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PRUEBAS SEROLGICAS PARA EL DIAGNOSTICO EN

EQUINOS
Pruebas serolgicas:
Deben recogerse muestras de sangre de los animales en los que se sospecha de una
elevada concentracin de anticuerpos. El incremento del ttulo de anticuerpos en las
muestras de suero recogidas en la fase de convalecencia indica que el animal ha estado
expuesto al patgeno. Los resultados de esta prueba deben completarse con hallazgos
clnicos y con el aislamiento del patgeno en lquidos o tejidos para poder emitir un
diagnostico etiolgico definitivo.
PRUEBAS SEROLGICAS UTILIZADAS EN EQUINOS PARA EL DIAGNOSTICO
ANEMIA INFECCIOSA EQUINA:
Debido a la persistencia del virus de la AIE en los quidos infectados, la deteccin
serolgica de anticuerpos frente al virus de la AIE confirma el diagnstico de la
infeccin por dicho virus.
A) PRUEBA DE INMUNO-DIFUSIN EN GEL DE AGAR (PRUEBA PRESCRITA
PARA EL COMERCIO INTERNACIONAL).
Los anticuerpos precipitantes se producen rpidamente como resultado de la
infeccin por la AIE y se pueden detectar mediante la prueba AGID. Las
reacciones especficas se indican por las lneas de precipitacin entre el antgeno
de la AIE y el suero problema y se confirman por ser idnticas a la reaccin que
se da entre el antgeno y el suero estndar positivo.

Generalmente, en las

primeras 23 semanas despus de la infeccin, los caballos presentarn


reacciones serolgicas negativas. En algunos casos, el tiempo posterior a la
infeccin previo a la aparicin de anticuerpos detectables puede durar hasta 60
das.
Estn disponibles comercialmente reactivos para AGID de diversas compaas.
Alternativamente, el antgeno AGID y el suero de referencia se pueden preparar
como se describe a continuacin.
Preparacin del antgeno
El antgeno especfico para la AIE se puede preparar a partir del bazo de caballos
infectados experimentalmente con enfermedad aguda (6), del cultivo de tejidos

de caballos infectados (10), de una lnea celular de timo canino con infeccin
permanente

(3) o de protenas recombinantes expresadas en bacterias o en

baculo-virus utilizando la tcnica del ADN recombinante (2,9). La preparacin del


antgeno a partir de cultivos infectados o mediante la tcnica de ADN
recombinante, proporciona un resultado ms uniforme que utilizando las clulas
del bazo, y permite una mejor estandarizacin de los reactivos.
Para obtener un antgeno satisfactorio a partir del

bazo, debe infectarse un

caballo con una cepa muy virulenta del virus de la AIE. El perodo de incubacin
resultante debera durar entre 5 y 7 das, y el bazo debe recogerse 9 das
despus de la inoculacin, cuando ms alto es el ttulo del virus y antes de que se
produzca cualquier cantidad de anticuerpos precipitantes. La pulpa del bazo, sin
diluir, se utiliza como antgeno en la prueba de inmunodifusin(6). La extraccin
del antgeno del bazo con una solucin salina y una concentracin con sulfato
amnico, no proporciona un antgeno tan satisfactorio como una seleccin de
bazos con un ttulo alto del antgeno de la AIE.
Alternativamente, se infectan clulas de rin fetal equino, clulas drmicas o
clulas del timo canino con una cepa del virus de la AIE adaptado para crecer en
cultivo de tejido (American Type Culture Collection). El virus se recoge de los
cultivos por precipitacin con polietilenglicol al 8%, por confeccin en pellets o
por ultra-centrifugacin. El antgeno de diagnstico, p26, se separa del virus por
tratamiento con detergente o ter. Las protenas del ncleo del virus de la AIE,
expresadas en bacterias o baculo-virus estn disponibles comercialmente y se
utilizan como antgenos de alta calidad para el diagnstico serolgico. Existen
evidencias de variacin de la cepa en la secuencia del aminocido p26; sin
embargo no hay evidencias de que esta variacin influya en ninguna de las
pruebas de diagnstico (19).
La p26 es una protena estructural interna del virus que est codificada por el gen
gag. Este gen es estable y no se han encontrado variaciones entre las cepas (11).
Preparacin del antisuero estndar
Se debe recoger un antisuero positivo conocido procedente de un caballo
previamente infectado con el virus de la AIE. Este suero debe producir una nica

