You are on page 1of 8

MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA - Tomo II: Microbiología Ambiental II

Manacorda A. M., Álvarez A. S., Pezzullo S. D. & Cuadros D. P.

Año 2014

Capítulo 5
ANTIMICROBIANOS
Objetivos
 Verificar el grado de sensibilidad o la resistencia de los microorganismos frente a distintos
agentes antimicrobianos.
 Reflexionar acerca de los riesgos que implica la posible dispersión de la resistencia a los
antimicrobianos en el ambiente.
Bunquer
Introducción
Se conoce como antimicrobiano a toda sustancia química que impide el desarrollo de un
microorganismo o que provoca su muerte. Los agentes que destruyen o matan las bacterias se
denominan bactericidas, mientras que los agentes que inhiben el crecimiento bacteriano se denominan
bacteriostáticos.
Los antimicrobianos pueden ser de tres tipos:
1. Desinfectantes: son usados para matar microorganismos sobre superficies de objetos o
sistemas inanimados, son demasiado tóxicas para aplicarla directamente a los tejidos.
Reducen el número de gérmenes viables, pero no eliminan a los esporulados.
2. Antisépticos: son aplicables a la piel o mucosas de humanos y animales, reducen y controlan la
presencia de gérmenes potencialmente patógenos.
3. Antimicrobianos de uso clínico-terapéutico: son sustancias capaces de controlar la presencia
de microorganismos patógenos que han invadido tejidos u organos profundos en humanos y
animales. Se los denomina también como antibiótico, dentro de este grupo se pueden
considerar dos categorías:
a. Antibióticos: antimicrobianos de origen natural.
b. Quimioterápicos: antimicrobianos de origen sintético.
Los antimicrobianos, a diferencia de los desinfectantes y antisépticos, poseen toxicidad selectiva. Esto
indica que no afectan a las células del hospedador, sino solo a las células bacterianas que se desean
eliminar, debido a las diferencias existentes entre ellas.
Los antimicrobianos se pueden clasificar de acuerdo a sus mecanismos de acción, ellos son:
- Inhibición de la síntesis de la pared celular
- Inhibición de la síntesis proteica
- Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos
- Inhibición de las vías metabólicas
- Alteración de la función de la membrana bacteriana
Según el número de especies bacterianas sobre las cuales tiene efecto el antimicrobiano, se clasifican
en antibiótico de amplio espectro o de espectro limitado. Los antimicrobianos de amplio espectro son
capaces de actuar sobre una gran cantidad de bacterias gram positivas y gram negativas, como las
cefalosporinas, aminoglucósidos y quinolonas. El grupo de las tetraciclinas (inhibidores de la síntesis
proteica) tienen la capacidad de actuar sobre bacterias gram positivas, gram negativas, las rickettsias,
clamidias, micoplasmas y espiroquetas.
En cambio, los antimicrobianos de espectro limitado actúan sólo sobre bacterias gram positivas o gram
negativas, sobre cocos o bacilos, sobre bacterias aerobias o anaerobias, etc. Por ejemplo, la penicilina
es activa frente a Streptococcus spp., Neisseria spp., Clostrodium spp. y cocos anaerobios. El
agregado de un grupo amino a la cadena lateral de la penicilina, dio lugar a la ampicilina y permitió
extender el espectro de acción a los bacilos gram negativos.

