobacterium haemolyticum, podem ser PYR positivos.
Raras cepas de Enterococcus spp. podem ser catalase positiva, confirmar
com outras provas (como blis esculina) tratar de enterococo ou no.
No utilizar colnias com crescimento superior a 24 horas, culturas velhas
podem dar resultado falso - negativo.
No exceder o tempo de leitura.

4.8 Crescimento a 42 E 44C


4.8.1

Princpio
Verificar a capacidade de o microrganismo crescer em altas temperaturas.

4.8.2

Utilidade
Identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.

4.8.3

Frmula/Produto
Meio comercial: Caldo BHI (infuso de crebro e corao).
Indicador prpura de bromotimol (1,6 g de do indicador em 100 mL de
lcool etlico 95%).

4.8.4

Procedimentos
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Distribuir 3,0 mL em tubos com tampa de rosca.
Acrescentar o indicador prpura de bromotimol (1 mL de indicador em
1000 mL de meio).
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave e deixar esfriar em temperatura ambiente.

4.8.5

Controle de qualidade
Temperatura 42C: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Temperatura 44C: Acinetobacter baumannii.

4.8.6

Inoculao
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular a colnia a ser
testada.
Realizar o teste com colnias puras de 18 a 24 horas.
Incubar em banho maria na temperatura a ser testada, 42C ou 44C.
OPAS/OMS Anvisa/MS 85

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.8.7

Interpretao
Cor original do meio: prpura.
Positivo: presena de turvao e viragem do indicador de cor prpura
para amarelo = crescimento bacteriano.
Negativo: ausncia de turvao e permanncia da cor prpura = ausncia
de crescimento bacteriano.

4.8.8

Conservao e validade
Conservar por at 6 meses de 2 a 8C.

4.8.9

Recomendaes
No fazer inculo muito denso, pode resultar em falsa turvao.
Importante o controle da temperatura do banho, com termmetro de
mxima e mnima.

4.9 Teste de motilidade


4.9.1

Princpio
A bactria mvel atravs do seu flagelo. Flagelos ocorrem nos bacilos
Gram negativos, poucas formas de cocos so mveis. A bactria pode
conter um ou muitos flagelos e sua localizao varia com a espcie da
bactria e as condies de cultura.

4.9.2

Utilidade
Determinar se o microrganismo ou no mvel.
Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade),
MILI (Motilidade, Indol, Lisina), MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados
para testes enterobactrias.
Meio motilidade em caldo utilizado para no fermentadores e Enterobacter cloacae (em casos de dvidas).

4.9.3

Frmula/Produto
Meio comercial: Motilidade
Meio comercial: SIM
Meio comercial: MILI
Meio comercial: MIO
Meio Comercial: BHI (brain heart infusion)
Meio Comercial: Triptona
Soluo de Vermelho de Tetrazlio.

86 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.9.4

Procedimentos
A) Meio Motilidade:
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao, at fundir o meio.
Distribuir aproximadamente 2,0 mL em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
B) Meio Motilidade com adio da soluo de Vermelho de Tetrazlio:
Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao, at fundir o meio.
Adicionar 0,1 mL para cada 100 mL de base de soluo de vermelho de
tetrazlio 0,1% e homogeneizar bem.
Distribuir aproximadamente 2,0 mL em tubos com tampa de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
C) Meio SIM/Meio MILI/Meio MIO
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao, at fundir o meio.
Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampa de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar solidificar em temperatura ambiente na posio vertical.
D) Caldo BHI (motilidade em caldo)
Pesar e hidratar o meio conforme instrues do fabricante.
Distribuir 3,0 mL em tubos com tampa de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar esfriar em temperatura ambiente.
E) Meio Caldo Triptona
Pesar e hidratar conforme instrues do fabricante.
Aquecer sob agitao, at fundir o meio.
Distribuir aproximadamente 3,0 mL em tubos com tampas de rosca.
Esterilizar em autoclave.
Retirar os tubos da autoclave.
Deixar esfriar em temperatura ambiente.
OPAS/OMS Anvisa/MS 87