lnea de precipitacin densa, que es especfica para la AIE, tal como se ha


demostrado mediante una reaccin idntica a la de un suero estndar conocido.
Es esencial equilibrar las concentraciones de antgeno y de anticuerpos, con el fin
de garantizar la sensibilidad ptima de la prueba. Las concentraciones
reactivo deben ajustarse para

del

formar una lnea de precipitacin estrecha

aproximadamente equidistante de los dos pocillos que contienen el antgeno y el


suero.
Procedimiento de la prueba (1, 6, 13)
i) Las reacciones de inmuno-difusin se llevan a cabo en una capa de agar en
placas de Petri. Para placas de Petri de 100 mm de dimetro, se utilizan 1517 ml
de agar Noble al 1%. Se perforan
6 pocillos en el agar en torno a un pocillo central del mismo dimetro. Los pocillos
sern de 5,3 mm de dimetro y con una separacin de 2,4mm. Cada pocillo debe
contener el mismo volumen de reactivo.
ii) Se coloca el antgeno en el pocillo central y el antisuero estndar en uno de
cada dos pocillos exteriores. Las muestras del suero problema se colocan en los
tres pocillos restantes.
iii) Se mantienen las placas a temperatura ambiente en un ambiente hmedo.
iv) Transcurridas 2428 horas, se examinan las reacciones de precipitacin con un
haz estrecho de luz oblicua e intensa frente a un fondo negro. Las lneas de
referencia deben ser claramente visibles a las 24 horas y, en ese momento,
cualquier suero problema que sea fuertemente positivo tambin puede haber
formado lneas idnticas a las que se dan entre los reactivos estndar. Una
reaccin positiva dbil puede tardar 48 horas en formarse, y se indica mediante
una pequea inclinacin de la lnea de precipitacin del suero entre el pocillo del
antgeno y el pocillo del suero problema. Los sueros con ttulos de anticuerpos de
precipitacin altos, pueden formar bandas anchas de precipitina que tienden a
extenderse. Tales reacciones pueden confirmarse como especficas de la AIE por
dilucin al o antes del contra ensayo; stas pueden ofrecer una lnea de
identidad ms marcada. Los sueros libres de anticuerpos de la AIE no formarn

lneas de precipitacin y no tendrn efecto sobre las lneas de reaccin de los


reactivos estndar.
v) Interpretacin de los resultados: Los caballos que estn en las primeras etapas
de la infeccin pueden no dar una reaccin serolgica positiva en la

prueba

AGID. Tales animales deberan sangrarse de nuevo despus de 34 semanas. Con


el fin de realizar un diagnstico en un potro joven, es necesario determinar el
estado de los anticuerpos procedentes de la madre. Si la yegua posee algn
anticuerpo de la AIE, entonces ser necesario un perodo de 6 meses o ms
despus del nacimiento para que el anticuerpo materno disminuya; se somete al
potro a una nueva prueba para determinar si una reaccin positiva inicial se
debi al anticuerpo materno o a la infeccin.
B) ENZIMOINMUNOENSAYO
Existen tres tipos de ELISA que han sido aprobados por el Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos para el diagnstico de la anemia infecciosa
equina y que estn disponibles internacionalmente; un ELISA competitivo y dos
ELISAS

