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MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA - Tomo II: Microbiología Ambiental II

Manacorda A. M., Álvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Año 2013

Capítulo 6
RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETEROTROFOS TOTALES
EN SUELO
Objetivo
 Determinar el tamaño de la población de diferentes tipos de suelo mediante la Técnica
de Recuento del Número más Probable (NMP).
Introducción
El suelo representa uno de los hábitats microbianos más significativos, tanto en términos de
biomasa como de actividad microbiana. El suelo alberga gran riqueza de especies vegetales,
animales y microbianas. Los microorganismos del suelo son los que mantienen activo el ciclo
de los nutrientes de los compuestos químicos más importantes – C, N, S, P – que las plantas
requieren para su crecimiento. Entre los organismos del suelo se establecen interacciones que
contribuyen en las características propias del suelo.
La actividad microbiana del suelo refleja las reacciones bioquímicas que suceden dentro de
este complejo y heterogéneo sistema. Los mismos tienen funciones claves en el equilibrio del
ecosistema.
Este ambiente alberga una gran cantidad de microorganismos que se nutren de los exudados
radiculares, ricos en aminoácidos, ácidos orgánicos y factores de crecimiento, como así
también favorece distintos tipos de interacciones biológicas. Los microorganismos son
fundamentales en los procesos biológicos y como promotores del crecimiento vegetal.
La distribución de los microorganismos en el suelo siguen patrones de agregación y es muy
dinámica. En ella influyen factores intrínsecos (relacionados con características de cada
microorganismo) y factores extrínsecos (aquellos que proceden del ambiente). Esto factores
que regulan la distribución de los microorganismos desde el ambiente son: estructura del suelo,
disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, el potencial redox y la disponibilidad de materia
orgánica.
La rizósfera es la región del suelo cercano a las raíces de las plantas, y es considerado un
ambiente apropiado para el desarrollo de los microorganismos por la presencia exudados
radicales y humedad, como dos principales características. En la rizósfera ocurren importantes
interacciones microbianas que implican el intercambio o la competencia por nutrientes y hábitat.
Algunas son relaciones simbióticas, por ejemplo entre bacterias u hongos con las raíces de las
plantas (micorrizas, nódulos para la fijación de nitrógeno) y otras son relaciones antagónicas,
como ser predación (protozoos – bacteria), amensalismo (producción de antibióticos) y
parasitismo (hongos que atacan las raíces de las plantas).
La composición de los microorganismos del suelo es muy diversa, encontrándose bacterias,
hongos, actinomicetos, protozoos y algas. La población bacteriana heterótrofa aerobia está
compuesta principalmente por géneros gram positivos, siendo la mayoría de los géneros
Clostridium, Bacillus, Arthobacter. La población gram negativa generalmente está compuesta
por los géneros Pseudomonas, Flavobacterium, Rizobium, Azospirilum, entre otros. Los
actinomicetes característicos del suelo pertenecen al género Streptomices y Nocardia, tienen
funciones importantes en la descomposición de materia orgánica y producción de antibióticos.
Los hongos contribuyen en gran medida a la biomasa microbiana del suelo, en cuanto a tamaño
de la población, diversidad y funciones. Los géneros más comunes son Penicillium, Aspergillus,
Fusarium, Cladosporium, Mucor, entre muchos otros.
Es importante, además, tener en cuenta que cuando microorganismos indeseables penetran en
el suelo pueden cambiar sus propiedades, desequilibrando la distribución y el orden de la
comunidad nativa. La presencia de microorganismos patógenos implica un riesgo para la salud,
por la posible transmisión de enfermedades por el contacto con dicho suelo

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correspondiente al segundo nivel de dilución. Se procede realizando las diluciones sucesivas hasta obtener una dilución 1:10. S. Esto corresponde al primer nivel de dilución (1:10). En este caso el interés está puesto en los microorganismos con un metabolismo heterótrofo por lo tanto el medio de cultivo particular a utilizar es el caldo Nutritivo. estos 10 tubos conteniendo la solución del suelo.000.000. Los tubos sembrados se incuban durante 7 días a 20 ºC. En este caso se siembran tres tubos para cada dilución aunque se pueden utilizar también cinco réplicas de cada uno de ellos. El número de microorganismos obtenido está determinado por fórmulas de probabilidad. lo que disminuye el desvío.p pH final: 6. Álvarez A..D estéril.D) estéril. Se agita en el vórtex la primer dilución y se toma 1 ml del sobrenadante con una pipeta estéril. incluyendo su interacción con la atmósfera y ecosistemas acuáticos. Pezzullo S. Técnica de Recuento del Número Más Probable Las técnicas del Número Más Probable (NMP) se basan en el concepto de que el nivel de dilución de la muestra original necesaria para obtener un resultado negativo en un medio de cultivo particular está relacionado con el tamaño de la población en la misma.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. -10 que será la dilución 10 .s. el procedimiento se realiza por triplicado. P.9 ± 0.2 5 gr 3 gr 1000 ml Procedimiento Se pesa 1 g de la muestra de suelo a examinar y se diluye en un tubo de ensayo que contenga -1 9 ml de agua destilada (A. y el estudio de sus funciones contribuye al conocimiento global del ambiente. se procede a sembrar una alícuota de cada uno de ellos en caldo nutritivo (fig 1).MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . -2 agregando dicho volumen a un segundo tubo con A.1 ml de cada dilución. Se toma con una pipeta automática 0. De esta manera se espera que los primeros tubos tengan mayor concentración microbiana y que en los últimos tienda a cero. Una vez que se dispone de las diluciones de las muestras. A dicho tubo se lo rotulará “10 “. Finalizado este tiempo se procede a realizar el recuento. Año 2013 El reconocimiento de esta diversidad de microorganismos en el suelo. caldo Nutritivo Pluripeptona Extracto de carne Agua destilada c.. 2 . Por las características de sus componentes es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. un cálculo de la densidad media de microorganismos heterótrofos en la muestra. lo que reviste un pilar fundamental para lograr ecosistemas sustentables.000. Este tubo será rotulado como 10 (1:100). M. & Cuadros D. D.

