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Centro Tecnolgico
Departamento de Engenharia Qumica e Engenharia de Alimentos
Curso de Ps-Graduao em Engenharia Qumica
Grupo de Engenharia Genmica
Dissertao submetida ao
Programa de Ps-Graduao em
Engenharia Qumica da
Universidade Federal de Santa Catarina
como requisito parcial para
a obteno do ttulo de
Mestre em Engenharia Qumica.
_______________________________
Prof. Dr. Luismar Marques Porto
Orientador
_______________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
Coordenador do CPGENQ
Banca Examinadora:
______________________________________
Prof. Dr. Paulo Fernando Dias
Co-orientador, presidente
______________________________________
Prof. Dr. Agenor Furigo Junior
Membro interno
______________________________________
Dr. Carlos Renato Rambo
Membro externo
______________________________________
Dr. Jarbas Mota Siqueira Junior
Membro externo
iii
iv
vi
AGRADECIMENTOS
Agradeo a Deus por iluminar meu caminho e me dar foras para continuar;
Ao professor Dr. Luismar Marques Porto pela orientao, oportunidade, apoio,
dedicao, ensinamentos, incentivo, compreenso e valiosa amizade;
Ao professor Dr. Paulo Fernando Dias, pela co-orientao, por ter me apresentado
encantadora rea biolgica, pelo apoio incondicional, dedicao, colaborao e
amizade;
professora Dra. Rosa Maria Ribeiro do Valle e ao professor Dr. Marcelo
Maraschin, que me receberam em seus laboratrios tornando este trabalho
possvel, muito obrigado pelo incentivo e relevante apoio;
Ao Sr. Vilson da empresa Macedo Koerich S.A. pelo fornecimento de material;
Aos meus colegas e amigos do InteLab: Derce, Gisele, Claudimir, Julia, Artiva,
Elaine, Clayton, Sidnei, Andr e Felipe pelo aprendizado, companheirismo,
amizade e a perseverana que juntos depositamos na pesquisa cientfica;
Ao Itamar e Cntia Soares pelos ensinamentos e valiosa contribuio na
elaborao da modelagem matemtica in vitro.
Aos colegas do Laboratrio de Morfognese e Bioqumica Vegetal: Shirley,
Priscila, Tales, Jurcio, Dani, Lus, Ppo e a Mari, Silvia, do Laboratrio de
Farmacologia de Produtos Naturais e tambm Vanessa, Wagner, Alcelmo e
Johanna do Projeto Bioativos, muito obrigado pelo maravilhoso ambiente de
trabalho, companheirismo e amizade;
Aos amigos Dr. Jarbas Mota Siqueira Junior e Luciano Henrique Campestrini, o
apoio, o incentivo, convivncia agradvel, a pacincia. Vocs foram mais do que
colegas de laboratrio, com vocs muito aprendi;
Aos meus pais, Honrio e Maria Helena, e ao meu irmo Rodrigo pela
maravilhosa famlia que somos! Muito obrigado pelas lies que tive desde os
primeiros momentos de vida... Cheguei at aqui porque vocs estiveram ao meu
lado durante todo o caminho... Devo tudo que sei e sou a vocs. Vocs iluminam
meu viver;
A voc Lo, o amor que me faz forte, a alegria de estar ao teu lado, a paz do meu
corao, a simplicidade de ver a vida, a energia que me encanta. Obrigado por
iluminar meus momentos e estar sempre ao meu lado; seu apoio foi e
fundamental. Hoje tenho a certeza de estar no caminho certo porque te encontrei;
vii
Aos meus sogros Cida e Menegotto e aos meus cunhados Aline e Denis as
palavras de conforto, o incentivo, o apoio incondicional, e por entenderem as
minhas ausncias. Obrigado pelo carinho, amo muito vocs;
A voc Ni minha amiga do corao, a nossa iluminada amizade, aos momentos
bons e difceis em que voc esteve ao meu lado, aos dias e noites de estudo, a
nossa big fr... Ni e Neto amo vocs;
Ao Binho um ser maravilhoso que com apenas um olhar me encoraja e que sem
palavras fico para dizer o quanto significa pra mim;
Rezinha, amiga que me acompanhou durante a realizao dos experimentos in
vitro e que se tornou uma pessoa muito especial; muito obrigado e muita saudade;
Ao Dr. Carlos Renato Rambo, nossa grande amizade, ao apoio incondicional, aos
momentos de diverso e aprendizado, s palavras de conforto... Carlos e Dali,
adoro muito vocs;
Dani, Magda, Ana Laura, Mari, Lucas, Karol, Laura e Cntia pelos bons
momentos de convivncia diria e pela valiosa amizade. Em especial a voc Karol
que sempre esteve ao meu lado nos momentos bons e difceis dessa vida.