no competitivos. El ELISA competitivo y uno de los ELISAs no

competitivos detectan los anticuerpos producidos contra el antgeno proteico del


ncleo p26. El otro ELISA no competitivo incorpora la protena del ncleo p26 y
los antgenos gp45 (protena transmembrana vrica).
Los protocolos del ELISA tpicos se utilizan en todas las pruebas. Si los materiales
comerciales del ELISA no estn disponibles, puede emplearse un ELISA no
competitivo utilizando antgeno p26 purificado procedente del material de cultivo
de clulas (14).
Un resultado positivo obtenido mediante ELISA debe comprobarse de nuevo
utilizando la prueba AGID para confirmar el diagnstico, debido a que se han
detectado algunos resultados positivos falsos mediante
ELISA. Tambin se puede confirmar el resultado por la tcnica inmuno-bloting. Los
Laboratorios de
Referencia de la OIE tienen disponible un antisuero estndar para inmunodifusin que contiene una cantidad mnima de anticuerpo que debera detectarse
en los laboratorios. (Vase el cuadro que aparece en la parte 3 de este Manual

para Animales Terrestres). Se han publicado mtodos uniformes para el control de


la AIE (17).
GRIPE EQUINA
Las infecciones se pueden detectar mediante pruebas

serolgicas con sueros

pareados para demostrar un aumento en el ttulo de anticuerpos. Estas pruebas


se deben realizar tanto si se ha intentado, como si no, el aislamiento del virus.
Existen dos mtodos sencillos, la IH y la hemolisis radial simple (SRH), cada uno
igualmente eficaz y de amplio uso. Tambin se puede aplicar la prueba de fijacin
de complemento (FC), pero no es de uso general. Las muestras de ambos sueros
pareados deben probarse juntas al mismo tiempo para minimizar la variabilidad.
Los antgenos estndares se han descrito anteriormente (Seccin B.1.c.). Se
deberan incluir aislados de casos recientes, si estuvieran disponibles. En el
Laboratorio de Referencia de la OIE, en Mewmarket (ver Cuadro de la Parte 3 de
este

Manual)

A/eq/Newmarkrt/77

se

dispone
(H7N7),

de

antisueros

equinos

A/eq/Newmarket/1/93

liofilizados

(H3N8

contra

"Americano)

A/eq/Newmarket/2/93 (H3N8 "Europeo") y de un suero equino negativo para la


gripe. Estos sueros tienen designacin de valor SRH en estudios de colaboracin
internacional y se pueden utilizar como sueros de referencia en este ensayo.
a) Prueba de la inhibicin de la hemoaglutinacin
Para incrementar la sensibilidad de la prueba se trata primero el antgeno con
Tween 80/ter, en particular para virus H3N8. Esta prueba se realiza mejor en
placas de microtitulacin con un equipo adecuado de dilucin. Se puede utilizar
una macroprueba, donde el antgeno se diluye a un ttulo final de HA de 1/8 por
pocillo y los volmenes de PBS, sueros y antgeno son 0.5 ml. Los sueros se pretratan para eliminar hemo-aglutininas no especficas y se inactivan a 56C
durante 30 minutos. Los pre-tratamientos incluyen la utilizacin de alguno de los
siguientes procedimientos: (a) adsorcin por caoln y eritrocitos, (b) periodato
potsico, o (c) enzima de

Vibrio cholerae destructor de receptores. Los tres

procesos dan resultados similares. Los sueros tratados se diluyen con PBS, se

aade una dosis estndar de antgeno (ttulo HA de 1/4 por pocillo en el ensayo
de microtitulacin) y stos se mantienen a 22C (+ 2C) durante 30 minutos.
Despus de mezclar ligeramente, se aaden eritrocitos y la prueba se lee a los 30
minutos. Los ttulos HI son la dilucin ms alta de suero que produce una
inhibicin completa de la hemoaglutinacin. Se pueden utilizar eritrocitos de pollo
(1% [v/v] de clulas empaquetadas) en placas de microtitulacin con pocillos de
fondo en V, o eritrocitos de cobaya (0.5% [v/v] de clulas empaquetadas) en
placas con pocillos de fondo en V o en U. Si se utilizan eritrocitos de pollo, las
placas pueden leerse inclinndolas 70 de modo que las clulas no aglutinadas
corran al fondo del pocillo. Las clulas no aglutinadas de cobaya forman un
botn en la parte inferior del pocillo y la sedimentacin puede llevar ms tiempo.
Los aumentos de cuatro veces o ms en el ttulo entre sueros pareados indican
una infeccin reciente (21).
a) Hemolisis radial simple
En esta prueba, los antgenos vricos se acoplan con eritrocitos fijados que se
suspenden en agarosa que contiene complemento de cobaya (C). Los pocillos se
forman en la agarosa y se llenan con los sueros de ensayo. Los anticuerpos
contra la gripe y el C lisan los RBCs recubiertos de antgeno, originando una
zona hemoltica clara alrededor del pocillo; el tamao de

