You are on page 1of 6

Extracción de DNA

Peso de la levadura: 2,5 g
Volumen del extracto inicial de DNA: 4 ml
Absorbancia 260 nm: 0,911
Absorbancia 280 nm: 0,432
Muestra de cálculos

Concentración DNA

( ugml )=0,175∗100∗50( ugml )=875( ugml )

DNA Recuperado :875

%rendimiento=

Pureza=

( ugml )∗4 ml=3500 ug=3,5 mg

3,5 mg
∗100=0,14
2500 mg

0,911
=2,11
0,432

Efecto del pH
Tubo

pH

Abs 260 nm
0
8,5
0
1
8,5
0,417
2
9,5
0,449
3
10,5
0,463
4
11,5
0,476
5
12,5
0,504
Tabla 1. Efecto del pH en el DNA

Efecto del pH
0.51
0.49
0.47

Absorbancia

0.45
0.43
0.41

8

8.5

9

9.5

10

10.5

pH

11

11.5

12

12.5

13

Efecto del formaldehido en el DNA Tubo Temperat Abs 260 ura nm 1 20 0.47 6 84 0.495 4 70 0.511 5 82 0.47 5 82 0.524 7 90 0.495 4 70 0.504 6 84 0.509 8 92 0.47 3 60 0.491 5 82 0.706 2 37 0.486 6 84 0.484 8 92 0.485 7 90 0.449 2 37 0.446 7 90 0.523 Tabla 4.Tubo Temperat Abs 260 ura nm 1 20 0. Efecto del calentamiento y enfriamiento en el DNA Tubo Temperat Abs 260 ura nm 1 20 0.49 3 60 0.484 2 37 0. Efecto del formaldehido y NaCl 1 M en el DNA .489 8 92 0.48 4 70 0.496 Tabla 3.52 Tabla 2.497 3 60 0.

46 0.394 50 0.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Concentración DMSO (%) Análisis de resultados 1.419 60 0.42 Absorbancia 280 nm 0.5 Formaldehido Formaldehido + sal 0.465 Tabla 5.34 0.48 0.75 0.6 Absorbancia 0. Se han encontrado valores de DNA en levaduras cercanos al 3% en masa seca.4 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Temperatura (°C) [DMSO] Abs 280 nm 0 0.45 0.363 40 0.55 Calentamiento y enfriamiento 0.7 0.0.335 20 0.14% .38 0. Efecto del DMSO en el DNA Efecto del DMSO 0.492 70 0.44 0.32 0.4 0. El DNA recuperado en el experimento representa el 0.5 0.65 0.36 0.424 80 0.

Este valor se encuentra en el límite inferior del rango recomendado. lo cual naturalmente modifica la capacidad de la molécula para formar puentes de hidrógeno. Ambas absorbencias se encuentran dentro del rango recomendado de trabajo por lo que se cree.5) las cargas que adquieren las bases nitrogenadas disminuyen al máximo las posibles estabilizaciones de la estructura por medio de los puentes de hidrógeno. 3. La tendencia observada tal como es de esperarse. y que el procedimiento nunca será 100% eficiente. El empleo durante la extracción de propiedades siempre parciales como la solubilidad. la energía suministrada al sistema desestabiliza la doble hélice al alterar la conformación de la misma. Para calcular la concentración de DNA se empleó la dilución de 100 debido a que este valor de absorbancia es el único que se encuentra en el rango recomendado de lectura (0. Siguiendo recomendaciones durante el desarrollo de la práctica. lo cual refleja la dificultad experimental que significa la extracción del mismo. lo cual evidenciaría que la separación del DNA de las proteínas no es totalmente efectiva y que podría ser recomendable consecutivas extracciones de proteína en caso de que se desea una mayor extracción. desenvolviendo la doble hélice con el respectivo efecto híper crómico que esto implica. Cuando se calienta. altera la estructura del DNA. e indicarían que el valor determinado con esta dilución es el más exacto. Este cambio. Desafortunadamente el termostato empleado durante la práctica se encontraba averiado. De igual manera otro factor que da información muy importante. permiten realizar una determinación valida. se elimina la posibilidad de que las bases nitrogenadas establezcan puentes de hidrogeno entre ellas perdiendo la estructura de DNA. indicaría que el porcentaje real de DNA recuperado es aun inferior al valor reportado con anterioridad. Los valores de absorbancia muestran una tendencia ascendente a medida que aumenta el pH a excepción del dato a pH 12. A medida que cambia el pH. el DNA verá modificada la carga eléctrica de los sustituyentes de las bases nitrogenadas al aceptar o donar protones. se observa . A continuación se realizara la explicación de los experimentos de acuerdo a los resultados esperados ante la imposibilidad de realizar la comprobación de los mismos experimentalmente. es el de la pureza. y debido a esto los tres experimentos donde se observaban diferentes efectos con el cambio de temperatura arrojaron datos errados. significa que siempre habrá un porcentaje de eficiencia.1-1 unidades de absorbancia). la pureza fue determinada entonces con los valores de absorbancia en esta solución. aumenta la probabilidad de encontrarse por fuera del rango lineal el método. Cuando se aumenta la temperatura.5. 2.de la masa de levadura activa seca tomada para el experimento. Esta realidad experimental. lo cual explicaría las variaciones en el dato cuando se determina con valores de diferentes diluciones.5 a 12. Durante este proceso de desnaturalización o separación de cadenas. para valores superiores de absorbancia. tiende a un valor máximo donde a un pH determinado (entre 8. solo se realizó la lectura a 280nm con la solución Stock 2.

