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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN

MARCOS
Universidad del Per, DECANA DE AMRICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
Departamento Acadmico de Qumica Bsica y
Aplicada

QUMICA ANALTICA INSTRUMENTAL

Titulacin de cido ascrbico presente en Berberis


flexulosa ayrampo por Iodometra

Profesora:
Dra. Norma Anglica Carlos Casas

Alumnos:
Chipana Lujn, Jaime Roberto
Limay De La Cruz, Edwin Carlos
Surez Su, Luis Alfredo
Lima

2015

Proyecto de investigacin de Qumica Analtica Instrumental


Cuantificacin de cido ascrbico en extracto de Berberis flexulosa por Iodometra

I.-Introduccin
Determinacin de vitamina C
El cido ascrbico o vitamina C (C6H8O6) se puede determinar por medio de una
titulacin yodomtrica. La vitamina C es un agente reductor suave que reacciona
rpidamente con el in
-

triyoduro, en esta prctica se genera un exceso conocido de ion triyoduro (I3 ) por
reaccin de
yodato con yoduro, se deja reaccionar y luego el exceso de I3
- se titula por retroceso con una
solucin de tiosulfato. El mtodo se basa en las siguientes reacciones:

8I- + IO3- + 6H+ 3I3- + 3H2O


C6H8O6 + I3- + H2O C6H8O7 + 2H+ + 3Icido ascrbico

cido deshidroascrbico

I3- + 2(S2O3)-2 3I- + (S4O6)-2


Tiosulfato

tetrationato

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Cuantificacin de cido ascrbico en extracto de Berberis flexulosa por Iodometra

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Cuantificacin de cido ascrbico en extracto de Berberis flexulosa por Iodometra

Volumetra de oxidacin - reduccin con yodo.


El potencial estndar de reduccin para la reaccin: I2 + 2e- 2I- es 0.535 V. Las
sustancias con potencial de reduccin bastante inferior al del sistema yodo - yoduro
son oxidadas por el I2 y pueden valorarse con una solucin patrn de yodo. Estas
volumetras redox llamadas yodimtricas o directas, se utilizan para determinar
agentes reductores.
El yoduro I- se oxida a I2 ejerciendo una accin reductora sobre los sistemas
fuertemente oxidantes con formacin de una cantidad equivalente de yodo. El yodo
liberado se titula con la solucin valorada de tiosulfato de sodio Na2S2O3. Estas
volumetras se llaman yodomtricas o indirectas y se utilizan para determinar agentes
oxidantes.
8.2.1.1 Volumetras redox yodomtricas o indirectas. Las reacciones generales para
determinar un agente oxidante (Ag. Oxidante) mediante volumetra yodomtrica son:
Ag. Oxidante + I- (exceso) Ag. Reductor + I2

I2 + 2S2O3= 2I- + 2S4O6=


El yoduro I- que se adiciona como NaI o KI, se encuentra en exceso y no es una solucin
patrn. El I2 formado en la primera reaccin es equivalente a la cantidad de agente
oxidante contenida en la muestra que se analiza. El I 2 liberado se titula con una
solucin patrn de un reductor, entre los cuales el Na2S2O3 es el ms utilizado.
Las valoraciones deben efectuarse en el menor tiempo posible con el fin de evitar que
el I- sea oxidado por el oxgeno del aire. Cuando sea necesario dejar la reaccin
durante algn tiempo, se debe desalojar el aire del recipiente, para lo cual se utiliza un
gas inerte como CO2 o NO2. La adicin de NaHCO3 a la solucin cida que se valora,
proporciona CO2.
Las reacciones estn afectadas adems por la luz, por lo cual el erlenmeyer donde se
realiza la titulacin se coloca en la oscuridad.
Como los vapores de yodo pueden perderse fcilmente, se acostumbra tapar el
recipiente utilizando un tapn de vidrio. Cuando se determina un oxidante mediante
reacciones con yodo, el punto final se alcanza cuando desaparece el color amarillo de
la solucin. Se aprecia mejor este punto si se aade una solucin de almidn, que
forma con el yodo un complejo de color azul oscuro. El punto final se alcanza cuando
desaparece el color azul, al agregar un ligero exceso de Na2S2O3. El indicador almidn
se aade cuando se ha consumido la mayor parte del yodo. Si se aade demasiado
pronto, el I- se absorbe sobre el indicador y se llega muy lentamente al punto final,
siendo muy difcil detectarlo.

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Preparacin y valoracin de la solucin patrn de tiosulfato de sodio.
La solucin patrn se prepara por el mtodo indirecto porque el tiosulfato de sodio es
una sal higroscpica; se le agrega una pequea cantidad de hidrxido de sodio, dada la
inestabilidad de la solucin en medio cido.
El tiosulfato de sodio se valora con dicromato de potasio K2Cr2O7 en presencia de Ien medio cido, titulando el yodo producido con tiosulfato. Las reacciones que
ocurren, son:

Cr2O7= + 6 I- (exceso) + 14H+ 2Cr+3 + 3I2 + 7H2O


I2 + 2S2O3= 2I- + S4O6=
Para que la reaccin entre el Cr2O7= y el I- sea completa, se debe dejar en reposo por
varios minutos.
8.2.1.2 Volumetras redox yodimtrica o directa. La valoracin yodimtrica o directa
implica el uso de una solucin patrn de triyoduro para valorar analitos reductores. Las
soluciones de triyoduro se preparan disolviendo cristales de yodo en soluciones
concentradas de KI y diluyendo en agua. En una solucin que contiene exceso de iones
I- el yodo existe esencialmente como iones I3- o I2I- ; sin embargo para facilitar las
ecuaciones
y
los
clculos
puede
considerarse que el
yodo existe en forma
molecular como I2.
Es necesario que haya
un exceso de KI para
asegurar
el
desplazamiento de la
reaccin de disolucin
de I2 a I3- :

I2 (s) + I- I3Experimentalmente se
ha comprobado que la
proporcin
ms
adecuada de KI e I2
para la disolucin de I2 es 20g de KI por cada 12.7gr de I2.
La valoracin de los analitos reductores se hace en medio cido o n eutro. Los
reductores fuertes como, los iones sulfuro, sulfito y tiosulfato se determinan en medio
cido. Los reductores un poco ms dbiles como los compuestos de arsnico (III) y
antimonio (III) se determinan en medio neutro.
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Se utiliza como indicador el almidn, que forma un complejo de color azul en presencia
de exceso de yodo.
8.2.1.2.1 Preparacin y valoracin de la solucin tipo yodo. La solucin tipo de yodo se
prepara por el mtodo indirecto, disolviendo el yodo en una solucin de KI, valorando
con solucin patrn de tiosulfato de sodio y utilizando almidn como indicador.
Las reacciones que ocurren en la valoracin son:

I2 (s) + 2e- 2I2S2O3= 2e- + S4O6=


Las soluciones de yodo son poco estables por la volatilidad del soluto, el ataque del
yodo sobre muchos materiales
orgnicos y la luz.
8.2.1.2.2 Determinacin
de SO3 mediante volumetras redox
yodimtrica.
=

La muestra acidificada que contiene


sulfito, se titula con la solucin
estandarizada de yodo. El yodo
reacciona con el SO3=. El punto final
de la valoracin se reconoce por el
color azul resultante de la reaccin del
primer exceso de yodo con el
indicador de almidn.
Las reacciones que ocurren en la
valoracin son:

SO3= + H2O -> 2H + + SO4= + 2eI2 (s) + 2e- -> 2IControl de corrosin en lodos de
perforacin. La corrosin es el ataque
destructivo de un metal, causada por
una reaccin qumica o electroqumica
entre un metal y su ambiente.
Las causas principales de la corrosin
en las operaciones de perforacin son el oxgeno, el dixido de carbono, y el cido
sulfihdrico contenidos en el lodo. Cualquiera que sea su mecanismo de entrada, el
efecto corrosivo de esos gases es tambin una funcin de la cantidad de sales
disueltas, del pH, de la temperatura y de la velocidad de flujo del fluido involucrado.
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La corrosin origina fallas prematuras de la tubera de perforacin (drill pipe), del
revestimiento (Casing) o de cualquier otro equipo de acero empleado para perforar o
completar pozos. La industria petrolera dispone de un importante nmero de
productos qumicos para impedir o minimizar el ataque corrosivo. Todas las formas de
corrosin aumentan en presencia de oxgeno; los secuestrantes de oxgeno, sirven
para reducir los efectos de la corrosin. Los sulfitos de amonio o de sodio se utilizan
como depuradores de oxgeno en lodos base agua.
El sulfito reacciona rpidamente con el oxgeno del lodo y lo elimina segn la reaccin:

2SO3= + O2 -> 2SO4=


La tasa de bombeo del sulfito depende de la concentracin de oxgeno presente en el
lodo. Se recomienda mantener en el sistema un mnimo de 100ppm de sulfito.