esta zona es

directamente proporcional al nivel de anticuerpo especfico contra la cepa en la


muestra de suero (10, 19, 20).
Para el ensayo se pueden utilizar placas especiales de inmunodifusin (Hyland,
Miles Scientific), pero tambin son adecuadas las placas de Petri. Los eritrocitos
de oveja recogidos en solucin de Alsever se lavan tres veces. El C se puede
obtener comercialmente, o se puede utilizar suero normal de cobaya. Los
antgenos son lquidos alantoideos o preparaciones purificadas; las cepas usadas
son las mismas que para las pruebas HI. Los virus se acoplan a los RBCs con
periodato potsico o con cloruro crmico. Las preparaciones acopladas de
antgeno/RBCs se mezclan con C, junto con una solucin de agarosa al 1% (de
grado de fusin bajo) en PBS. Debe cuidarse que la temperatura no exceda de
42C en ningn caso. La mezcla se vierte en placas y se dejan toda la noche a

4C. Se perforan en la agarosa solidificada pocillos de 3 mm de dimetro


separados durante 12 mm, por lo menos a 6 mm del borde de la placa. Estas
placas se pueden guardar a 4C por 12 semanas. Las placas se preparan para
cada antgeno y se prueban previamente con antisueros positivos y negativos.
Los sueros se inactivan a 56C durante 30 minutos, pero no es necesario ms
tratamiento. Los sueros pareados deben ensayarse por duplicado en la misma
placa. Como mnimo, debera incluirse un antisuero especfico de subtipo como
un control de suero en un pocillo de cada placa. Todos los sueros se ensayan en
una placa control que contenga todos los componentes excepto virus para
controlar la lisis inespecfica.
Alternativamente, se puede utilizar en la placa control un virus no relacionado, tal
como el
A/PR/8/34 (H1N1). Los sueros que muestran actividad hemoltica con eritrocitos
de oveja deben someterse a pre-absorcin con eritrocitos de oveja. Las zonas de
lisis deben ser claras y no difusas o traslcidas. Se deben medir todas las zonas
claras y calcular las reas de hemolisis.
ARTRITIS VIRAL EQUINA
Para detectar anticuerpos anti- EAV se han usado varias pruebas serolgicas que
incluyen la neutralizacin (microneutralizacin [52], y reduccin de placas o
calvas ([41] NV), la prueba de la fijacin del complemento (FC)(22), la
inmunofluorescencia (16), la inmunodifusin en medio slido (16) y las pruebas
ELISA (11, 14, 30, 31, 35, 48) y el inmunoensayo de microesferas fluorescentes
(MIA (comunicacin personal).
Actualmente, la prueba de mayor uso internacional para el diagnstico de la
infeccin, para realizar estudios sobre prevalencia, y para examinar caballos para
exportacin,

es

una

prueba

de

micro-neutralizacin

en

presencia

de

complemento. Tambin se ha utilizado para el examen de sangre de corazn fetal


para el diagnstico retrospectivo de casos de aborto asociados a la AVE (56).
Adems de la prueba NV, la prueba FC se ha utilizado para diagnosticar
infecciones recientes