Aos amigos Rosi e Paulo pela maravilhosa amizade, companherismo e pelos
momentos de adrenalina que a aventura nos proporciona.
minha grande amiga Ana Paula, fico sem palavras para agradecer aos
momentos vividos desde a infncia... mesmo distante voc esteve ao meu lado em
todos os momentos.
Aos amigos Carlos Eduardo e Ingrid todos os momentos de descontrao,
companherismo e grande amizade.
Aos meus amigos e colegas, pelo incentivo, insistncia, carinho, pacincia,
companheirismo e compreenso;
A todos que, de uma maneira ou outra, contriburam para que fosse possvel a
realizao deste trabalho.
Agradeo, in memoriam, ao Dr. Judah Folkman, por tornar mais encantador o meu
trabalho.
Me Iemanj, energia do mar, que esteve minha volta todos os dias e noites.
viii
SUMRIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................vii
RESUMO ............................................................................................................................xii
ABSTRACT ....................................................................................................................... xiv
Captulo 1 Introduo........................................................................................................ 1
Captulo 2 Fundamentao Terica ................................................................................ 3
2.1 Aloe vera .................................................................................................................... 3
2.2 Aspectos relativos patogenia de melanoma ...................................................... 6
2.3 Modelos experimentais in vitro.............................................................................. 7
2.4 Vacularizao relacionada ao desenvolvimento de tumores............................. 8
2.5 Processos de formao de vasos sangneos ........................................................ 9
Captulo 3 Objetivos........................................................................................................ 14
3.1 Objetivos Gerais ...................................................................................................... 14
3.2 Objetivos especficos .............................................................................................. 14
Captulo 4 Materiais e Mtodos ................................................................................... 15
4.1 Obteno do Extrato do Parnquima Clorofiliano (EPC)................................. 15
4.2 Alona padro.......................................................................................................... 15
4.3 Avaliao da bioatividade in vitro........................................................................ 15
4.3.1 Cultura de Clulas............................................................................................... 15
4.3.2 Ensaio de viabilidade celular ......................................................................... 16
4.3.3 Modelagem Matemtica Computacional ..................................................... 17
4.4 Avaliao da bioatividade in vivo......................................................................... 18
4.4.1 Ovos de galinha embrionados da espcie Gallus domesticus ......................... 18
4.4.2 Ensaio de vasculognese na vescula vitelnica do embrio de galinha.. 19
4.4.3 Ensaio de angiognese na membrana corioalantica do embrio de
galinha ........................................................................................................................ 21
Captulo 5 Resultados e Discusso .............................................................................. 23
Captulo 6 Concluses e Sugestes.............................................................................. 41
Referncias Bibliogrficas................................................................................................... 43
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. A folha da Aloe vera dividida em extrato do parnquima de reserva
(EPR) ou gel e extrato do parnquima clorofiliano (EPC) ou ltex. ............................ 4
Figura 2. Estrutura qumica da alona ............................................................................. 5
Figura 3. Metodologia aplicada na avaliao da bioatividade da alona e do
extrato do parnquima clorofiliano (EPC) de A. barbadensis in vitro......................... 16
Figura 4. Metodologia experimental aplicada na avaliao da bioatividade da
alona e do extrato do parnquima clorofiliano (EPC) de A. barbadensis in vivo. .... 18
Figura 5. Medidas cflico cervical (CCV) e cervical caudal (CVC) realizados nos
embries da espcie G. domesticus. (Dias et al., 2005)................................................ 20
Figura 6. Viabilidade celular em funo da concentrao de alona-padro (0,01
230 gmL-1) (a) e extrato do parnquima clorofiliano (EPC) (0,01100 gmL-1) (b).
