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UNIVERSIDAD

NACIONAL DE
SAN AGUSTIN
FACULTAD DE
CIENCIAS
NATURALES
Y FORMALES
ESCUELA
PROFESIONAL
DE QUIMICA

CURSO: BIOQUIMICA

TRABAJO DE INVESTIGACIN: IDENTIFICACION DE ACIDO URICO

DOCENTE: ROXANA
PRESENTADO POR:
TTITO HUAHUACHAMPI ANGLICA

28/07/15

AQP- PER

ANALISIS DE CIDO RICO


Es un producto de desecho que resulta tras el metabolismo del nitrgeno en
el cuerpo humano, que se elimina sobre todo por la orina.
Niveles normales: 2-7 mg/dl
Niveles altos: las principales causas por las que se incrementan las cifras
de cido rico son: gota, litiasis renal e insuficiencia renal. Aunque tambin
puede ocurrir en casos de diabetes mellitus y alcoholismo. Consumir con
frecuencia alimentos ricos en protenas como el marisco, las espinacas, el
pescado azul y las carnes rojas tambin favorece el incremento del nivel de

cido rico. Incluso puede aparecer un nivel alto despus de un ejercicio


extenuante.
Niveles bajos: el descenso del cido rico aparece en algunas
enfermedades en los tbulos renales (sndrome de Fanconi) o en las dietas
muy bajas en protenas

Mtodo para la Determinacin de cido


rico en Suero
Fundamento del mtodo de la uricasa
El cido rico es oxidado por la Uricasa a Alantna y perxido de hidrgeno
que en presencia de peroxidasa, 4-aminofenazona y 2-4 diclorofenol
sulfonato un compuesto rosceo.
La intensidad de quinoamina roja formada es proporcional a la
concentracin de cido rico presente en la muestra ensayada. El cido
rico y sus sales son el producto final del metaboliso de las purinas. En una
insuficiencia renal progresiva hay una retencin en sangre de urea,
creatinina y cido rico. Niveles altos de este ltimo son indicativos de
patologa renal y generalmente se asocia con la gota.
PRINCIPIO DE LA REACCIN:

Material

Suero, plasma u orina (en este caso usamos suero)


Bao Maria de 37C
Timmer -Pipetas y Micropipetas
Tubos y Cubetas
Fotmetro o Espectrofotmetro.
Solucin Cloruro de Sodio 0,9%

Reactivos
HDBS...........................0,80 mmol/l
4AF..........................250 mmol/l
Uricasa........................................................................> 100 U/l
Peroxidasa..................................................................>1200 U/l
TRIS.............................................................120 mmol/l pH=7.6
Estndar: Solucin cido Urico 10,0 mg/dl
Cubetas de 1 cm de paso de luz
Material habitual (pipetas, tubos)

MUESTRA Suero, plasma recogido con EDTA o heparina. Orina recolectada


durante 24 horas
Procedimiento

Mtodo para la Determinacin de cido


rico en Suero

Tubo1
(Blanco): 1
mL RT

Se usarn tres tubos, cada uno de ellos


tendr

Tubo2 (Patrn): 1
mL RT + 25 L de
patrn

Tubo3
(Muestra): 1 mL
RT + 25 L de
muestra

Se medir con el espectrofotmetro a 520


nm.
Mezclar e incubar 5 minutos a 37C en el bao
Leer la absorbancia A 520 nm del patrn y la muestra
frente al blanco de reactivo.

Clculos
Para el suero:

Identificacin de cido rico en gallinaza


como en alimento
A travs de este mtodo es posible determinar el contenido de cido rico y
sus sales tanto en gallinaza como en alimentos e ingredientes que los
constituyen.
Reactivos

Solucin de hidrxido de sodio. Disuelva 50 g de NaOH en 50 ml de


agua, mezcle bien y almacene la solucin en un envase de plstico.

Solucin neutra de formaldehido.


1. Mezcle 30 ml de sta con 50ml de solucin de NaOH IN y
25ml de solucin de Perxido de hidrgeno (20 volmenes).
Caliente en bao de vapor hasta que no haya ms
efervescencia. Enfre y titule con NaCl IN usando indicador de
Fenolftalena. Realice una titulacin de blanco usando 3 ml de
agua en lugar del formaldehdo y calcule la concentracin
como sigue:
1ml de la solucin de NaOH IN = 0.0300 g de formaldehdo.
Concentracion de formaldehdo (g/100 ml) = ((B-T)
((0.0300 100)/3)
Donde:
B = Titulacin del blanco.
T = Titulacin de la muestra.
2. Prepare una solucin neutra que contenga 17.5g de
formaldehdo con 250ml de agua y 500ml de etanol. Ajuste el
pH a 7.0 con una solucin de NaOH 0.1N. Diluya a 1000ml con
agua, mezcle y ajuste nuevamente el pH de ser necesario.