1

La primera es una característica presente en todos los miembros de determinado género o especie. Procedimiento 1. es el que más se asemeja al suero en cuanto a pH. La información relacionada con tal resistencia esta frecuentemente codificada en genes que son portados en plásmidos. la falta de higiene y las prácticas deficientes en el control de las infecciones. aún no emparentadas entre sí. Es un hecho ampliamente documentado que la aparición de resistencia a antibióticos se debe primariamente a su uso excesivo y frecuentemente innecesario en humanos y animales. existe una gran cantidad de datos recopilados que avalan la calidad de los resultados de las pruebas de sensibilidad realizadas con este medio. Año 2014 La resistencia bacteriana a los antimicrobianos puede ser intrínseca o adquirida. tanto caldo como agar. El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). recomendó su uso debido a que: muestra una buena reproducibilidad de resultados obtenidos con distintos lotes. Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extracromosómico. P. como así también las probabilidades de transmisión de una persona a otra. Determinación de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM): Método de dilución. La resistencia adquirida está presente sólo en algunas cepas de una especie o género y puede ser el resultado de la adquisición de información genética exógena. osmolaridad. S.. Es considerado como el mejor medio de cultivo para las pruebas de sensibilidad de rutina de microorganismos de rápido crecimiento sin exigencias nutricionales especiales. básicamente mediante mecanismos de recombinación genética bacteriana. de modo que los tratamientos habituales se vuelven ineficaces y las infecciones aumentan su persistencia. D. K+ y Cl-. La inadecuada utilización de antibióticos da como resultado la selección de patógenos con múltiples mecanismos naturales de resistencia. Esto hace que la información portada en los plásmidos se disperse con bastante facilidad entre cepas patógenas y aquellas que no lo son.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. son pruebas de susceptibilidad in vitro que estudian la sensibilidad de un microorganismo a la acción de los agentes antimicrobianos. Este hecho representa un riesgo para la salud pública y una amenaza que involucra a nuevas especies bacterianas y a nuevos mecanismos de resistencia. tiene bajo contenido de inhibidores para sulfonamidas. & Cuadros D.. trimetoprima y tetraciclinas. concentración de Na+. 2 . La resistencia a antimicrobianos ha sido extensamente estudiada no sólo desde el punto de vista clínico sino desde el punto de vista de la genética molecular. Técnicas para la realización de un antibiograma Los antibiogramas. El medio de cultivo Muller Hinton. es adecuado para el crecimiento de la mayoría de las bacterias patógenas. Álvarez A. El medio de cultivo recomendado para estas pruebas es el caldo y agar Muller Hinton (MH). ex National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Consiste en una prueba cuantitativa que permite conocer la mínima concentración de un antimicrobiano necesaria para inhibir el desarrollo de una cepa microbiana después de un período de 16 a 18 horas. por medio del mecanismo de conjugación. que se pueden replicar en forma independiente del cromosoma bacteriano y que son transmisibles entre bacterias. Los microorganismos resistentes son inmunes a los efectos de los antimicrobianos. De este modo es posible que bacterias presentes en suelo y agua que habitualmente no presentan resistencia a antibióticos puedan adquirir esta capacidad y contribuir de este modo a la dispersión de la misma. también denominados antibióticogramas. M. Los factores de riesgo para la dispersión de la resistencia tanto en centros de salud como en la comunidad en general incluyen: la sobrepoblación.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . Pezzullo S.