Cálculo del Número mas Probable Al cabo de una semana se leen los resultados. se lleva a estufa.5 Número característico 302 310 311 Número de M.O. Álvarez A. S. En este caso.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A.3 Número característico 201 202 210 Número de M. M.5 4. & Cuadros D.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . Para ello se toman 5 g de la muestra sembrada. a 100 ºC durante 48 hs. D. El primer dígito del número característico corresponderá al menor nivel de dilución en el que todos los tubos sean positivos.. 1: Diluciones seriadas y siembra en caldo nutritivo por triplicado Nota: debe tenerse en cuenta que la muestra utilizada siempre tiene cierto nivel de humedad. Al número obtenido se lo multiplica por la inversa de la dilución (dilución de donde se obtuvo el primer dígito del número característico). el número más probable de microorganismos presentes en la muestra. en el que el inóculo de partida es un gramo de suelo. Para ello se deberá calcular la humedad de la misma (ver “Nota”). con el mismo se ingresa en la tabla y se lee el número más probable de microorganismos.4 2. Una vez que se ha obtenido el número característico.* 6.3 0.. Se toma nota.5 7. del número de tubos positivos (+) y se obtiene un número característico representado por tres cifras. y se toma el nuevo peso de dicha porción. tomándose como positivos a aquellos tubos con desarrollo (se ven turbios debido a la proliferación de microorganismos). Tabla de Mc Crady (para tres réplicas por dilución) Número característico 000 001 010 Número de M. Pezzullo S.0 1.* 1. Año 2013 Fig.5 3 . mediante un método estadístico. se refiere el número final al peso seco de la muestra. por lo tanto los resultados obtenidos están en relación con un gramo de peso húmedo y deberán referirse a un gramo de peso seco.* 0.0 0.O.. P.O. En la tabla de Mc Crady figuran todas las combinaciones posibles para las que se ha calculado. Con estos datos se calcula el porcentaje de humedad de la muestra de suelo para luego corregir el número de bacterias hallado. para cada dilución.

es decir que corresponde a la dilución de la primer cifra del número característico. & Cuadros D.0 323 30.5x10 bacterias/g de suelo húmedo 1 Ejemplo 2: 20x10 bacterias /g de suelo húmedo Además. 1989.0 2..P de microorganismos 4.0 3. P.5 4. Pezzullo S.5 4. APHA.0 3. 4 Ejemplo 1: 4. Part 9000. D.7 1.5 4..0 3. a modo de ejemplo.5 321 15.5 313 16.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA .0 3. 4 .4 0. Álvarez A. -1 Nivel de dilución Ejemplo 1 10 +++ (3) +++ (3) Ejemplo 2 -2 10 +++ (3) ++(2) -3 10 +++ (3) ++(2) -4 10 +++ (3) --(0) 10 +-(1) --(0) -5 10 --(0) --(0) -6 10 --(0) --(0) -7 10 --(0) --(0) -8 10 --(0) --(0) -9 10 --(0) --(0) -10 -4 Ejemplo 1: número característico 310 (para la dilución 10 ) -1 Ejemplo 2: número característico 322 (para la dilución 10 ) Número característico 310 322 Ejemplo 1 Ejemplo 2 N.5 20 A este número obtenido de la tabla debe multiplicárselo por la inversa de la menor dilución en la que se han hallado 3 (+).9 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301 2. los resultados obtenidos para dos siembras distintas con tres repeticiones para cada nivel de dilución.M. 17th ed.0 3.O : microorganismos En la siguiente tabla se indican.0 331 45.0 Año 2013 312 11.0 332 110. D. 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 0. a este valor se lo debe corregir en función del porcentaje de humedad de la muestra.1 1.0 * M. American Water Works Association & Water Pollution Control Federation. Standard Methods for the examination of Water and Wastewater.0 2. Bibliografía American Public Health Association (APHA).5 1.0 330 23.0 333 140.C.0 320 9.6 0.1 1. Washington. M.0 322 20.1 0. como se señaló anteriormente.7 1.6 0.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A.6 0. S.USA.