Solucin buffer de Succinato. Disuelva con calentamiento 29.5g de


cido succnico en 750ml de agua y 20ml de la solucin de NaOH.
Deje enfriar y adicione una cantidad adecuada de solucin de formol
que contenga 17.5g de formaldehdo, mezcle bien y ajuste el pH a 6.0
con la solucin de NaOH. Diluya a 1000ml con agua destilada, mezcle
y ajuste el pH si es necesario.

Solucin de tiosulfato de sodio. Disuelva 25g de Na 2S2O3.5H2O en


1000ml de agua destilada.

Solucin de lactato de plata. Disuelva con calentamiento 3g de


lactato de plata en 50ml de agua destilada y 1ml de cido lctico.

Diluya a 100ml con agua, filtre y almacene en un frasco obscuro. No


lo exponga a la luz directa.

Solucin de magnesio amoniacal. Disuelva 8.75g de MgSO 4.7H2O y


17.5g de NH4CL en 50ml de agua. Agregue 30ml de NH 4OH (d =
0.88g/ml), mezcle bien y diluya a 100ml con agua.

Reactivo de Benedict y Hitchcock. Mezcle 35ml de solucin de lactato


de plata con 15ml de solucin de magnesio amoniacal. Adicione 50ml
de hidrxido de amonio (d = 0.88 g/ml) mzclese bien. Preprese
inmediatamente antes de usarse.

Solucin estndar de cido rico. Pese 250mg de cido rico con una
precisin de 0.1mg y transfiralo a un matraz de fondo redondo
acoplado a un condensador de reflujo. Adicione 100ml de la solucin
de formaldehdo etlico y caliente a reflujo en un bao de vapor por
30min agitando frecuentemente. Enfre y transfiera a un matraz
volumtrico de 250ml, lavando el matraz redondo con sol. de
formaldehdo etlico, afore con esta solucin y mezcle. 1 ml contiene
1 mg de cido rico.

Eter de petrleo, punto de ebullicin 40 60C.

Materiales y Equipo

Espectrofotmetro con celdas de cuarzo de 10 mm.

Tubos de cristal para percolacin, con aproximadamente 240 mm de


longitud, 18 mm de dimetro interno, y en la parte inferior
aproximadamente 120mm de longitud y 8 mm de dimetro interno.

Extraccin del cido rico:


1. De la gallinaza: Pese con una aproximacin de 0.001 g cerca de 0.4g
de gallinaza seca y colquela en un matraz de fondo redondo de
150ml. Adicione 60ml de solucin neutra de formaldehdo, conecte a
un condensador de reflujo y caliente en bao de vapor por una hora.
Enfre y filtre a travs de un crisol (Porosidad 4) a un matraz
volumtrico de 100ml. Enjuague el matraz 3 veces consecutivas con
porciones de 10ml de solucin de formaldehdo etlico, pasando cada
porcin por el crisol de filtracin al matraz volumtrico. Afore con la
misma solucin y agite.
2. De los alimentos: Pese 4 a 5g de muestra con una aproximacin de
0.001 g y desengrsela por extraccin con ter de petrleo. Transfiera
cuantitativamente la muestra desengrasada a un matraz de fondo
redondo y remueva el solvente residual con una corriente suave de
aire. Contine el anlisis como previamente se seal, iniciando con
la adicin de 60 ml de solucin de formaldehdo etlico.