1):        Preparar una serie de tubos con caldo Muller Hinton con los cuales se prepararán las sucesivas diluciones.3 ± 0. se puede continuar el proceso para determinar la concentración de produce la muerte de los microorganismos. P. equivalente al patrón 0. con concentraciones crecientes del antibiótico a evaluar.5 gr 1. 5. La menor concentración de la droga que no origine crecimiento bacteriano en el subcultivo se interpreta como CLM (ver Fig.3 ± 0. Pezzullo S.5 gr 1000 ml Muller Hinton agar Infusión de carne Peptona ácida de caseína Almidón Agar Agua destilada c.. El volumen final requerido en cada tubo es de 1 ml. M. Dentro de los 15 minutos de preparado el inóculo adicionar a cada tubo de dilución de antibiótico y al tubo control del inóculo. detectado por la falta de turbidez del caldo.2 300 ml 17. El antibiótico de referencia pueden ser obtenido comercialmente. 1) 3 . Muller Hinton caldo Infusión de carne Peptona ácida de caseína Almidón Agua destilada c.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. Preparar el inóculo. Mezclar suavemente. S. para no producir salpicaduras. en caldo sin antimicrobiano como control de inóculo. Concentración Letal Mínima (CLM) La Concentración Letal Mínima (CLM) que es aquella que no sólo inhibe el desarrollo sino que tiene un efecto letal sobre los microorganismos. Se incuba a 35 ºC durante 16-20 horas..1 300 ml 17. & Cuadros D. Los tubos con menor concentración de antibiótico serán los que permitirán el desarrollo de los microorganismos. incubando a 35 °C durante 16-20 hs. el primer tubo que no presente desarrollo microbiano será considerado el que tiene la menor concentración de antibiótico que ha producido la inhibición del crecimiento. Se debe conocer la potencia valorada (en porcentaje o µg/mg) y la fecha de vencimiento. A partir de determinar la concentración que inhibe el desarrollo de la cepa estudiada. Álvarez A. 1 ml de la suspensión bacteriana por debajo del menisco. El almacenamiento de la droga debe hacerse según las recomendaciones del laboratorio productor. La preparación de la suspensión bacteriana es crítica porque una variación en 5 su densidad puede alterar el punto final de la prueba. Comenzando a observar desde la menor dilución de antibiótico. la cual es producto del desarrollo Interpretación de los resultados: La CIM es la menor concentración de antibiótico que inhibe completamente el desarrollo bacteriano.5 gr 1.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA .s. El inóculo debe contener 5 x 10 UFC/ml. Se controla la aparición de turbidez.s.5 de la escala Mc Farland. y a medida que la concentración aumente se irá deteniendo ese crecimiento.5 gr 15 gr 1000 ml Año 2014 El procedimiento a seguir es el siguiente (ver fig. Usar un tubo que contenga la suspensión del microorganismo a probar.p pH final: 7. Para ello se emplean los tubos que no presentaron crecimiento visible en la determinación de la CIM y se los subcultiva en placas con agar Muller Hinton sin antibiótico.p pH final: 7. D.

M. En este medio sólido (agar) se desarrolla el microorganismo a evaluar. La interacción del antimicrobiano con el crecimiento del microorganismo puede dar como resultado zonas de inhibición. de la temperatura. sino también del espesor de la capa de agar. El disco aplicado sobre el medio de cultivo sólido genera un gradiente de concentración decreciente a medida que se aleja del centro. Estos discos se pueden preparar o adquirir comercialmente. P. S. de la capacidad de difusión del antimicrobiano en ese medio. La sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco. Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados cuidadosamente. Determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos: Método de difusión con disco. El método se basa en la difusión del antimicrobiano incorporado en una cantidad preestablecida en un soporte. el cual se ubica sobre un medio sólido. Álvarez A. 5. del tamaño y fase de crecimiento del inóculo. & Cuadros D.2): 4 . su pH y composición. El tamaño de la zona de inhibición (halo) dependerá no solo de la sensibilidad del microorganismo y la carga de sustancia en el disco. El soporte donde se coloca el antimicrobiano suele ser un disco de papel.. Estos soportes deben ser inertes y permitir vehiculizar el antimicrobiano sin producir alteraciones en el mismo.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. El procedimiento a seguir es el siguiente (ver fig.1: Evaluación de la CIM y CLM de un antimicrobiano mediante el método de dilución 2.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . Año 2014 Fig.. D. Es una prueba de cuantitativa para evaluar la sensibilidad de una cepa bacteriana frente a la acción de uno o varios antimicrobianos. 5. Pezzullo S.