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Clasificacin taxonmica
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase. Magnolidae
Orden: Ranunculales
Familia: Berberidaceae
Gnero: Berberis
Especie: Berberis flexulosa R. & P.
Nombre vulgar: ayrampo

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II.- Obejtivo
Determinar la cantidad de cido ascrbico presente en el extracto de Berberis
flexulosa ayrampo

III.- Materiales, reactivos

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IV.- Metodologa

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V. Resultados
Preparacin de soluciones
Para KIO3 0,01 N (PM=214,001 g/mol)
Se pes 0,1071 g en balanza analtica, se agreg esta masa a una fiola de 50 mL y se
enras con agua destilada c.s.p. 50 mL.

0,1071 g de KIO3

Para Na2S2O3.5H2O 0,01 N (PM=248,18g/mol)


Se pes 0,2142 g de Na2S2O3.5H2O en balanza analtica, se agreg a una fiola de 100
mL y se agreg agua destilada c.s.p. 100 mL.
0,2142 g de Na2S2O3.5H2O

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Para KI 0,01 N (PM=166 g/mol)


Se pes 0,1661 g de KI en balanza analtica, se agreg a una fiola de 100 mL y se agreg
agua destilada c.s.p. 100 mL.
0,1661 g de KI

Para almidn al 1%
Se pes 1,0002 g de almidn en balanza analtica y se agreg en una fiola de 100 mL y
se agreg agua destilada c.s.p. 100 mL.
1,0002 g de almidn

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Estandarizacin de Na2S2O3 con KIO3

Na2S2O3 + 2 KIO3 = K2S2O3 + 2 NaIO3

Na2S2O3

Gasto: 10,3 mL

1g de KI
10 mL KIO3 0,01 N
3mL H2SO4
2mL de almidn 1%

#mEq Na2S2O3 = #mEq KIO3


10,3mL x N = 10mL x 0,01 N
N Na2S2O3 = 0,0097 N

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Cuantificacin de cido ascrbico en extracto de Berberis flexulosa por Iodometra
Titulacin de cido ascrbico con Na2S2O3 y KIO3

Ecuaciones en la titulacin

C6H8O6 + 4KI + 8H+ C6H12O6 + 4K+ + 4I- + 4H+

6 Na2S2O3 + 2 I3 3 Na2S4O6 + 6 NaI


Na2S2O3

Gasto: 6,5 mL

3mL de extracto
10 mL KI 0,01 N
3mL H2SO4
2mL de almidn 1%

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Cuantificacin de cido ascrbico en extracto de Berberis flexulosa por Iodometra

PM cido ascrbico = 176,126 g/molPEq=88,65PmEq=0,08865

#mEq Na2S2O3 = #mEq I2 = #mEq M.P.


6, 5 mL x 0, 0097 N =

g cido ascrbico = 5,5893 x 10

-3

Cantidad de cido ascrbico en mg/100mL


X_________100mL
5, 5893 mg________3mL

La iodatometra o mtodo iodomtrico indirecto se fundamenta en la reaccin de un


oxidante con el KI yoduro de potasio reductor para generar yodo que se hace soluble
con la formacin del poliyoduro triyoduro: I2 (s)

+ I- I 3-

Es este triyoduro el cual es titulado por el tiosulfato, de manera que como el yodo
generado es proporcional a la cantidad de muestra oxidante se puede determinar la
equivalencia: #mEq Na2S2O3 = #mEq I2 = #mEq M.P.

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VI.- Discusin

VII.- Conclusiones

VIII.- Referencias bibliogrficas

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IX.- Anexos

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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUMICA

QUMICA ANALTICA INSTRUMENTAL

IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR


EL MTODO DE HPLC
Autores:

RODRIGUEZ CORDOVA, Angello Gonzalo


FERNANDEZ TELLO, Jose Oswaldo
MENDDOZA VILCHEZ, Mayra Lucia
TEVES GUZMAN, Katerin
ROJAS VSQUEZ, Victor

Docente:
Dr. CARLOS CASAS, Norma

Lima Lima Per


2015

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INDICE
IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR EL METODO DE HPLC......................3
INTRODUCCION ..................................................................................................... 3
OBJETIVOS............................................................................................................. 3
MARCO TERICO .................................................................................................. 4
I.

Berberis flexuosa R. & P. ............................................................................... 4

II. ANTOCIANINAS ............................................................................................5


III.

HPLC .......................................................................................................... 5

METODOLOGIA ...................................................................................................... 6
I.

SOLVENTES .................................................................................................. 6

II. COLUMNAS ................................................................................................... 6


III.
DETERMINACIN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC-PDA) ................................................. 8
IV.
DETERMINACIN DE LAS ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC-MS/MS) ............................................. 9
RESULTADOS ...................................................................................................... 10
CONCLUSIONES .................................................................................................. 12
ANEXOS ................................................................................................................ 13
FICHA DE CLASIFICACION TAXONMICA DE LA MUESTRA VEGETAL ... 13
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ...................................................................... 14

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IDENTIFICACION DE ANTIOCIANINAS POR EL


METODO DE HPLC
INTRODUCCION
Las antocianinas pertenecen a un gran y muy distribuido grupo de metabolitos
secundarios, que se conocen colectivamente como flavonoides. Las antocianinas
naturales ms comunes son las 3-O-glicsidos y las 3,5 di-O-glicsidos. Las
antocianinas son los componentes que otorgan a las plantas colores rojos, azules,
morados, particularmente en partes como frutos, flores y hojas . Estos pigmentos
fueron consumidos por los hombres a lo largo de incontables generaciones sin
causar aparentemente ningn efecto txico. El inters por las antocianinas se ha
incrementado debido a su potencial uso como colorantes naturales y por sus
potenciales beneficios en la salud. ltimamente, la seguridad de los pigmentos
sintticos ha sido cuestionada, conduciendo a la reduccin en el nmero de
colorantes permitidos. Las antocianinas son pigmentos solubles en agua, lo que
facilita su incorporacin en los sistemas acuosos alimentarios. Estas cualidades
hacen que estos colorantes naturales sean atractivos como pigmentos naturales
inocuos con considerable potencial en la industria alimentaria de productos con un
rango de pH cido. Adems de su color, se ha reportado que las antocianinas tienen
beneficios para la salud como potentes antioxidantes y pueden incrementar la
agudeza visual. Se ha observado tambin que poseen actividad antineoplsica,
vasotnica, vasoprotectora, anti - inflamatoria y hepatoprotectora. En el Per existen
muchas especies silvestres, una de ellas es Lechler, que crece especialmente
alrededor de los campos de cultivo a manera de proteccin, debido a sus espinas
grandes y filudas, sus flores son amarillas y sus frutos morados. Existe informacin
sobre esta especie en Per desde tiempos de la conquista; especialmente, el
cronista Bernab Cobo describi a esta planta con el nombre comn de quiscaquisca, que significa planta espinosa, con unas pequeas flores amarillas y espinas
filudas , cuyos frutos dan un suave color morado cuando son usados como
colorante. Asimismo, algunas tradiciones orales, sugieren que estos frutos eran
usados por las ustas durante el Incanato para lavar y cuidar sus cabellos a manera
de un champ colorante natural.
Miranda A, Martn O. Cromatografa Lquida (HPLC). [WebSite] [Disponible en:
http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-gases%20l%C3%ADquidos.pdf] [Citado
el 24 de noviembre 2015]

OBJETIVOS

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Determinacin e identificacin de antocianinas del ayrampo por el mtodo de


HPLC.
Identificacin de tipos de antocianinas utilizando los mtodos de (HPLCMS/MS) y (HPLC-PDA).