Determinacin

Identificacin de cido rico

Transfiera con una pipeta de 20 ml de extracto de la


muestra pre pesado

centrifugar los 50 ml

Adicione 10 ml del reactivo de Benedict y


Hitchcock

mezcle bien y djelos reposar en la oscuridad


por una hora

Centrifuge a 2000 rpm por 15


min

Retire el sobrenadante y deje escurrir por 10


min

Cuidadosamente limpie cualquier lquido


remanente sin perturbar el precipitado

Adicione 20 ml de solucin de tiosulfato de


sodio

Disuelva el precipitado, agitando con una


varilla de vidrio delgada (solucin preparada)

En un matraz de 200 ml con 40 ml de solucin


buffer de succinato

Adicionar 5 ml de la solucin
preparada

Afore con agua destilada y mezcle bien

Mida la absorvancia de la solucin a 294 nm en


celdas de slice de 10 mm

compararla con una solucin preparada


mezclando 5 ml de solucin de tiosulfato de
sodio con 40 ml de solucin buffer de succinato
aforada a 200 ml con agua destilada

Determine la cantidad de cido rico mediante


una curva de calibracin

Curva de Calibracin:

CURVA DE
CALIBRACIN

En tubos de centrifuga
transfiera con una pipeta 2,
4, 6, 8, 10 y 12 ml de
solucin estndar de cido
rico (equivalentes a una
cantidad similar de cido
rico en mg)

trace la curva de calibracin


graficando absorvancia (y)
contra la cantidad
correspondiente de cido
rico en mg (x).

llvelos a 20 ml con la
solucin de formaldehdo
etlico

Mida la absorvancia de la
solucin

Adicione a cada tubo 10 ml


de reactivo de Benedict y
Hitchcock

Contine el mtodo como


en la determinacin a partir
del centrifugado

mezcle bien y djelo


reposar en la oscuridad por
una hora

Expresin de Resultados
El contenido de N del cido rico como % de la muestra est dado por la
frmula:
% N = A/(6 W)

Donde
A = mg de cido rico (en la alicuota del extracto de la muestra)
determinado por la medicin fotomtrica.
W = peso de la muestra en g.

IDENTIFICACION DE ACIDO URICO CON El Lector de


tiras usando
EasyTouch GCU

Es un monitor para medir cido rico (la gota) en la sangre mediante la


lectura de tiras reactivas. EasyTouch GCU es una herramienta para controlar
el azcar en sangre, cido rico y colesterol.

EQUIPO
RANGO: 3-20mg/dL (179-1190mmol/L
Los resultados se pueden obtener en el tiempo: 20 segundos (cido rico)
Tiras Automtica de Prueba de cido rico: 10
dispositivo perforador / puncin
Lanceta
Pantalla LCD y Batera
Memoria disponible para acomodar los datos de cido rico: 50

PROCEDIMIENTO

Identificacin de cido rico


Se calibra el equipo hasta el valor de 105.1
mg/dL

Las muestras de sangre se toman usando


un perforador de lanceta

Introducir la tira en el equipo

Poner en el crculo de la tira la


sangre

Los resultados del examen sern ledos


en unidades
de mg / dl.

Mtodo de Heilmeyer y
Krebs
En medio alcalino (carbonato de sodio) el cido rico es oxidado a alantona
por intermedio del cido fosfotngstico, el cual se reduce a azul de
tungsteno. El azul de tungsteno formado es directamente proporcional a la
concentracin de cido rico presente en la muestra. El color es ledo por
espectrofotmetro a 650 a 700 nm de longitud de onda.
cido rico
DE TUNGSTENO

+ H3PW12O40 +

O2 Alantona + CO2 + AZUL

(cido fosfotungstico)
Interferentes: protenas, lo que es un paso obligatorio antes de la
determinacin del cido rico, esto gracia al cido tricloroactico, tngstico
y fosfotngstico, sulfato de zinc o hidrxido de bario. Interferentes: sustratos
reducidos en general (glutatin, cido ascrbico, salicilatos, fenoles,
tirosina, cistena, etc.
Linealidad:1-12mg/dL El acetato de uranio se emplea clnicamente para
cuantificar sodio en suero.
Acetato de uranio precipita protenas, y se utiliza este y no otro porque es
una sal neutra que no modificara el pH de la solucin (es radioactivo) y el
carbonato de sodio entrega el medio alcalina.

METODO DE HPLC PARA EL


ACIDO URICO
MATERIALES

El equipamiento HPLC incluy:


Columna Nucleosil ODS RP-C (250 x 40 mm) empaquetada con
partculas de 7 mm de dimetro, precolumna de Nucleosil ODS con
partculas de 10 mm de dimetro

Bomba de doble pistn (Modelo 2150) unidad controladora (Modelo


2152)
monitor UV-VIS (Modelo 2151) e integrador-calculador (Modelo 2220),
todos de LKB Bromma (Suecia).