hidroximetilandolos después de la exposición de las cadenas por el calentamiento. se obtendrá como resultado una combinación de ambos efectos que dificultan la predicción del comportamiento. Del mismo modo. ya que aumenta la probabilidad de renaturalización de la hebra. Como consecuencia. Sin embargo. Esta capacidad de enrollamiento y desenrollamiento llevada a cabo en las células por acción de helicazas. El formaldehído interacciona con los grupos amino de los ácidos nucleicos. Cuando culmina la desnaturalización. La temperatura a la cual se deshace la mitad de la estructura helicoidal se conoce como temperatura de fusión Tm. En este experimento se estudian los efectos aplicados a los puentes de hidrógeno de las interacciones entre las bases. se observara un aumento en el efecto de desnaturalización que desplazara la gráfica hacia la izquierda por lo que el valor de Tm disminuye. la desnaturalización del DNA no se lleva a cabo por la ruptura de enlaces covalentes. se obtendrá un valor de Tm más grande. debido a que experimentalmente también se registra el efecto del formaldehído. las interacciones de apilado entre ellas y el efecto general que tiene sobre el desenrollamiento y separación de la estructura secundaria del DNA. se debería observar una disminución en las absorbancias registradas para una misma temperatura con respecto al experimento de calentamiento y rápido enfriamiento. A mayor fuerza iónica. Este dependerá de que efecto sea más relevante a las condiciones de trabajo. se observara un desplazamiento de la gráfica hacia la derecha y por consiguiente un aumento en el valor de Tm. En todos los casos. En las medidas a las distintas temperaturas se esperan valores de absorbancia más grandes como consecuencia del mayor grado de desnaturalización al momento de realizar las medidas. genera una estabilización de cargas en los grupos fosfato de los nucleótidos. disminuyendo de esta manera la repulsión de cargas y la consecuente desnaturalización del DNA. De esta manera se forman puentes metilénicos que se cruzan entre si evitando la renaturalización de la hélice.inicialmente cierta estabilidad de la estructura al aumento de la temperatura. se observa una caída en al pendiente de la curva de fusión de DNA que indica que se alcanzó un valor máximo. se ve el comportamiento típico de una desnaturalización de DNA. Al observar la gráfica del efecto de DMSO. es fundamental para la labor biológica del DNA. 6. se observa un aumento significativo en la absorbancia debido a la exposición de grupos cromóforos hacia el exterior de la estructura. A condiciones fisiológicas la Tm suele hallarse a un intervalo entre 85 y 95°C por lo que la estructura es estable a la temperatura habitual de la célula. Con respecto a la gráfica en ausencia del mismo. 4. La solución de NaCl por sí sola. y este es contrario al de la sal. debido a la estabilización de cargas anteriormente mencionada. Cuando la temperatura desciende por debajo de Tm las hebras complementarias de los ácidos nucleicos se reasocian espontáneamente para formar de nuevo la doble hélice. El DMSO posee una polaridad . 5. Cuando la energía suministrada es lo suficientemente grande para vencer la energía estabilizadora de los puentes de hidrogeno.

. Sin embargo. Del mismo modo.5. se afecta la forma como interactúan las mismas y los puentes de hidrógeno entre ellas. ya que en las anteriores se agregó un buffer de pH 8. La forma de “S” de la gráfica señala que existe un rango de proporción de DMSO donde la doble hélice permanece estable. principalmente debido a que las absorbancias dieron un valor menor al esperado.muy alta lo cual afecta la densidad de carga alrededor de las bases purinicas y pirimidinicas. el DMSO podría funcionar como agente alquilante de dichas bases modificando así su distribución de carga. en los dos últimos valores se presentó una anormalidad. por lo que la absorbancia permanece casi constante. A continuación. De esta manera. debido a su similitud con el dimetilsulfato. se empieza a observar claramente un efecto híper crómico debido a la desnaturalización de DNA para finalmente acercarse a un valor constante donde el efecto del DMSO esta expresado al máximo. debido a que desaparece en estas el efecto del pH. pese a que la concentración de DMSO era mayor.