5 .  Sensibilidad intermedia: estos microorganismos podrían ser inhibidos por concentraciones mayores. La lectura se realiza con regla y debe ser sobre la base de la placa. Se distribuye el inóculo de manera homogénea. A partir del cultivo puro preparar una suspensión en caldo Muller Hinton con una turbidez equivalente al patrón 0. Observar y medir los diámetros de inhibición (mm) y consultar los puntos de corte para determinar la sensibilidad (ver tabla 5. P. Preparar el inóculo bacteriano. Sembrar las placas que contienen el agar Muller Hinton.. S. con sensibilidad intermedia o resistente al antimicrobiano.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. el objetivo es alcanzar una altura del medio de cultivo de 4 mm. En cada placa de 100 mm de diámetro no deben aplicarse más de 6 discos. Distribuir 30 ml de agar Muller Hinton en placas de 100 mm de diámetro. el mismo se sumerge en el inóculo y luego se lo presiona contra las paredes del tubo para eliminar el exceso de líquido.5 minutos de modo que se absorba el exceso de humedad de la superficie del agar. durante 18-20 hs. Pezzullo S. como por ejemplo la producción de β-lactamasas. hisopando la superficie en tres direcciones diferentes. La transferencia se realiza con hisopo estéril. Incubar las placas. Una inadecuada altura puede producir variaciones significativas en el diámetro de los halos de inhibición.        Año 2014 Preparar las placas de Petri con el medio de cultivo.3).5 de la escala Mc Farland. Por lo tanto. & Cuadros D. aplicándole una leve presión. A partir de esta lectura.  Resistente: el microorganismo continúa desarrollándose en presencia del antimicrobiano en la dosis aplicada en el disco. caso contrario deberá repetirse el ensayo. Los discos deben ser retirados anteriormente del refrigerador para que en el momento de ser aplicado tenga temperatura ambiente. de acuerdo a la medida de los diámetros de los halos se podrá categorizar al microorganismo como sensible. para ello debe estar iluminada con luz reflejada. los cuales deben estar ubicados a una distancia de. Las zonas de inhibición deben ser circulares y no observarse colonias aisladas. 24 mm entre los centros de cada uno de ellos. Las placas pueden conservarse por un período de hasta una semana.1). y se detallan a continuación:  Sensible: el microorganismo inhibe su desarrollo por la presencia del antimicrobiano en la dosis aplicada en el disco. Se deja reposar la placa sembrada entre 3 . a una temperatura de 35 ± 2 °C. M. Álvarez A. Para ello se deberán consultar las Tablas CLSI “Puntos de corte para la interpretación de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión” específica para el microorganismo que se esté evaluando. Las categorías se asignan de acuerdo a la respuesta de la cepa bacteriana frente a cada antimicrobiano. D. Esto implica que una infección debida a este microorganismo puede ser apropiadamente tratada con la dosis del antimicrobiano recomendada para ese microorganismo. este microorganismo no es inhibido por tal concentración de antimicrobiano. dentro de los 15 minutos de la preparación de inóculo.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . mientras que las dosis puedan elevarse. La densidad del inóculo es uno de los factores más importantes en la realización de la técnica. por lo menos.. provocando errores en la interpretación de los resultados. Interpretación de los resultados: Se deben observar los diámetros de los halos de inhibición (ver fig 5. Aplicar los discos de antimicrobianos sobre la superficie de las placas inoculadas con una pinza estéril. invertidas. pudiendo sugerir un mecanismo de resistencia específico. teniendo el cuidado de mantenerlas refrigeradas (2 a 8 °C) y selladas para evitar la deshidratación.

Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. S. 6 . 5.2: Esquema para realizar la técnica de antibiograma por el método de difusión en disco. Pezzullo S. Fig. D. M... P. Año 2014 Fig. & Cuadros D.3: Antibiograma de una cepa perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. 5.MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . Álvarez A.