MARCO TERICO

I.

Berberis flexuosa R. & P.

Arbusto conocido del centro del Per, de la vertiente del Pacfico y de valles
interandinos, en ambientes semixricos. El tipo de esta especie fue recolectada en la
cuenca alta del ro Huaura, una zona escasamente herborizada. Otras poblaciones
provienen de las cuencas del Santa, Palca y Rimac. Una de las poblaciones es
conocida de las laderas con bosques perennifolios en las alturas de Lima. Estas
laderas incluyen varios endemismos y deberan recibir atencin para su
conservacin.

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Imagen 01. Muestra de herbario de Berberis flexuosa R. & P.

II.

ANTOCIANINAS

Las antocianinas representan el grupo ms importante de pigmentos hidrosolubles


detectables en la regin visible por el ojo humano. Estos pigmentos son
responsables de la gama de colores que abarcan desde el rojo hasta el azul en
varias frutas, vegetales y cereales, acumulados en las vacuolas de la clula. Las
antocianinas poseen diferentes funciones en la planta como son la atraccin de
polinizadores para la posterior dispersin de semillas y la proteccin de la planta
contra los efectos de la radiacin ultravioleta y contra la contaminacin viral y
microbiana.
Diversos estudios presentan evidencia cientfica que los extractos ricos en
antocianinas pueden mejorar la agudeza visual, mostrar actividad antioxidante,
atrapar radicales y actuar como agentes quimioprotectores. Las antocianinas
tambin juegan un papel en las propiedades antidiabticas tales como control de
lpidos, secrecin de insulina y efectos vasoprotectivos. Las propiedades funcionales
de las antocianinas abren una nueva perspectiva para la obtencin de productos
coloreados con valor agregado para el consumo humano. El objetivo de esta revisin
es ofrecer un panorama actualizado de las propiedades funcionales de las
antocianinas, de su potencial como ingredientes alimenticios y su impacto sobre la
salud.

Imagen 02. Tipos de antocianinas

III.

HPLC

La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los


componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y
una fase mvil. La fase estacionaria es apolar. La fase mvil acta de portador de la
muestra. La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de

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la solucin emigran de acuerdo a las interacciones no covalentes de los compuestos


con la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los
contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes detectores depender de la
naturaleza de los compuestos a determinar.

METODOLOGIA

I.

SOLVENTES

Los frutos secos congelados de Lechler (2,996 g) fueron separados de sus semillas;
siendo licuados con una solucin agua /acetona (30:70 v/v) y luego se filtr usando
un embudo buchner. La torta residual del filtrado fue nuevamente re-extrada con la
solucin agua /acetona (30: 70 v/v) hasta obtener una solucin clara. Los filtrados
fueron combinados, llevados a una pera de decantacin, agregndose cloroformo.
La porcin acuosa (parte superior) fue colectada y colocada en un rotavapor Bchi a
40C durante 5 a 10 minutos, hasta que la acetona residual se evapora. El extracto
acuoso fue llevado hasta un volumen conocido (100mL) usando agua destilada.
Se extraen con metanol y los extractos resultantes se tratan con 0.1 % HCL. Los
compuestos no polares y flavonoides se separan mediante tratamientos sucesivos
con ter de petrleo y acetato de etilo. La solucin resultante se analiza en una
columna Bondapak C 18 (30 cm x 8 mm d.i.) usando una fase mvil compuesta de
agua/ cido actico/ metanol (71: 10:10) a un flujo de 1.5 mL/ min y la deteccin se
realiza a 530 nm. La delfidina 3.5 diglucsido y la malvidina glucsido fueron los
pigmentos mayoritarios encontrados en las cscaras de uvas, para un 69 % del
contenido total de las antocianinas. Este mtodo puede ser usado para determinar el
contenido de antocianinas en cualquier tipo de fruto o alimento.
El HPLC es el mtodo ms comn para realizar el anlisis de antocianinas. La
muestra fue semipurificada usando un cartucho C-18 y la fraccin fenlica
(conteniendo antocianinas) fue eluida con metanol acidificado con HCl 1%; se
evapor el metanol en un rotavapor Bchi, se utiliz agua acidificada con HCl 0,01%
para lograr un volumen conocido y se filtr usando un filtro de polipropileno
Whatman de 0,45 m antes de la inyeccin en el equipo HPLC.

II.

COLUMNAS

Para el estudio, caracterizacin y determinacin de Antocianinas se utiliza una


Columna de fase reversa (C18). Esto porque la fase estacionaria debe de ser apolar,
las antocianinas que se reconocen en este estudio son del mismo carcter (apolar).
La cromatografa en fase reversa (RPC) permite separar molculas en base a su
polaridad. El principio de la cromatografa en fase reversa es semejante al de la
cromatografa en capa fina. Aqu la fase estacionaria es una matriz apolar. Por lo

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tanto, para este tipo de cromatografas se emplean mezclas de solventes polares,


tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifticos.
En virtud de lo anterior, este tipo de cromatografa ha sido tambin llamada como
cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC). En general, este ltimo trmino se ha
empleado para referirse a las aplicaciones en las que se emplean sustituyentes y
matrices compatibles con fluidos biolgicos.
El sistema C18-HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una
bomba que inyectan lquido a la columna. Generalmente las columnas de slica
requieren alta presin para que el flujo de lquido sea adecuado, la mezcladora se
requiere para variar la proporcin de solvente en la fase mvil y el inyector permite la
aplicacin de la muestra.
Es importante distinguir entre dos formatos de fase con enlace distinto. El formato
C18 de tipo monomrico incorpora enlaces de cadenas alquil C18 a un nico tomo
de slice sobre la estructura del gel de slice. Las columnas de tipo monomrico
como son las COSMOSIL C18-MS-II y la serie MS tiene una excelente
reproducibilidad de sntesis, muy buena reproducibilidad lote a lote y cortos periodos
de tiempo para la estabilizacin de la fase mvil.
Por otro lado el formato C18 polimrico incorpora un proceso de silanizacin trifuncional por el que el grupo octadecil se une a 2 o 3 tomos de slice sobre la
estructura del gel de slice. Esto aumenta el efecto de la silanizacin lo que
proporciona una estabilidad de columna mucho mayor, particularmente en
condiciones cidas de la fase mvil. La capacidad de reconocimiento estrico
tambin es mucho mayor que las de las columnas C18 del tipo de silanizacin
monofuncional. COSMOSIL ofrece el formato polimrico en ls AR-II y la serie
completa AR-300.
En este caso se utilizara una columna de fase reversa (Supelco AscentisTMC18
25cmx4.6mm, 10m), debido a su facilidad de mantenimiento y bajo costo.

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Imagen 03. Descripcion de C18

III.

Imagen 04. C-18

DETERMINACIN
DE
LAS
ANTOCIANINAS
POR
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLCPDA)

El HPLC es el mtodo ms comn para realizar el anlisis de antocianinas.


La separacin real de cada componente en la muestra se realiza dentro de una
columna, sin embargo esta separacin tiene que ser registrada para que seamos
capaces de verlo. Los detectores se utilizan para este propsito. Los componentes
separados se controlan y se expresan electrnicamente. No hay detector universal
que puede controlar todos los compuestos y hay muchos detectores utilizados para
el anlisis LC.
Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de absorbancia.
Proporcionan una buena sensibilidad para que compuestos que absorbe la luz a
nivel ~ pg. Son fciles de operar y proporcionar una buena estabilidad. El detector
PDA detecta un espectro completo de forma simultnea. Detectores UV y VIS
visualizar el resultado obtenido en dos dimensiones (intensidad de la luz y el tiempo),
pero PDA aade la tercera dimensin (longitud de onda). Esto es conveniente para
determinar la longitud de onda ms adecuada sin repetir los anlisis.
La muestra fue semipurificada usando un cartucho C-18 y la fraccin fenlica
(conteniendo antocianinas) fue eluida con metanol acidificado con HCl 1%; se
evapor el metanol en un rotavapor Bchi, se utiliz agua acidificada con HCl 0,01%
para lograr un volumen conocido y se filtr usando un filtro de polipropileno
Whatman de 0,45 m antes de la inyeccin en el equipo HPLC.
La separacin de las antocianinas se llev a cabo en una columna C-18Waters
Symmetry (4,6mm x 150mm, 3,5m) usando un sistema HPLC que constaba de un