Os resultados foram expressos em percentagem do grupo controle (meio de
cultura DMEM). * Diferenas significativas ao nvel de P < 0,05 em relao ao
grupo controle (ANOVA seguida do teste de Tukey). ............................................... 23
Figura 7. Curva representativa de morte celular em funo da concentrao de
alona, aps 48 h de exposio ao efetor. Os dados experimentais representam
mdias de oito experimentos (poos) para cada condio de concentrao............ 27
Figura 8. Curva representativa de morte celular em funo da concentrao do
extrato do parnquima clorifiliano (EPC), aps 48 h de exposio. Os dados
experimentais representam mdias de oito experimentos (poos) para cada
condio de concentrao................................................................................................ 28
Figura 9. Percentagem do nmero de vasos em funo da concentrao da alona
(a) e do extrato do parnquima clorofiliano (EPC) (b) na vasculognese de
embries de Gallus domesticus com quatro dias de desenvolvimento. * Diferenas
significativas ao nvel de P < 0,05, em relao ao grupo controle (ANOVA seguido
do teste Tukey).................................................................................................................. 31
Figura 10. Percentagem de comprimento ceflico (segmento corpreo CCV) em
funo da concentrao da alona (a) e do extrato do parnquima clorofiliano
(EPC) (b) na morfognese de embries de Gallus domesticus com quatro dias de
desenvolvimento............................................................................................................... 33
Figura 11. Percentagem do comprimento total (ceflico- cervical- caudal) em
funo da concentrao de alona (a) e do extrato do parnquima clorofiliano
(EPC) (b) na biometria de embries de Gallus domesticus com quatro dias de
desenvolvimento............................................................................................................... 34
Figura 12. Percentagem do nmero de vasos em funo da concentrao da alona
(a) e do extrato do parnquima clorofiliano (EPC) (b) na angiognse de embries
de Gallus domesticus com oito dias de desenvolvimento. * Diferenas significativas
ao nvel de P<0,05, em relao ao grupo controle (ANOVA seguido do teste de
Tukey)................................................................................................................................. 35
LISTA DE TABELAS
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
xii
RESUMO
xiii
ABSTRACT
xiv
Captulo 1
Introduo
angiognese, por outro lado, um processo subseqente, que ocorre a partir dos
vasos pr-existentes formados na vasculognese, os quais proliferam para
viabilizar o crescimento do corpo e a ramificao de novos capilares (Risau et al.,
1988; Folkman, 1995). Quando alterados, os processos de formao de vasos
sangneos tornam-se crticos para o crescimento de tumores slidos e a formao
de metstases (Folkman e Klagsbrun, 1987).
No contexto da investigao pr-clinica, ensaios in vitro e in vivo vm sendo
utilizados com o objetivo de avaliar os respectivos efeitos de substncias bioativas,
extradas de espcies vegetais, tanto sobre patogenias, como os tumores, como em
clulas ou tecidos sadios, em processos fisiolgicos, a exemplo da vascularizao
embrionria.
Captulo 2
Fundamentao Terica
tratamento da constipao intestinal (Chung, Cheong, Lee et al., 1996; Tian e Hua,
2005) e como tnico fortificante do estmago (Chung, Cheong, Park et al., 1996).
Ao longo da ltima dcada tem sido descrita a atividade farmacolgica de
uma diversidade de princpios ativos, provenientes de fontes naturais (Calixto e
Cabrini, 1997). As antraquinonas tm sido freqentemente utilizadas na medicina
como agente antipsorase (Sydiskis et al., 1991). Derivados antraquinnicos
tambm mostraram inibio de vrias viroses in vitro, incluindo herpes simples do
tipo 1 e 2, varicela-zoster e influenza (Sydiskis et al., 1991). Alm disso, segundo
este ltimo autor, atualmente muitos compostos originrios da Aloe barbadensis
vm sendo testados na cura de doenas como asma, isquemia, hipertenso,
psorase, artrite rematide e vrios tipos de cncer. Seu modo de ao no
exatamente conhecido, ainda que muitas molculas e tipos celulares tenham sido
identificados como potenciais alvos dessas antraquinonas.