Como fase mvil se utiliz una solucin de KH2 PO4 0.05 M (pH de 5.0). El
flujo de la fase mvil se ajust a 1.0 mL/min. El cido rico eluido se
monitore a 280 nm.
REACTIVOS
Los reactivos empleados fueron de calidad analtica:

solucin madre de cido rico


cido perclrico
solucin de NaHPO4

Calibracin de la aplicacin HPLC:


Calibracin de la aplicacin HPLC

se prepar una solucin madre de cido


rico 5.95 mmol/L

disolviendo 100 mg de cido rico p.a. en


100 mL de una solucin de Li2CO3 0.01 M

Se construy una curva de calibracin


para cada corrida

diluyendo 100 L de la solucin madre de


cido rico 5.95 mmol/L

En volmenes adecuados de la fase mvil para


obtener patrones de 59.5, 119, 238, 297.5,
446.25, 595, 892, y 1190 mol/L,
respectivamente
Los patrones de calibracin, las muestras
clnicas frescas, los sueros de control y las
muestras de suficiencia se
desproteinizaron con cido perclrico 0.4
mol/L.4 500 L del sobrenadante

se mezclaron con 500 L de una solucin de


NaHPO4 0.25 mol/L
Construccin de la curva dosis-respuesta: el contenido de cido rico
25 L de la mezcla se inyectaron en el
en las muestras desconocidas se calcul mediante una lnea recta ajustada
cromatgrafo con una jeringuilla Hamilton.
a la relacin altura-del-pico vs concentracin de cido rico.
Ensayo de deteccin enzimtica del pico de cido rico:
Ensayo de deteccin enzimtica

Poner 100 L de la solucin


madre de cido rico 5.95
mmol/L

se incubaron con 100 L (1.7 U) de uricasa

en 1000 L de una solucin tamponada de


fosfato monosdico/disdico 0.15 M (pH de
7.0)

durante 30 minutos a 37C.

La mezcla resultante se desproteiniz 4 y 25


L del sobrenadante se inyectaron en el

Se realizaron incubaciones en paralelo de 100 L de la solucin madre de


cido rico 5.95 mmol/L en ausencia de uricasa.
Tambin se incub, en presencia o ausencia de uricasa, suero humano
suplementado con un volumen de la solucin madre de cido rico 5.95
mmol/L para obtener una concentracin final de 250 mol/L.
Ensayo de recuperacin: los patrones de calibracin se prepararon
diluyendo la solucin madre de cido rico 5.95 mmol/L con volmenes
adecuados de suero humano o equino, en vez de fase mvil. El suero

suplementado se desproteiniz y se ensay por duplicado mediante la


aplicacin
Estudios de interferencia: varias sustancias que pudieran interferir con la
determinacin de cido rico mediante el mtodo
enzimtico/espectrofotomtrico se ensayaron mediante la aplicacin HPLC,
primero como una solucin pura del analito y despus como una mezcla v/v
con cido rico 300 mol/L.
Las sustancias analizadas en los ensayos de interferencia fueron:
hemoglobina 3.5 g/L, urea 25 mmol/L, secobarbital 20 mg/mL, diazepan
(valium) 20 mg/mL, amobarbital 20 mg/ mL, cido acetilsaliclico (aspirina)
10 mg/mL, fenobarbital 20 mg/mL, cido ascrbico 25 mmol/ L y glucosa 22
mmol/L.

Bibliografa:

file:///C:/Users/Toshiba/Downloads/187447965-Anlisis-Sangre.pdf
http://groupon.co.id/product/promo.php?i=570
http://www.fao.org/docrep/field/003/ab489s/ab489s04.htm
http://www.linear.es/ficheros/archivos/80_1161005C.pdf
http://es.slideshare.net/jeaguas/creatinina-ac-urico-gota
http://www.medigraphic.com/pdfs/patol/pt-2001/pt014d.pdf
https://books.google.com.pe/books?id=Av4IIsyHqcC&pg=PA659&lpg=PA659&dq=acido+urico+determinacion+con+version
+de+azul+tungsteno&source=bl&ots=Vo6ARXPp98&sig=8GOMVR8FnoIed0
5tn6i7TxTJ-eM&hl=es-419&sa=X&ved=0CBsQ6AEwAGoVChMI1NPA_77xgIViHs-Ch26XQzD#v=onepage&q=acido%20urico%20determinacion
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