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mdulo de separacin Waters 2695, equipado con un detector con arreglo de


fotodiodos (PDA) Waters 2996, un software Empower y un automuestreadorWaters
717 plus. El rango de flujo fue de 0,8 mL/min; la fase mvil: A, cido frmico al 10%
en agua grado HPLC; B, acetonitrilo; la gradiente utilizada fue: 0-1 min 95% A y 5%
de B; 2 min 90% A y 10% B; 20 min 80%Ay 20% B y a los 25 min 95%Ay 5% B.
Se realiz una deteccin simultnea a las longitudes de onda: 520 nm para
antocianinas, 280 nm para compuestos fenlicos y a 320 nm para cidos cinmicos.
La identificacin de los picos de las antocianinas fue realizado en base a la
comparacin de los cromatogramas y tiempos de retencin de los extractos
concentrados de antocianinas de las especies (Vistis vinifera) y (Zea mays), corridos
bajo las mismas condiciones especificadas anteriormente.
Previamente, se utiliz un espectrofotmetro UV- visible Hewllet Packard 8453; las
mediciones fueron realizadas a 520 (mxima longitud de onda determinada) y a 700
nm. (CARACTERIZACIN DE LAS ANTOCIANINAS DE LOS FRUTOS Berberis boliviana Lechler.
Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco, Av. De La Cultura 733, Cusco, Per.)

IV.

DETERMINACIN
DE
LAS
ANTOCIANINAS
POR
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLCMS/MS)

La espectrometra de masas se basa en la medida directa de la relacin de la masa


con el nmero de cargas elementales positiva o negativa de los iones (mz) en la fase
gaseosa obtenida de la sustancia a analizar. Esta relacin se expresa en unidades
de masa atmica (u), (1u= la doceava parte de la masa de un tomo de carbono 12)
o en daltons (1 Da= a la masa del tomo de hidrgeno). En este estudio se han
utilizado, el anlisis del ion precursor, anlisis del producto inico, anlisis de prdida
neutral comn y la monitorizacin selectiva de reaccin, que son parte de la
espectrometra de masas tandem (MS-MS), la cual tiene la ventaja de lograr dos
separaciones de los componentes de la muestra, siendo ambas separaciones
inicas; debido a esta especificidad, esta tcnica es usada para lograr anlisis
cuantitativos de analitos en mezclas simples en cuestin de minutos sin necesidad
de una separacin cromatogrfica u otro tratamiento qumico que elimine
interferentes. La caracterizacin de cada una de las antocianinas se realiz
utilizando la monitorizacin selectiva de reaccin (SRM), y el anlisis del ion
precursor, el cual detecta todos los iones precursores en una muestra que se
fragmenta como un producto inico comn en tanto que el anlisis de prdida
neutral comn detecta aquellos iones precursores que se fragmentan para producir
iones con una diferencia comn en producida por la prdida de un fragmento
caracterstico de un producto o de una familia de compuestos . La separacin de las
antocianinas fue llevada a cabo en una columna C-18 Waters Symmetry (4,6 x 75
mm, 3,5m); se us un tnel de triple cuadrupolo (Quattro Ultima, Micromass, UK
Limited, Manchester, UK). El rango de flujo del HPLC se estableci en 1 mL/min, la
fase mvil: A, cido frmico al 10%; B, acetonitrilo; la gradiente usada; 0-20 min,

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100%-85% A; 20-25 min, 85%-100% A. El espectro de absorcin de las antocianinas


fue realizado en el rango 200 600 nm. Los espectros de masas fueron obtenidos
usando la Monitorizacin Selectiva de Iones (SIM). Aproximadamente 100 L del
eluato del HPLC fueron separados por una microvlvula y se depositaron en la
fuente ESI. El cuadrupolo fue operado segn las siguientes condiciones: Voltaje
capilar 3,2 kV, voltaje de cono 35 V, RF lense 1,50 V, temperatura del gas de
desolvacin 500C con un flujo de 269 L/h, temperatura de la fuente 105C, presin
de colisin de gas (argn) 7 psi; la energa de colisin fue establecida en 25 eV.
En algunos casos en los que los pesos moleculares son idnticos y no se puede
distinguir entre uno y otro, es necesario acudir a un mtodo que nos pueda aclarar la
identidad de las sustancias; por ejemplo, tanto glucosa como galactosa, son
azcares presentes en una gran cantidad de antocianinas, tienen el mismo peso
molecular, por lo que a travs de un espectro de masas es imposible diferenciarlos,
en nuestro caso la diferenciacin fue posible gracias al anlisis HPLC utilizando
extractos concentrados de antocianinas de variedades conocidas y cuyos perfiles
antocinicos estn bien establecidos, constituyendo ste un mtodo rpido, sencillo
y barato de identificacin.

RESULTADOS
Al someter el hidrolizado a un anlisis HPLC, se verific la presencia de 5 aglicones;
simultneamente, se realiz la hidrlisis y posterior anlisis HPLC de un extracto
concentrado de antocianinas, Vitis vinifera (Uva) para tener patrones de
comparacin que nos ayuden a identificar los picos del cromatograma. Todas las
muestras fueron analizadas bajo las mismas condiciones.
Al comparar los cromatogramas (figura 1), el perfil de elucin de las antocianidinas
presentes Berberis flexuosa R. & P. coincide exactamente con los frutos de Vitis
vinfera, que es una fuente muy conocida y bien estudiada de 5 aglicones: cianidina,
delfinidina, malvidina, peonidina y petunidina. Asimismo, se pudieron identificar slo
5 antocianinas como se muestra en el cromatograma, estas son: delfinidina-3glucsido, cianidina-3-glucsido, petunidina-3-glucsido, peonidina-3-glucsido y
malvidina-3-glucsido.
Berberis flexuosa R. & P.

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Vitis vinfera

Imagen 05. Cromatogramas de comparacin obtenidos a 520nm de las especies Berberis


flexuosa R. & P. y Vitis vinfera obtenidos luego de haber realizado la hidrlisis cida
correspondiente. En la especie Vitis vinfera, se encuentran 5 antocianidinas.

En la determinacin de antocianinas por cromatografa lquida de alta resolucin


(HPLC-PDA) se obtuvieron cromatogramas a diferentes longitudes de onda, 280nm,
320nm y 520nm con la finalidad de determinar antocianinas, como se muestra en la
figura 2.
Al comparar los cromatogramas (B) y (C) de la figura 2, correspondientes a 520 nm y
280 nm, respectivamente, se verifica que las antocianinas seran los nicos
compuestos fenlicos presentes en los frutos de Berberis flexuosa R. & P., debido a
que no existen diferencias significativas entre ambos cromatogramas; este hecho es
sumamente importante debido a que se tratara de una fuente natural de
composicin exclusivamente antocinica.

Imagen 06. Los cromatogramas obtenidos a diferentes longitudes de onda, nos muestra que
las antocianinas presentes en los frutos de Berberis flexuosa R. & P, estn casi puras,
debido a que a 280nm (C),que es longitud de onda a la cual se pueden identificar otros

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componentes fenlicos slo aparecen las antocianinas, por lo que se puede considerar a
estos frutos como una fuente casi pura de antocianinas.

CONCLUSIONES
Se obtuvo antiocianinas del ayrampu por el mtodo de HPLC
Se demostr y cuantifico las antiocianinas del ayrampu por los mtodos de
HPLC- MS/MS y HPLC-PDA.
Se compar las antiocianinas del ayrampu con la uva por el mtodo de HPLCMS/MS.