Algumas propriedades teraputicas importantes, comuns aos extratos e
compostos
isolados
da
Aloe
barbadensis,
particularmente
as
atividades
primariamente
localizadas
em
linfonodos
em
seguida,
mais
sem
alcanarem
estabilidade.
Geralmente
clulas
tumorais
al., 2000; Jones et al., 2001). Esse sistema compe-se do corao, vasos sangneos
(artrias, veias e capilares) e vasos linfticos. Vasos sangneos so estruturas
constitudas basicamente de uma monocamada de clulas endoteliais, as quais se
interconectam para formar tubos que viabilizam o fluxo do sangue e a perfuso
tecidual no organismo (Tobelem, 1990; Sweeney et al., 1998). A formao de vasos
sangneos pode ocorrer a partir de diferentes processos, como a vasculognese e
a angiognese, nos quais esto envolvidos mecanismos celulares, como a
proliferao, a migrao e a diferenciao (Risau, 1997; Bouis et al., 2006).
A vasculognese um processo definido como o desenvolvimento de vasos
sangneos a partir da proliferao in situ de clulas mesodrmicas progenitoras
de clulas endoteliais (angioblastos e hemangioblastos) (Risau et al., 1988). Estas
clulas precursoras so recrutadas de reas de mesoderma adjacentes ao embrio
e/ou originadas por diviso celular local, organizando ilhotas sangneas e
estabelecendo um plexo vascular primordial (Ruiter et al., 1992).
Subseqentemente, atravs da angiognese, a rede de vasos primrios sofre
uma remodelagem, combinando eventos de morte e regresso vascular com a
sobrevivncia e ramificao de capilares a partir de vasos pr-existentes, os quais
proliferam para viabilizar o crescimento do corpo (Folkman, 1971). No embrio, os
dois processos de formao de vasos coexistem; por exemplo, o desenvolvimento
do corao e dos grandes vasos ocorre por vasculognese, enquanto rgos que
requerem invaso de vasos sangneos para o desenvolvimento (crebro, pulmes
e fgado) so supridos por angiognese (Risau et al., 1988). A formao de vasos
sangneos mantida sob rgido controle no organismo do adulto, assim, a
angiognese usualmente desprezvel aps ter sido alcanada essa fase da vida
(Folkman, 1971; Folkman e Shing, 1992). Porm, esse processo ainda continua
desempenhando no adulto um papel fundamental em inmeros processos
fisiolgicos, por exemplo, no ciclo reprodutivo feminino e na cicatrizao
(Folkman e Klagsbrun, 1987; Bergers e Benjamin, 2003).
Por outro lado, erros na regulao da angiognese levam ao crescimento
descontrolado de vasos, o que crtico em diversas patologias, como a artrite
reumatide e alguns tipos de cncer (Folkman e Klagsbrun, 1987; Koch, 1998). A
10
12
13
Captulo 3
Objetivos
3.1 Objetivos Gerais
O presente trabalho tem como objetivo comparar os efeitos da
administrao da alona e do extrato do parnquima clorofiliano (EPC) sobre a
viabilidade das clulas tumorais de melanoma da linhagem B16F10 e sobre os
processos fisiolgicos de vasculognese e angiognese nas membranas vitelnica
(MV) e corioalanticas (MC) de embries de Gallus domesticus.
embrionria
(comprimento
14
ceflico-cervical-caudal
Captulo 4
Materiais e Mtodos
4.1 Obteno do Extrato do Parnquima Clorofiliano (EPC)
Folhas de Aloe barbadensis foram gentilmente cedidas pela empresa
Naturama S.A. (Paulo Lopes, SC) atravs da parceria desta empresa com o Projeto
Bioativos (Com financiamento da FINEP/SEBRAE/CNPq). Inicialmente as folhas
foram cortadas em sua base e dispostas em um recipiente protegido da luz e do
calor para que o EPC fosse drenado pela ao da gravidade. Aps este
procedimento, o EPC obtido foi filtrado e armazenado em recipiente mbar,
congelado e posteriormente liofilizado. O material foi obtido e processado no
Laboratrio de Morfognese e Bioqumica Vegetal (FIT/CCA/UFSC).