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

4.9.5

Controle de qualidade
A) Meio Motilidade:
Positivo: Escherichia coli ATCC 25922.
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
B) Meio SIM:

MICRORGANISMO

H2S

INDOL

MOTILIDADE

Proteus vulgaris

Pos

Pos

Pos

Shigella sonnei

Neg

Neg

Neg

Escherichia coli

Neg

Pos

Pos

Proteus vulgaris ATCC 13315, Shigella sonnei ATCC 25931, Escherichia


coli ATCC 25922.

C) Meio MIO:
MICRORGANISMO

MOTILIDADE

INDOL

ORNITINA

Escherichia coli

Pos

Pos

Pos

Enterobacter aerogenes

Pos

Neg

Pos

Klebsiella pneumoniae

Neg

Pos

Neg

Eschericha coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883.

D) Meio MILI:
MICRORGANISMO

CRESCIMENTO

LISINA

MOTILIDADE

INDOL

Escherichia coli

Denso

Pos

Pos

Neg

K. pneumoniae

Denso

Pos

Neg

Neg

P. alcalifaciens

Denso

Neg

Pos

Neg

S. enteritidis

Denso

Pos

Pos

Neg

S. flexneri

Denso

Neg

Neg

Neg

E. coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Providencia alcalifaciens ATCC 9886, Salmonella enteritidis.
ATCC 13076, Shigella flexneri ATCC 12022.

E) Meio BHI/Caldo Triptona:


Positivo: Escherichia coli ATCC 25922.
Negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Negativo: meio sem inocular.
88 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.9.6

Inoculao
A) Meio Motilidade/Meio SIM/Meio MILI/Meio MIO
Com o auxlio de um fio bacteriolgico inocular uma colnia pura de
18 24 horas, no meio na posio vertical, lentamente at a base.
Afastar a agulha seguindo a linha inicial da incubao.
Incubar a 35C por 18-24 horas.
B) Meio Caldo BHI/Meio Caldo Triptona
Com o auxlio de uma ala ou fio bacteriolgico, inocular colnia pura
de 18 a 24 horas.
Incubar a 352C por 24 a 48 horas.

4.9.7

Interpretao
A) Meio de Motilidade:
Motilidade positiva: organismos mveis migram pela linha do inculo e
difundem-se no meio, causando turbidez.
Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao longo da linha de inculo, em volta continua lmpido.
B) Meio de Motilidade com Tetrazlio:
Motilidade positiva: organismos mveis produzem uma nuvem cor
pink e difundem-se completamente no meio.
Motilidade negativa: h crescimento da bactria e produo de cor vermelho claro na linha do inculo e em volta do meio continua lmpido.
Se resultado for negativo incubar a 21-25C por at 5 dias.
C) Revelao com reativo de Kovacs no meio SIM:
Realizar a leitura da motilidade e do H2S.
Em seguida adicionar 5 gotas do reativo de Kovacs pela parede do
tubo no meio contendo o crescimento bacteriano. Agitar o tubo suavemente e proceder a leitura do indol.
Motilidade positiva: microrganismos mveis migram pela linha do
inculo e difundem-se no meio causando turbidez.
Motilidade negativa: bactria tem um crescimento acentuado ao
longo da linha do inculo, em volta continua lmpido.
HS positivo: ao longo da linha de inoculao aparecer a cor negra.
HS negativo: linha ao longo da inoculao inalterada.
Indol positivo aparecer um anel vermelho.
Indol negativo permanecer um anel amarelo (cor original do reativo de Kovacs).
OPAS/OMS Anvisa/MS 89