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ANEXOS
FICHA DE CLASIFICACION TAXONMICA DE LA MUESTRA VEGETAL

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Miranda A, Martn O. Cromatografa Lquida (HPLC). [WebSite] [Disponible
en:
http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02gases%20l%C3%ADquidos.pdf] [Citado el 24 de noviembre 2015]
Leal Guadarrama,
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CROMATOGRAFA
DE
FASE REVERSA.
UNAM
2004.
[WebSite]
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http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_fase_reversa.
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Lpez Ramrez, Winston Quiones, Fernando Echeverri. PERFIL
CROMATOGRFICO DE LAS ANTOCIANINAS PRESENTES EN
ALGUNOS FRUTOS COLOMBIANOS. Scientia et Technica Ao XIII, No
33, Mayo de 2007
Aguilera Ortz, Reza Vargas, Chew Madinaveitia, Meza Velzquez.
PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS ANTOCIANINAS. Facultad de
Ciencias Qumicas. Universidad Jurez del Estado de Durango. Av.
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GARZN G, LAS ANTOCIANINAS COMO COLORANTES NATURALES
Y COMPUESTOS BIOACTIVOS. Acta biol. Colomb., Vol. 13 No. 3, 2008.
Biswas, G; Sarkar, S.; Chatterjee, T.K.; Mukherjee, S.P. Determination of
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Bakker, J; Bridle, P; Bellworthy, SJ. Strawberry juice colour: a study of the
quantitative and qualitative pigment composition of juices from 39
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blueberries .J. Liq. Chromatogr. 18 (2): p. 245- 259, 1995.
Berberidaceae endmicas del Per. Rev. peru. biol. Nmero especial
13(2): 171s - 173s (Diciembre 2006). Carmen Ulloa Ulloa , Abundio
Sagstegui e Isidoro Snchez. El libro rojo de las plantas endmicas del
Per. Ed.: Blanca Len et al. Facultad de Ciencias Biolgicas UNMSM

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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
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Farmacia y bioqumica carrera a la vanguardia de las ciencias de la salud, el


conocimiento libera nuestras capacidades y la buena enseanza se reflejar en nuestro
liderazgo profesional

ANLISIS POR ESPECTROSCOPA DE ABSORCIN


ATMICA DE Berberis flexuosa
Curso: QUMICA ANALTICA INSTRUMETAL
Dra. Norma Anglica Carlos Casas

Arredondo Nuez, Annsy Camila


Lpez Chagua Ayrlton Jhonny
Ocros Meza Katherine Pamela
Quispe Molina, Brayanm Giancarlos Ysmael
Serrano Cervantes Lisbet Karina
1

ANLISIS POR ESPECTROSTROSCOPA DE


ABSORCIN ATMICA EN MUESTRA
HIDROALCOHOLICA DE Berberis Flexuosa
ANALYSIS BY SPECTROSTROSCOPY ATOMIC ABSORPTION IN
HYDROALCOHOLIC SAMPLE OF Berberis Flexuosa
INTRODUCCIN

a espectroscopia de absorcin atmica


es un mtodo de deteccin y la
determinacin de elementos qumicos,
particularmente de elementos metlicos.
Los compuestos para, para su examen, se tienen
que romper en los tomos que los constituyen1.
En este caso se usara este tipo de espectroscopia
para la determinacin y cuantificacin de calcio
en una muestra de Berberis Flexuosa ms
conocida como (Ayrampo).
La Berberis Flexuosa es un arbusto silvestre
que se desarrolla en algunas zonas altoandinas
entre los 2500 y 4500 msnm. En la poca
incaica fue utilizada como una planta con
mltiples funciones y usos, principalmente en la
medicina tradicional. Es un arbusto rstico de
porte leoso que crece en difcil condiciones de
suelo, agua y temperatura. Se cosecha entre los
meses de abril, mayo y junio, cuando presenta
un color guindo o lila muy oscuro y suave. Los
frutos maduros se comen crudos y con ellos se
preparan bebidas y mazamorras. Es una
importante fuente de minerales y vitaminas.
Asimismo, es un efectivo febrfugo, laxante y
tnico. La infusin de las hojas se utiliza contra
el nerviosismo. La infusin de las flores acta
contra el cansancio y la anemia. La infusin de
la raz combate la disentera amebiana. La
infusin de la raz machacada estimula la
retencin de orina2.
El mtodo oficial del AOAC 985.35 para
cuantificar el contenido de calcio en alimentos
utiliza la tcnica de espectrometra de absorcin
atmica con llama la cual se basa en la
destruccin de la materia orgnica por va seca
hasta lograr la digestin del alimento para
posteriormente solvatar los residuos con cido
ntrico diluido para la posterior determinacin

del o los analitos por Espectrofotometra de


Absorcin Atmica con llama 3. Con dicho
mtodo se evalu el contenido de este mineral
en la Berberis Flexuosa
conocida como
Ayrampo.
El calcio es un macro mineral indispensable
para la formacin de huesos y dientes, la
contraccin muscular y el funcionamiento del
sistema nervioso; tambin interviene en la
coagulacin de la sangre y en la actividad de
algunas enzimas. Sin embargo, la mayora del
calcio en el organismo se encuentra en los
huesos y en los dientes. Una manera de prevenir
la deficiencia de calcio en el organismo es por
medio de una dieta rica en alimentos que lo
contengan, por ejemplo, productos lcteos
(quesos, yogurt), espinacas, mostaza, rbano,
brcoli, frijoles y ajonjol4.
MATERIALES Y MTODOS
Materiales y reactivos:

100 gr. de fruto seco de Ayrampo

1L de Etanol de 70

cido ntrico al 65%

Cloruro de potasio al 25 %

Espectrofotmetro de absorcin atmica


Shimadzu AA 7000 con llama de xido
nitroso/acetileno

Patrn de 1000 mg/L de calcio

Pipeta de 10 mL.

Balones aforados ( 20 mL , 250 mL ,


500 mL )

Bureta de 10 mL

Bureta de 50 mL

Mtodos
2

La muestra fue recolectada del departamento de


Ayacucho (Per), y llevada al laboratorio para
preparar el extracto. Se pes 100 g del fruto
seco Ayrampo, el cual fue sometido a
extracciones en maceracin con etanol de 96 o, a
temperatura de 25 C en un recipiente de vidrio
cerrado y protegido de la luz por una semana;
posteriormente se licu y se dej por una
semana adicional;
se separ la solucin
etanlica del respectivo marco mediante
filtracin. Por ltimo, se recolectaron todos los
filtrados en un solo recipiente.5
La parte experimental consisti en siete ensayos
en los cuales se corrieron las muestras patrn
(curva de calibracin), los estndares y las
muestras naturales (matriz de agua cruda y
tratada) y el registro de los resultados para cada
grupo de ensayos.5

se le adiciona cido ntrico al 65% y


cloruro de potasio al 25 %, al igual
que a las muestras estndares o
muestras preparadas, las muestras se
van a leer en el espectrofotmetro
de absorcin atmica Shimadzu AA
7000 con llama de xido nitrosoacetileno. 5
3. Preparacin de soluciones

1. Fundamento del mtodo


Se basa en la destruccin de la materia
orgnica por va seca hasta lograr la
digestin del alimento (Ayrampo) para
posteriormente solvatar los residuos con
cido ntrico diluido para la posterior
determinacin
del
analito
por
Espectrofotometra
de
Absorcin
Atmica con llama.3

2. Mtodo de anlisis
El mtodo de anlisis para la
determinacin
de
calcio
espectrofotmetro de absorcin atmica.
Para la realizacin de este trabajo, se
inici con una revisin documental del
mtodo, posteriormente se hicieron
ensayos con patrones y muestras con el
objeto
de
operar
el
equipo
adecuadamente.5
2.1 Procedimiento estndar
Se prepararn sustancias patrn para
la curva de calibracin de calcio a
las cuales se le agregara cido
ntrico al 65% para la conservacin
de la muestra y cloruro de potasio al
25% para evitar las interferencias de
otros analitos en la lectura de las
muestras, a la muestra (muestra
natural) que se le va a medir calcio

Solucin de cloruro de Potasio


(KCl): El cloruro de potasio se
prepara disolviendo 25 g de cloruro
de potasio slido, en agua
desionizada y se afora en un baln
aforado de 100 mL.
Solucin madre de Calcio de 500
mg/L: Esta solucin se prepara
tomando 10 mL del patrn de
1000mg/L de Calcio con una pipeta
aforada de 10 mL, el cual se lleva a
un baln aforado de 20 mL y se
afora con agua desionizada.
Solucin madre de Calcio de 20
mg/L: Esta solucin se prepara
tomando 5 mL de la solucin de
1000 mg/L de calcio por medio de
una pipeta aforada de 5 mL, el cual
se lleva a un baln aforado de 250
mL se le adiciona 2,5 mL de cido
ntrico al 65% y se afora con agua
desionizada.
Solucin madre de Calcio de 12,5
mg/L : Esta solucin se prepara
tomando 12,5 mL de la solucin de
500 mg/L de calcio por medio de
una bureta de 10 mL, el cual se lleva
a un baln aforado de 500 mL y se
le adiciona 5 mL de cido ntrico al
65% y se afora con agua
desionizada.