15
16
obtidos
por
regresso
no-linear,
Os parmetros de toxicidade
pelo
Mtodo
de
Marquardt
17
18
Volumes de 5 L da soluo de
19
Figura 5. Medidas cflico cervical (CCV) e cervical caudal (CVC) realizados nos
embries da espcie G. domesticus. (Dias et al., 2005)
Para permitir uma avaliao da morfognese embrionria, a proporo
entre as regies anterior e posterior do embrio foi determinada como mostrado
na Figura 5. Os eixos de comprimento entre as flexuras ceflica e cervical (CCV) e
as flexuras cervical e caudal (CCC), foram relacionados por meio da percentagem
de comprimento ceflico (CCV/CCC), i.e, o comprimento da regio ceflica em
relao ao comprimento total do embrio, calculada atravs da seguinte expresso:
CCV/CCC: [CCV (CCV + CVC)] 100. Os dados obtidos foram submetidos
analise de comparao de mdias pelo teste de Tukey (P< 0,05).
20
4.4.5 Biotica
Todos os estudos envolvendo ovos embrionados de G. domesticus foram
realizados de acordo com os procedimentos impostos pelo NIH (National Institute
of Health), assim como pelo Guiding Principles for the Care and Use of Laboratory
Animal e definidos no protocolo PP00069/proc.23080.028290/2006/CEUA/UFSC,
do Comit de tica para o Uso de Animais em Pesquisa (CEUA / UFSC,
Florianpolis, SC, Brazil).
22
Captulo 5
Resultados e Discusso
(a)
Viabilidade Celular
(%)
150
100
50
Controle
0,01
0,1
10
100
230
Viabilidade Celular
(%)
(b)
Aloin (g/mL)
150
100
50
0
Controle
0,01
0,1
10
100
Extrato do parnquima
clorofiliano (g/mL)
23
respectivamente.
Verifica-se
que
no
ocorreram
modificaes
24
dX
= X
dt
(1)
c , de
(c ) =
mx c
(2)
Km + c
os
pontos
experimentais
considerando
constante
dX
1
=
dc
ac + b
(3)
1 dX
=
X dt
(4)
Mas
dX dX dc
=
dt
dc dt
Logo,
25
dX dX t
dc
dt c
(5)
t
dX
= X
dc
c
(6)
max
1 dX
=
X dc K m + c
(7)
forma:
dy
= max
dc
Km + c
(8)
Relacionando a equao (3) proposta por (Berti et al., 2007) com a equao (8),
encontra-se como definio que max = 1/ a e K m = b / a .
Com base nas observaes experimentais e no modelo de morte celular por
apoptose sugerido em Palsson e Bhatia (2004), foi desenvolvido o seguinte modelo
para a morte celular provocada pela toxicidade de alona e de outras substncias
presentes no EPC de Aloe barbadensis, ao final de 48 h de exposio aos efetores:
dX
= max
dc c K
(9)
X = 1 max ln
1
K
(10)
27
os
desvios-padro
mostraram-se
elevados,
sobretudo
para
baixas
28
Parmetro de toxicidade *
Efetor
max
Alona padro
0,205 0,009
233 9
EPC
0,15 0,09
100 58
Tabela 2. Valor crtico de concentrao do efetor para morte celular determinado a partir
do modelo matemtico proposto.