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

D) Meio MILI:
Interpretar as reaes da motilidade e lisina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol.
Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta
do inculo.
Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo.
Lisina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio
(essa cor pode variar de intensa ou mais leve, de acordo com a reduo do indicador).
Lisina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela do meio.
Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps
a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio
e agitao suave no tubo.
Indol negativo: reao negativa indicada pelo desenvolvimento
de cor amarela.
E) Meio MIO:
Interpretar as reaes da motilidade e ornitina antes da adio do reagente de Kovacs para deteco do indol.
Motilidade positiva: indicado pelo crescimento na linha e em volta
do inculo.
Motilidade negativa: crescimento somente na linha do inculo.
Ornitina decarboxilase positiva: indicado pela cor prpura no meio.
Ornitina decarboxilase negativa: indicado pela cor amarela no meio.
Indol positivo: indicado pela formao de cor pink/vermelho, aps
a adio de 3 a 4 gotas de reagente de Kovacs na superfcie do meio
e agitao suave no tubo.
Indol negativo: reao negativa indicada pelo aparecimento da
cor amarela.
F) Meio caldo BHI/Meio Caldo Triptona:
Colocar uma gota do meio entre lmina e lamnula e observar ao microscpio com objetiva de 40 X. A motilidade verdadeira deve ser diferenciada do movimento browniano, verificando que o microrganismo se desloca em vrias direes.
Motilidade positiva: bactrias se movendo de um lado para outro.
Motilidade negativa: bactria apresenta somente movimento
browniano.
4.9.8

Conservao e validade
Meios motilidade, SIM, MILI, MIO e BHI: conservar de 4 a 8 C por at 3
meses.

90 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

4.9.9

Recomendaes
A temperatura de incubao extremamente crtica, porque muitos microrganismos so mveis a 15-25C e no mveis a 37C. Se houver suspeita que o microrganismo pode exibir motilidade em baixa temperatura, inocular dois tubos simultaneamente, incubando um a 35C e outro a
temperatura ambiente 22-25C.
Uso do sal de tetrazlio no meio de motilidade desejvel, mas pode inibir certos microrganismos fastidiosos.
Flagelo o rgo locomotor e composto de protena, essa protena
pode se desnaturar com excesso de calor. Por isso cultura testada em temperaturas acima do indicado para o teste de motilidade pode fornecer um
resultado falso negativo.
Flagelo pode ser destrudo tambm sob agitao violenta do tubo de
cultura da bactria, podendo produzir um resultado de motilidade fraco
positivo ou falso negativo.
Microrganismos mantidos em estoques de cultura em meios artificiais
por longos perodos tendem a perder sua motilidade.
Os testes de motilidade em anaerbios so difceis de serem interpretados, sendo significativos apenas os resultados positivos.

4.10 Prova de tolerncia ao NaCl 6,5%


4.10.1 Princpio
A tolerncia ao NaCl a 6,5% uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presena do sal.
Meio base utilizado o BHI caldo, que um meio nutritivo de uso geral,
empregado para o cultivo de muitas bactrias. Esse meio normalmente
contm 0,5 % de NaCl e aumenta-se a concentrao para 6,5 %, tornando
um meio semi-seletivo para o desenvolvimento de alguns microrganismos.
4.10.2 Utilidade
Separa Enterococcus spp., que so NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que so NaCl 6,5% negativos.
Na identificao de bacilos Gram negativos no fermentadores.
4.10.3 Frmula/Produto
No h meio pronto para uso.
Frmula:
BHI caldo 25 g
NaCl 60 g
OPAS/OMS Anvisa/MS 91

Captulo 4: Produtos para Provas de Identificao

Indicador * 1 mL
Glicose 1 g
gua destilada 1000 mL
* Indicador prpura de bromocresol:
Prpura de bromocresol 1,6 g
Etanol a 95% 100 mL
Observao: o uso de indicador opcional.