17 ≥ 18 Ampicilina/sulbactama 10/10 ≤ 11 12 .17 ≥ 18 Cefepima 30 ≤ 14 15 ..18 ≥ 19 Anfenicoles (inhibidor de la síntesis proteica) Cloranfenicol 30 ≤ 12 13 .22 ≥ 23 Combinación β-lactámico/ inhibidor de β-lactamasa (inhibidor de la síntesis de la pared celular) Amoxicilina/clavulánico 20/10 ≤ 13 14 .16 ≥ 17 Trimetoprima 5 ≤ 10 11 .17 ≥ 18 Cefoxitina 30 ≤ 14 15 .15 ≥ 16 Monobactames (inhibidor de la síntesis de la pared celular) Aztreonam 30 ≤ 15 16 . S.17 ≥ 18 Cefalotina 30 ≤ 14 15 .75 ≤ 10 11 .15 ≥ 16 Sulfonamidas 250 ≤ 12 13 . 3° y 4° generación (inhibidor de la síntesis de la pared celular) Cefazolina 30 ≤ 14 15 .15 ≥ 16 Meropenem 10 ≤ 13 14 .Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A.22 ≥ 23 Ceptacidima 30 ≤ 14 15 .17 ≥ 18 Quinolonas (inhibidor de la síntesis de ácidos nucleicos) Ácido nalidíxico 30 ≤ 13 14 .17 ≥ 18 Cefotaxima 30 ≤ 14 15 .14 ≥ 15 Tetraciclinas (inhibidor de la síntesis proteica) Tetraciclina 30 ≤ 14 15 .MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA .18 ≥ 19 Inhibidores de la vía del folato (inhibidor de vías metabólicas) Trimetoprima. & Cuadros D.1: Puntos de corte para la interpretación de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión correspondiente a Enterobacteriaceae (adaptado de CLSI Table 2 A Enterobacteriaceae M2-Disk Diffusion January 2006) Diámetro en mm Antimicrobiano Disco (carga µg) Resistente Intermedio Sensible Penicilinas (inhibidor de la síntesis de la pared celular) Ampicilina 10 ≤ 13 14 -16 ≥ 17 Piperacilina 100 ≤ 17 18 .25/23. Álvarez A. D.20 ≥ 21 Carbenicilina 100 ≤ 19 20 ..20 ≥ 21 Cefalosporinas de 1°.16 ≥ 17 Estreptomicina 10 ≤ 11 12 . Año 2014 Tabla 5.17 ≥ 18 Carbapenemes (inhibidor de la síntesis de la pared celular) Ertapenem 10 ≤ 15 16 .sulfametoxazol 1.15 ≥ 16 Bibliografía 7 . Pezzullo S.14 ≥ 15 Piperacilina/taxobactama 100/10 ≤ 17 18 . P.18 ≥ 19 Imipenem 10 ≤ 13 14 .21 ≥ 22 Aminoglucósidos (inhibidor de la síntesis proteica) Gentamicina 10 ≤ 12 13 . M. 2°.14 ≥ 15 Amicacina 30 ≤ 14 15 .

Regulación y Relaciones Sanitarias. Alonso A. Environmental Microbiology. España. Sánchez P. Basualdo J. 2008. A. Editorial Atlantis. Coto C. Renovar los esfuerzos de contención de la resistencia a los antimicrobianos.. Minireview. Organización Mundial de la Salud (OMS). 2001. P. A. 2007. Environmental selection of antibiotic resistance genes. Famiglietti A. Biología de los Microorganismos. 3 (1): 1-9. Brock.. M.Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. Redes Nacionales de Laboratorio. Argentina.. 8 . Martínez J. Asociación Argentina de Microbiología. T..MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA . Microbiología Biomédica. 128. Madigan M. John Stelling & Thomas F O'Brien. Argentina.10 ª ed. Pezzullo S. Krisantha Weerasuriya. Parker J. Colegio de Bioquímicos de la provincia de Entre Ríos y Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional del Litoral. E. de Torres R. Carlos Malbran” (ANLIS). Año 2014 Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Secretaría de Políticas. pp. & Cuadros D. 1996. Ministerio de Salud. Martinko G. Segunda Edición. D. M. Álvarez A. Editorial Prentice Hall INC. 2010. 2004.. Editorial Publicaciones Latinoamericanas. Antimicrobianos (Módulo 4). S. Boletín Informativo de la OMS..