Concentrao do EPC,
Razo de
% Morte
Concentrao de
-1
-1
Toxicidade
celular
gmL
alona, gmL
(EPC/A)*
10
157
50
3,1
25
196
82
2,4
50
222
97
2,3
100
231
100
2,3
29
30
(a)
Nmero de vasos
(%)
200
150
*
100
50
0
Controle
10
20
40
80
100
160
(50ng.mL-1)
-1
Aloina (g.mL )
(b)
200
Nmero de vasos
(%)
bFGF
150
*
100
50
0
Controle
10
20
40
80
EPC(g.mL-1)
100
160
bFGF
(50ng.mL-1)
31
32
(a)
Comprimento Ceflico
(%)
150
100
50
0
Controle
10
20
40
80
100
160
FGFb
(50ng.mL-1)
-1
Alona (g.mL )
(b)
Comprimento Ceflico
(%)
150
100
50
0
Controle
10
20
40
80
-1
100
160
FGFb
(50ng.mL-1)
EPC (g.mL )
33
Comprimento Total
(%)
(a)
150
100
50
0
Controle
10
20
40
80
100
160
Alona (g.mL )
(b)
FGFb
(50ng.mL-1)
-1
Comprimento Total
(%)
150
100
50
0
Controle
10
20
40
80
100
EPC (g.mL-1)
160
FGFb
(50ng.mL-1)
34
(a)
Nmero de vasos
(%)
200
*
150
*
100
50
0
Controle
40
80
160
320
FGFb
(50ng.mL-1)
Alona (g.mL-1)
(b)
Nmero de vasos
(%)
200
150
100
50
0
Controle
40
80
160
320
EPC (g.mL-1)
FGFb
(50ng.mL-1)
comparativo a Figura 13b mostra uma amostra tratada com fator de crescimento
FGFb (controle positivo, 50ng.ml-1), evidenciando uma formao visualmente
maior de vasos em relao ao controle. As fotografias foram ento binarizadas e
foi feita a contagem de pixels pretos (diretamente proporcional ao nmero de
vasos que interceptam o limite dos implantes) revelou que houve maior formao
de vasos nas amostras tratadas com EPC em relao ao controle e em relao aos
grupos tratados com alona. A Tabela 3 mostra os resultados da contagem do
nmero de vasos que interceptam o limite dos discos implantados, atravs dois
mtodos distintos.
Analise de Imagem
Visual
Controle (veculo)
100%
100%
Alona (160g.mL-1)
122%
121%
Extrato (160g.mL-1)
137%
127%
FGFb (50ng.mL-1)
151%
158%
40
Captulo 6
Concluses e Sugestes
O EPC mostrou-se 2,3 vezes mais efetivo em causar morte celular do que a
alona-padro. O modelo matemtico desenvolvido evidenciou o efeito
citotxico dessas substncias, e permitiu a identificao de parmetros
citotxicos.
sobre
clulas
tumorais,
enquanto
promoveram
O efeito mais pronunciado do EPC tanto nos ensaios in vitro como nos in
vivo sugere que algum composto ativo presente no EPC esteja agindo
sinergisticamente com a alona.
41
42
Referncias Bibliogrficas
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46
47
48
51
ANEXO
O modelo matemtico proposto por Palsson & Bhatia (2004) para morte
celular de uma populao de clulas representado pela equao 1:
dX
: X
dt
( 1)
Onde:
X: populao de clulas
(C ) :
mx .C
km + C
(2)
Onde:
Km: O valor da concentrao para a qual a populao celular destruda em 50%.
Onde:
y: populao de clulas
X: concentrao relativa (C/Co)
dX dX dC
:
.
dt dC dt
dX dX dt dX t
:
.
.
dC dt dC
dt C
t
dX
: .X.
C
dC
t t
dX mx .C
48
:
.X.
:
C C C 0
dC km + C
1 dX
.
:
dX dC
mx .C .
km + C
1 dX mx
.
:
X dC km + C
t
C
(4)
Sendo que
1 dX
proporcional velocidade especfica de morte celular. Como
.
X
mostrado abaixo:
dy
1 dX
.
dt X dt
dy
dy :
1 dX
.
.dt
dX dt
1
.dX
X
53
Onde
a:
mx
b:
km
mx
b
: km
a
Integrando a equao 3:
dX
aX + b
dy :
y
dy :
y0
1 X dX
a X0 aX + b
y : y0
1
[ln(aX + b ) ln(aX 0 + b )]
a
1 aX + b
y : y 0 ln
a aX 0 + b
Assumindo que:
b:
mx
b
: k
a
a:
mx
Substituindo
dy:dX e dX:dC
O modelo proposto pode ser escrito da seguinte forma:
54
dX mx
(8)
:
dC k C
C
(9)
X : 1 mx . ln 1
k
55