4.10.4 Procedimentos
Pesar o BHI, o NaCl e a glicose em um bquer.
Adicionar a gua e homogeneizar bem at completa dissoluo.
Adicionar o indicador e homogeneizar novamente.
Distribuir 3 mL por tubo.
Esterilizar em autoclave.
4.10.5 Controle de qualidade
Positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Enterococcus faecium.
Negativo: Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae
ATCC 6305.
4.10.6 Conservao e validade
Conservar embalado de 4 a 8C por at 3 meses.
4.10.7 Inoculao
Dissolver as colnias no caldo.
Incubar.
4.10.8 Interpretao
Cor original do meio: amarelo ou prpura (dependendo do uso do indicador na composio).
Positivo: Crescimento bacteriano (turvao do meio) com ou sem viragem do indicador.
Negativo: Ausncia de crescimento. O meio permanece com a cor original, prpura e sem turvao.
4.10.9 Recomendaes
Provas negativas com 24 horas de incubao, recomenda-se perodo de incubao maior (48 horas).
Verificar a quantidade de NaCl contido na frmula do meio de BHI, pois a
concentrao poder ser outra, dependendo do fabricante do meio, e a
concentrao final do meio de NaCl a 6,5 % poder ser superior ou inferior
concentrao desejada.
92 OPAS/OMS Anvisa/MS

Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

No carregar no inculo, pois o excesso poder ser interpretado como


crescimento e dar resultados falso - positivos (para os meios utilizados
sem o indicador).
Antes da leitura, agitar delicadamente o tubo, pois pode haver sedimentao das clulas bacterianas formadas; Os Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo B de Lancefield (S. agalactiae) e ocasionalmente os
Streptococcus beta hemoltico presumvel do grupo A de Lancefield (S. pyogenes) podem ser tolerantes ao NaCl 6,5%. Utilizar outras provas para confirmar a identificao destas espcies.

OPAS/OMS Anvisa/MS 93

Captulo 5:
Discos para Identificao

Rosngela Aparecida Mendes Silva


Biomdica do Laboratrio de Microbiologia,
Centro Infantil Boldrini / Campinas SP

Maria Carmen Gonalves Lopes


Biloga - Laboratrio Microbiologia, Centro
Infantil Boldrini / Campinas SP

Julia Taeko Utiyama Yoshida


Farmacutica Bioqumica Seo de Meios de
Cultura Instituto Adolfo Lutz So Paulo

Captulo 5: Discos para Identificao

5.1 Bacitracina
5.1.1

Princpio
Streptococcus beta hemoltico do grupo A so sensveis a concentraes
baixas de bacitracina.

5.1.2

Utilidade
Identificao presuntiva de Streptococcus beta hemoltico do grupo A (S.
pyogenes).

5.1.3

Produto
Discos de bacitracina de 0,04 unidades/disco.

5.1.4

Controle de qualidade
Positivo (Sensvel): Streptococcus pyogenes ATCC 19615.
Negativo (Resistente): Streptococcus agalactiae ATCC 13813.

5.1.5

Conservao e validade
Manter 4C.
Validade: ver recomendaes do fabricante.

5.1.6

Inoculao
A partir de caldo BHI ou TSB recm-turvado, semear na superfcie do meio
Mueller hinton sangue, com auxlio do swab.
Colocar um disco de bacitracina e pressionar levemente.
Incubar 35C 18 a 24 horas.

5.1.7

Interpretao
Positivo (Sensvel): Presena de qualquer halo ao redor do disco.
Negativo (Resistente): ausncia de halo ao redor do disco.

5.1.8

Recomendaes
Streptococcus alfa hemolticos so sensveis a baixas concentraes de bacitracina.
No existem dados disponveis que indiquem a necessidade de medir os
halos de inibio.
O inculo bacteriano deve ser confluente, inculo muito diludo pode
permitir que os Streptococcus no pertencentes ao grupo A paream sensveis bacitracina.

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Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

5.2 Novobiocina
5.2.9

Princpio
Separa espcies de Staphylococcus coagulase negativa que podem
ser sensveis ou no a Novobiocina.