4. Preparacin de patrones para la curva


de calibracin:
Para la validacin del calcio se
prepararon una serie de patrones de
concentraciones conocidas para la curva
de calibracin:
3

Se prepararon una serie de muestras


patrn de diferentes concentraciones a
partir de una solucin madre de calcio,
para realizar un anlisis de linealidad,
para definir el rango ptimo de
concentracin de la curva de calibracin.
Para esto se realizaron unos ensayos para
definir estos valores de concentracin. El
procedimiento para la preparacin de las
soluciones patrn para la curva de
calibracin se muestra a continuacin:

Patrn de 0,0 mg/L blanco de


reactivos: Esta solucin contiene
agua desionizada ms los reactivos,
como son 2,5 mL de cloruro de
potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL cido
ntrico al 65% y se afora en un baln
de 250 mL.
Patrn de 0,75 mg/L: Se tomaron
15 mL de solucin madre de Calcio
en un baln aforado de 250 mL, se
le adiciona 2,5 mL de cloruro de
potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL cido
ntrico al 65% y se afora.
Patrn de 1,00 mg/L: Se tomaron
20 mL de solucin madre de 12,5
mg/L de Calcio en un baln aforado
de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de
cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5
mL cido ntrico al 65% y se afora.
Patrn de 1,50 mg/L: Se tomaron
30 mL de solucin madre de 12,5
mg/L de Calcio en un baln aforado
de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de
cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5
mL cido ntrico al 65% y se afora.
Patrn de 2,00 mg/L: Se tomaron
40 mL de solucin madre de 12,5
mg/L de Calcio en un baln aforado
de 250 mL, se le adiciona 2,5 mL de
cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5
mL cido ntrico al 65% y se afora.
Patrn de 3,00mg/L: Se tomaron 60
mL de solucin madre de12,5 mg/L
de Calcio en un baln aforado de
250 mL, se le adiciona 2,5 mL de
cloruro de potasio (KCl) al 25%, 2,5
mL cido ntrico al 65% y se afora.

Patrn de 4,00 mg/L: Se tomaron


80 mL de solucin madre de 12,5 mg/L
de Calcio en un baln aforado de 250
mL, se le adiciona 2,5 mL de cloruro de
potasio (KCl) al 25%, 2,5 mL cido
ntrico al 65% y se afora.
Nota: Todos los volmenes para la
preparacin de los patrones se midieron
con una bureta de 10 mL y de 50 mL;
menos los del cloruro de potasio y cido
ntrico que se toman con una pipeta
graduada.
5. Muestra de anlisis
Preparacin de las soluciones estndar
para el calcio: Se prepararan una serie de
muestras estndar a partir de una
solucin madre de 12,5 mg/L de calcio,
esta es la misma solucin madre
utilizada en la preparacin de las
soluciones patrn, los estndares se
utilizaran para la corroboracin del
mtodo, ya que con el estndar de
concentracin baja se calcula el lmite de
deteccin del mtodo, para la
determinacin
del
calcio
por
espectroscopia de absorcin atmica de
llama y con los otros dos estndares se
verificara el 50% y el 90% de las
concentraciones de las soluciones patrn
(soluciones de la curva de calibracin).
Para esto se realizaron unos ensayos para
definir estos valores de concentracin. El
procedimiento para la preparacin de las
soluciones estndar se muestra a
continuacin5

Estndar de 0,5 mg/L: Se tomaron 10


mL de solucin madre de 12,5 mg/L de
Calcio en un baln aforado de 250 mL,
se le adiciona 2,5 mL cido ntrico al
65%, 2,5 mL cloruro de potasio al 25% y
se afora a 250 mL
Estndar de 1,8 mg/L: Se tomaron 36
mL de solucin madre de 12,5 mg/L de
Calcio en un baln aforado de 250 mL,
se le adiciona 2,5 mL cido ntrico al

65%, 2,5 mL cloruro de potasio al 25% y


se afora a 250 mL.
Estndar de 3,6 mg/L: Se tomaron 72
mL de solucin madre de 12,5 mg/L de
Calcio en un baln aforado de 250 mL,
se le adiciona 2,5 mL cido ntrico al
65%, 2,5 mL de cloruro de potasio al
25% y se afora.

6. Digestin de la muestra
Moler y homogeneizar la muestra.3 Si la
digestin es muy fuerte puede
presentarse prdida de muestra y por
consiguiente de analito o se puede
presentar sequedad de la muestra y el
analito queda adherido al envase
contenedor y se ocasione disminucin en
su concentracin.6
7. Medicin por Espectrofotometra de
Absorcin Atmica:
Antes de realizar la determinacin de la
muestra mediante Absorcin atmica
debemos
verificar
el
buen
funcionamiento del equipo a utilizar.
Para ello debemos calibrar el equipo
8. Parmetros instrumentales para la
determinacin de Calcio
Longitud de Onda (): 422.7 nm.
Ancho de Banda: 0.5 nm.
Corriente de lmpara (CH):
100% uso normal.
Correccin de Fondo: Ninguno
Tipo de llama recomendada:
xido Nitroso/Acetileno*.
Intervalo flujo de combustible:
4.0 a 4.4 L/min.
*Se recomienda la utilizacin de este
tipo de llama puesto que este elemento
(calcio - Ca) tiene un punto de ebullicin
muy alto y puede formar xidos con el
aire muy estables y difciles de disociar,
por lo que este tipo de llama provee una
temperatura entre (2500 a 3100) C
capaz de romper los enlaces formados
por este elemento y el aire (oxigeno) y
as poder cuantificar calcio en su estado
inico elemental.6

9. Metodologa utilizada en Cenprofarma


Como no se saba la concentracin del
ayrampo se tom 1 ml del extracto
filtrado y de ah se ah se llev a una
fiola de 50 ml y se agreg el supresor,
que en este caso fue el cloruro de
lantano (LaCl) al 0,1%, para eliminar la
interferencia con otros metales y de ah
se procedi a leer en el equipo.
Se hizo la curva de calibracin, la cual
se trabaj a partir de una solucin madre
de
1000
ppm
se
prepar
concentraciones 0,5ppm, 1ppm, 2ppm y
4ppm dndonos un coeficiente de
relacin de 0,99 lo que indicaba que la
curva pasa.
Primero se lee el blanco que fue el
cloruro de lantano al 0,1% luego pasa
cada estndar y sale la curva de
calibracin.
Una vez que se tenga la muestra
preparada se lee en el equipo y te sale la
concentracin de la muestra problema el
cual fue 0,650 ppm de acuerdo a eso se
realiza los clculos (se pes 1ml y se
llev a una fiola de 50 ml) haciendo los
clculos sale 32,5 g de calcio/ml de
extracto.
Se utiliz estndar de calcio puro y el
diluyente para todos fue cloruro de
lantano
El espectrofotmetro de absorcin
atmica utilizado fue de marca Perkin
Elmer
Para que se produzca la flama se
necesita acetileno-aire combustible
comburente para que se produzca la
atomizacin de la muestra.

RESULTADOS
5

PRUEBA

ESPECIFICACIN

MTODO

ascrbico, componente que participa en el


metabolismo activo del calcio que
contribuir en su retencin7.

RESULTADO

3,25 mg

CUANTIFICACIN:

ABSORCIN

CALCIO

ATMICA

Ca/100ml de
extracto
etanlico de
Ayrampo

Tabla 1. Resultados de la cuantificacin de calcio por el


mtodo de espectroscopia de absorcin atmica de la
muestra preparada.