5.2.10 Utilidade
Separa cepas de Staphylococcus saprophyticcus (Novobiocina resistente)
das demais cepas de Staphylococcus coagulase negativa de importncia
clnica.
5.2.11 Frmula/Produto
Discos de Novobiocina de 5 g.
5.2.12 Controle de qualidade
Positivo: Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305.
Negativo: Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
5.2.13 Conservao e validade
Refrigerado.
Validade: ver recomendaes do fabricante.
5.2.14 Inoculao
Preparar uma suspenso do microrganismo em estudo com crescimento recente (at 24 horas) em caldo BHI, TSA ou soluo fisiolgica estril,
acertando a turvao na escala 0,5 de MacFarland.
Com auxlio de um swab, semear na superfcie de uma placa de gar
Mueller Hinton.
Com uma pina previamente flambada, colocar um disco de Novobiocina
na superfcie do meio e pressionar delicadamente.
Incubar.
5.2.15 Interpretao
Resistente: Ausncia de halo de inibio ou halos <= 15 mm.
Sensvel: Presena de halo de inibio igual ou superior a 16 mm.
5.2.16 Recomendaes
No usar cepas velhas (com crescimento superior a 24 horas) para fazer a
suspenso.
Se necessrio usar cepas velhas, semear em caldo BHI ou TSA e incubar
37C at turvar, acertar a turvao na escala 0,5 de MacFarland para fazer
o teste.
OPAS/OMS Anvisa/MS 97

Captulo 5: Discos para Identificao

Cepas isoladas de outros materiais biolgicos que no urina, fazer identificao complementar com fermentao de acares para confirmar espcie.

5.3 Optoquina
5.3.1

Princpio
Cloridrato de etil-hidroxicuprena (optoquina), um derivado da quinina,
inibe de forma seletiva o crescimento de Streptococcus pneumoniae em
concentraes muito baixas (5 g/mL ou menores).
As clulas do Streptococcus pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise,
devido variao da tenso superficial, e produzida uma rea de inibio.

5.3.2

Utilidade
Separa Streptococcus pneumoniae dos demais Streptococcus alfa hemolticos.

5.3.3

Frmula/Produto
Discos de optoquina de 5 g

5.3.4

Controle de qualidade
Positivo (Sensvel): Streptococcus pneumoniae ATCC 6305.
Negativo(Resistente): Enterococcus faecalis ATCC 29212.

5.3.5

Conservao e validade
Manter 4C.
Validade: ver recomendaes do fabricante.

5.3.6

Inoculao
A partir de caldo BHI ou TSB recm-turvado, semear na superfcie do meio
Mueller hinton sangue, com auxlio do swab.
Colocar um disco de optoquina e pressionar levemente.
Incubar 35C 18 a 24 horas em jarra com vela acesa ou estufa com 5 a 7
de CO2.

5.3.7

Interpretao
Positivo (Sensvel):
Disco de 6 mm: halo de inibio de 14 mm ou mais.
Disco de 10 mm: halo de inibio de 16 mm ou mais.
Negativo (Resistente):

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Mdulo 5: Tecnologia em Servios de Sade: descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos

5.3.8

Disco de 6 mm: halo de inibio inferior 14 mm ou ausncia de halo.


Disco de 10 mm: halo de inibio inferior 16 mm ou ausncia de halo.

Recomendaes
A optoquina pode inibir outros Streptococcus do grupo viridans, mas apenas em concentraes muito elevadas.

Referncias
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clinical microbiology. 5th Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1991.
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Ed., United States of America, 1988.
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American Society for Microbiology, 1994.
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Co., Baltimore, 2000.
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Ministrio da Sade, Fundao Nacional de Sade, Centro de Referncia Professor Hlio
Fraga.Manual de bacteriologia da tuberculose. 2a. Ed., Rio de Janeiro, 1994.
Murray, P.R., Baron, J.E., Pfaller, A.M., Tenover, C.F. and Yolken, H.R. Manual of clinical
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