DISCUSIN

El proyecto parti de 10ml de muestra


macerada en dilucin hidroalclica, el cual
se someti a anlisis obtenindose como
resultado de una espectroscopia de
absorcin atmica una concentracin de
3.25mg/100mL de Ca. Se sabe que dicha
maceracin parti de 100gr. de muestra
seca, la cual fue llevada a 1 litro de alcohol
de 76 por 4 das, adems se puede inferir
que la distribucin de estos metales
contenidos en la planta se distribuyeron en
el solvente de manera homognea; adems
este valor obtenido no supone como
referente al contenido total de calcio de la
planta, ya que solo se someti a estudio
parte de dicho macerado; por tanto el
resultado obtenido de 3,25mg/100ml de Ca
total en la alcuota se aproxim tomando
como referente el volumen total del
macerado, es decir, si una alcuota de 10 ml
de muestra contiene 0,325mg de Ca, as 1
litro contendr 32mg de Ca, esto es en
100mg de muestra total. El intervalo de
alimentos presuntos como ricos en
concentracin de calcio llegan entre 44 a
500 mg/100gr de porcin consumida8 as la
muestra en estudio no puede ser
considerada como fuente enriquecida de
Ca; sin embargo ms que presencia de solo
calcio para la clasificacin del alimento
tambin es debe dar la evaluacin de la
presencia conjunta en el alimento del cido

En el presente estudio se parti de una


muestra macerada en solucin hidroalcholica, alternativamente el tratamiento
se podra haber presentado por un
procedimiento por el mtodo AOAC, para
ello se debe partir de una muestra seca
molida y homognea, la cual pasar por un
tratamiento de mufla a una temperatura
100C y luego llevado a 525C. Luego de
ello se pasar la digestin de las cenizas
que se har con HNO3 65% y KCl al 25%6;
aqu se pretende eliminar todo material
orgnico presente, quedando solo residuos
de los minerales en la muestra, as se
eliminara casi en su totalidad los
interferentes que hubiesen necesitado una
preparacin ms trabajosa del placebo.
Asimismo, se tiene entendido que el medio
hidro-alclico
en un estudio por
espectroscopia de absorcin atmica no es
ptimo por no decir que no es dable9; sin
embargo, si la muestra fue llevada a anlisis
en esas condiciones se concluye que el
tratamiento posterior a la muestra en
maceracin logr darle las condiciones
adecuadas para dicha lectura.

CONCLUSIN

Es importante la determinacin y
cuantificacin del Calcio en especies
vegetales que posiblemente tengan un
contenido ptimo de calcio para as
poder aprovechar las ventajas de este
mineral al consumir plantas como la
Berberis Flexuosa conocida como
Ayrampo.
Se determin y cuantifico el calcio por
espectroscopia de absorcin atmica en
la muestra de Berberis Flexuosa que
tiene un valor de 3,25 mg Ca/100Ml de
extracto etanlico.
Al determinar la existencia de calcio
en la Berberis Flexuosa es posible
aprovechar estos datos para as poder
6

generar un mayor consumo de esta


planta.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.

2.

3.

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http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/
8252/4/T7Abasorc.pdf

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS


Universidad del Per, DECANA DE AMRICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

DEPARTAMENTO ACADMICO DE QUMICA BSICA Y APLICADA

ANALISIS ESPECTRAL UV PARA


ANTOCIANINAS USANDO
REACTIVOS DE DESPLAZAMIENTO
Alumnos:
Sandra Ivonne Irkampa Gallardo
Pedro Alejandro Mesas Snchez
Deidy Ramrez Garibay
Grupo:
Mircoles 2 a 6 pm
Profesor:
Norma Carlos Casas

2015

OBJETIVOS

Determinar los diferentes desplazamientos de bandas a travs de


los diferentes solventes utilizados.

Corroborar los diferentes desplazamientos batocrmicos e


hipsocromicos brindada por la bibliografa utilizada.

Introduccin

Las antocianinas son


compuestos
fenlicos del grupo de los
flavonoides. Se encuentran en la naturaleza, en algunos frutos que van
del color rojo al azul como los arndanos, las cerezas, las ciruelas o
las uvas.
Estos compuestos actan, por ejemplo, en el organismo humano
como protectores de los capilares de la retina, desempeando un papel
fundamental en la buena conservacin de la vista. Adems parecen
tener entre otras, propiedades antivirales y hemostticas, por lo que
pueden desempear un papel positivo frente a infecciones as como
detener sangramientos en el ser humano. Protegen al corazn de
enfermedades
cardiovasculares y tienen como el resto de
los
flavonoides, un valor antioxidante (1).
Su frmula bsica est conformada por dos anillos aromticos unidos
por una estructura de tres carbonos. En su forma natural, esta
estructura se encuentra esterificada a uno o varios azcares, en cuyo
caso se denominan antocianinas simples. Si adems del azcar en
la molcula existe un radical acilo, entonces son antocianinas aciladas
(2).
El presente trabajo es una resea bibliogrfica sobre las caractersticas
espectroscpicas de las antocianinas en la zona visible del espectro
de absorcin as como diversos mtodos
espectroscpicos
(UVVisible); esta tcnica es usada para identificar el tipo de flavonoides o el
modelo de oxigenacin. Este ltimo puede adems ser mejor definido
por el uso de reactivos de desplazamientos los cuales, como su nombre
lo indica provocan el desplazamiento de las bandas de absorcin. Los
espectros de los flavonoides son determinados usualmente en solucin
metanlica.

METODOLOGA

1. MATERIALES
INSTRUMENTOS

Fiola de100 ml
Fiola de 25 ml
Pipetas de 5ml y 1 ml
Espectrofotmetro Uv vis
Celdas de vidrio
Celdas de cuarzo para Uv - visible
Agua destilada

SOLVENTES

Cloruro de aluminio
Metanol
HCl 1N
Metoxido de sodio

PARTE EXPERIMENTAL
1. EXTRACCIN DE ANTOCIANINAS
Para la extraccin de antocianinas del fruto
de Berberis flexuosa ms conocida como
ayrampo se pes 100 g para macerarlo
en etanol 76 se dej reposar por 2 das,
se redujo el tamao para maximizar el nivel
de extraccin, se procedi a filtrar
el
licuado, conservando el extracto en frascos
ambar y cubiertos alejados de la luz, para
que las antocianinas no se desnaturalicen
por la presencia de stas.

Extracto de
Berberis flexuosa

Para obtener una mejor resolucin en el espectrofotmetro, se


llev acabo la extraccin de alcohol del extracto hidroalcohlico,
lo cual primero se utiliz una secadora para poder eliminar
menores proporciones de humedad, luego se llev el extracto a la
estufa a una temperatura de 30 C durante 24 horas.

Secadora
Extracto en estufa a 30C

Se obtuvo un extracto con un porcentaje bajo de etanol

Extracto con mnima proporcin


de etanol en su composicin

2. CARACTERIZACIN DE ANTOCIANINAS POR MTODOS


ESPECTROFOTOMTRICOS
Se emple el espectrofotmetro marca Genesys 100S UV-Vis
haciendo uso de celdas de cuarzo, con la ayuda de un Software
Visionlite.

Espectrofotmetro marca
Genesys modelo 100S UVVisible

Se prepar las siguientes soluciones de reserva:


EXTRACTO CON METANOL: Se midi un volumen 0.1 ml del
extracto seco de flavonoide y se disolvi en 10 ml de metanol,
llevar por nombre Reserva Matriz.

Metanol

METXIDO DE SODIO: El siguiente reactivo utilizado fue


metxido de sodio, durante su preparacin se pes 0.624 g de Na
metlico recin cortado y se disolvi en 25 ml de metanol.

Solucin de metxido de sodio

TRICLORURO DE ALUMINIO: Se Agreg 5.067 gr de AlCl3


anhidro en 100 ml de metanol.

Tricloruro de
aluminio (AlCl3) al
5% en metanol

CIDO CLORHDRICO: Se utiliz una solucin de 1N de HCl.

HCl 1N

3. ANLISIS ESPECTRAL
Se preparan 2 celdas de cuarzo una usada para la muestra
matriz antes de su uso se lava con unos pocos ml de la
solucin de reserva matriz y para la solucin blanco se
vierte 10 ml de metanol, el espectro muestra un pico a 535
nm con una absorcin de 0.755.

Medicin de volumen de
flavonoide

Medicin de metanol

Un tubo de ensayo A contiene la reserva matriz, a esta se


le agrega 3 gotas de la solucin de metxido de sodio, y el
tubo de ensayo B es preparada para usarla como blanco, se
lav una celda con el contenido del tubo A y se verti
procurando que no enrace, el contenido del tubo B se
destin para la celda
blanco y se procedi a la
caracterizacin a 525 nm y con una absorcin 0.354.

Adicin de 3 gotas de solucin de


metxido de sodio a la reserva
matriz.

De la reserva matriz se vierte 6 ml a un tubo de ensayo y se


agregan 3 gotas de la solucin de tricloruro de aluminio y se
lava una celda destinada para la muestra, y a la celda para
el blanco se lava con la misma proporcin 6 ml de metanol
y 3 gotas de tricloruro de aluminio, vertiendo el contenido
procurando que no enrace, se caracteriz a una longitud de
onda 555 nm y a una absorcin 0.615A.
Inmediatamente despus de haber realizado el mtodo
espectroscpico, agregar a ambas celdas tanto blanco
como muestra tres gotas de HCl, agitar cuidadosamente y
secar con papel tis, se caracteriz a 525 nm y a una
absorcin
de
0.64A.

RESULTADOS
Como consecuencia de las interacciones soluto disolvente se originan con
frecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos de bandas y otros
fenmenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En este
sentido, no es posible hacer predicciones de forma general. nicamente
mencionar algunos trminos relacionados con los desplazamientos espectrales:
desplazamiento batocrmico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en un
desplazamiento del mximo de absorcin hacia longitudes de onda mayores
(este efecto suele producirse en disolventes de alta constante dielctrica).
Desplazamiento hipsocrmico o desplazamiento hacia el azul, es el
desplazamiento hacia longitudes de onda ms cortas.

1. Se aplic la tcnica a la Reserva Matriz solucin o.1 ml de


flavonoide en 10 ml de metanol, se muestra un pico a 535 nm con
una absorbancia 0.755A. El metanol tiene una constante dielctrica
=32.7 menos que el agua, es menos polar y el grupo CH3 es ms
grande y ocasiona mayor aglomeracin que el segundo H del agua.

2. Se aplic la tcnica ahora con el reactivo metxido de sodio,


compuesto que resulta al reaccionar metanol con sodio, su
comportamiento es completamente diferente al acetato sdico un
compuesto polar formado por iones sodio e iones acetato, esta sal
es estable frente al agua, en la que simplemente se disocia en sus
iones, el metilato sdico o metxido de sodio es descompuesto por
el agua dando metanol e hidrxido de sodio. Muestra un pico a una
longitud de onda 525 nm con una absorbancia 0.354 A. Tiene un
desplazamiento
hipsocrmico.

3. Ahora se caracterizara con el reactivo Tricloruro de aluminio, al


tricloruro de aluminio (AlCl3) tiene una estructura espacial trigonal,
siendo simtrica y por lo tanto apolar. Una molcula covalente ser
polar, en el caso de que, teniendo enlaces covalentes polares, no
posee una simetra, por lo que no se anularan los momentos
dipolares de cada uno de sus enlaces y la molcula global tendr
un momento dipolar permanente. Por el contrario, si la molcula
posee simetra, se anularn sus momentos dipolares y ser apolar.
Se observ un desplazamiento hacia el rojo o desplazamiento
batocrmico, que slo se da en disolventes con alta constante
dielctrica, lo cual difiere con las caractersticas del solvente.
Muestra un pico a 555 nm y una absorbancia 0.615 A.

4. Una vez realizada la espectrofotometra con el disolvente AlCl3,


ahora se le agregaran 3 gotas de HCl tanto a la celda de la muestra
como a la celda blanco, se homogeniz y se llev a barrido, la banda
se desplaz a 535 nm con una absorbancia 0.640 A. Con un
desplazamiento
hipsocrmico.

Discusiones:

El mtodo ms usual para un anlisis preliminar de la estructura de un


flavonoide es quizs la absorcin UV-Vis, esta tcnica es usada tanta para
identificar el tipo de flavonoide como el modelo de oxigenacin. Este
ltimo puede adems ser mejor definido por el uso de reactivos de
desplazamiento de los cuales, como su nombre lo indica, provoca el
desplazamiento de las bandas de absorcin.
Las antocianinas presentan el mximo de absorcin cerca de 500-550nm,
muy similar a los de sus agliconas 1. Esto se comprueba en la parte
experimental ya que al poner el extracto en un metanol se observ un pico
de 535nm.Notese que esos valores cambian con el solvente, son menores
en agua que en metanol y sufren un corrimiento del mximo de absorcin
a mayores longitudes de onda en medio acido 2. En el presenta trabajo se
le agrego 3 gotas de HCl concentrado a la solucin de AlCl3 observndose
una longitud de onda de 535nm, el cual presentaba un pico parecido
cuando estuvo en etanol el extracto. Por ejemplo la cianidina-3-ramnosida
absorbe a 507,523,535 y 545 nm en agua ,metanol, etanol y etanol-cido
clorhdrico, respectivamente .Al aumentar el nmero de OH conjugados
con el sistema insaturado el mximo de absorcin tambin se desplaza a
mayor longitud de onda. Este comportamiento a su vez se observa
cuando se alcaliniza la solucin. El espectro UV de compuestos que no
contienen al menos dos grupos OH en posicin orto, as como aquellos
que no pueden formar quelatos entre el carbonilo C-4 y un OH libre en C-5
o C-3 , no son afectados por la adicin de cloruro de aluminio, que
provoca la formacin de complejos amarillos estables como los que se
identificaron en la figura 1.Estos complejos producen un corrimiento a
mayores longitudes de onda de la Banda I de 20 a 45 nm y un poco
menor para la Banda II(10-20nm).

Figura 1

Los OH libres tambin causan un desplazamiento batocromico en


soluciones alcalinas y este es mayor en la medida que aumente la
conjugacin a travs del sistema enona, como por ejemplo aquellos que
estn en la posicin 4.La ionizacin de los OH en C-3 y C-4 dan lugar a
un corrimiento de la Banda I pero no afecta la Banda II 3 .
En el laboratorio se agreg 1,25g de AlCl3 anhidro reactivo a 25 ml de
etanol, de esta solucin se agregaron 3 gotas a 2-3ml del extracto de
Ayrampo que estaba en 10 ml de metanol. Se pudo observar un
desplazamiento batocrmico (en el cual la longitud de onda de absorcin
de una sustancia se desplaza hacia longitudes de onda mayores) en este
caso de 555nm.
El metoxido de sodio causa ionizacin de todos los grupos hidroxilos, la
degradacin del espectro con el tiempo es un buen indicador de la
presencia de grupos sensibles a lcalis 4 .Al adicionar dos gotas de
NaOMe al extracto de Ayrampo con MeOH, se observ un pico de
525nm, vindose un desplazamiento de 535 nm a 525nm.Al cabo de
tiempo si se la vio la degradacin del espectro lo cual indica la presencia
de grupos a lcalis.
El acetato de sodio, causa significativamente ionizacin de nicamente el
grupo hidroxilo ms acido del flavonoide y es usado bsicamente para
detectar la presencia de
un grupo 7-hidroxilo libre5.En la parte
experimental al agregar este reactivo a nuestro extracto con metanol
pudimos observar ruidos los cuales no pertenecen a las antocianinas pero
se estableci un posible pico el cual fue a 305nm.

Figura 2

CONCLUSIONES

1. Las antocianinas presentan el mximo de absorcin cerca de 500550nm, las cuales tuvieron un movimiento batocrmico o
hipsocrmico al momento de aadir los reactivos conocidos como
tambin como solventes. Los cuales determinaron un desplazamiento
a nivel de la banda de absorcin. Las cuales varan con el pH del
medio y esto permite la determinacin de antocianinas.

2. Nuestro extracto muestra un pico con el metanol a 535 nm con una


absorbancia 0.755 A ; con el reactivo metxido de sodio muestra un
pico a 525 nm con una absorbancia 0.354 A ; con el tricloruro de
aluminio muestra un pico a 555 nm y una absorbancia 0.615 A y al
agregarle HCl la banda se desplaz a 535 nm con una absorbancia
0.640 A.

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