por el EAV, puesto que los anticuerpos que fijan el

complemento son de una duracin relativamente transitoria (22). En contraste,


los ttulos de anticuerpos neutralizantes anti-EAV pueden persistir con frecuencia
durante aos despus de la infeccin natural (59).
Aunque se han desarrollado varias pruebas ELISA (11, 14, 30, 31, 35, 48),
ninguna se ha validado tan ampliamente como la NV, pese a que algunas parecen
ofrecer una sensibilidad y especificidad casi iguales (11, 30, 31, 48). A diferencia
de la prueba NV, una reaccin positiva por ELISA no refleja necesariamente el
estado de proteccin inmune de un caballo individual anti-EAV ya que estn
implicados anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes.
Mediante protocolos convencionales de inmunizacin se han preparado en
caballos y en conejos antisueros antiEAV no purificado. Adems, se han
desarrollado en ratn anticuerpos monoclonales y en conejo anticuerpos monoespecficos para la protena de la nucleo-cpsida (N), la glicoprotena principal de
la envoltura (GP5) y la protena de la envoltura no glicosilada (M) del EAV (7, 17,
28, 39, 40).
La OIE dispone de sueros estandarizados para el EAV2 que pueden facilitar la
estandarizacin de la prueba de la micro-neutralizacin y la del ELISA.
Hasta la fecha solo se ha reconocido un serotipo importante (41, 59). Este est
representado por la cepa prototipo Bucyrus (ATCC VR 796). El virus de referencia
utilizado en la prueba de NV para el EAV es la cepa del CVL-Bucyrus (Weybridge).
El stock de virus se obtiene en la lnea celular RK-13, se clarifica de restos
celulares por centrifugacin a baja velocidad y se guarda en alcuotas a 70C. Se
descongelan varias alcuotas y se determina la infectividad del virus por titulacin
en clulas RK-13.
a) Neutralizacin del virus (prueba prescrita para el comercio internacional)
La prueba de NV se utiliza para examinar sementales por si hay evidencia de
infeccin por el EAV y para determinar si se necesita detectar el virus en semen
mediante cultivo celular o por una prueba RT-PCR. Se utiliza tambin con finalidad
diagnstica para confirmar la infeccin en casos sospechosos de AVE. El
procedimiento de la prueba de la NV de uso ms difundido es el desarrollado por
los Laboratorios del

Servicio Nacional Veterinario del Departamento de Agricultura de los EE. UU. (52).
Es importante obtener una muestra de sangre estril para evitar que la
contaminacin bacteriana interfiera en el resultado de la prueba. Se recomienda
realizar la prueba en clulas RK-13 utilizando como virus de referencia la cepa
aprobada CVL-Bucyrus (Weybridge)3(20).
La historia completa de pases de la cepa CVL (Weybridge) no est documentada
aunque deriva originalmente de la cepa Bucyrus prototipo del virus. La
sensibilidad de la prueba de la NV para detectar anticuerpos anti-EAV est muy
influenciada por varios factores, especialmente por el origen y la historia de
pases de la cepa vrica utilizada (20, 21). La cepa CVL-Bucyrus
(Weybridge) y la cepa vacunal MLV muy atenuada del EAV son de sensibilidad
semejante para detectar sueros positivos de ttulo bajo, especialmente en
caballos vacunados contra AVE. Se continan realizando esfuerzos para lograr
una mayor uniformidad en el protocolo de la prueba y los resultados serolgicos
entre los laboratorios que utilizan la prueba NV u otras pruebas serolgicas
comparables para esta infeccin.
b) Enzimo-inmunoensayo
Para detectar anticuerpos anti-EAV se han desarrollado varios ELISA directos o
indirectos (11, 14, 30, 31, 35, 48). Estos se basan en la utilizacin de virus
purificados o de antgenos recombinantes derivados de los virus. La utilidad de
las pruebas iniciales estaba limitada

por la frecuencia de reacciones positivas

falsas (15), que se asociaban con la presencia de anticuerpos contra varios


antgenos de los cultivos de tejidos en los sueros de caballos que haban sido
vacunados con antgenos derivados de cultivos de tejidos (15). La identificacin
del importante papel de la protena GP5 en la estimulacin de la respuesta
inmune humoral contra el EAV condujo al desarrollo de varios ELISA que emplean
una porcin de ella, o la protena recombinante completa producida en un
sistema

de

expresin

bacteriano

de

baculovirus

(14,

17,

30).

Ms

recientemente, se ha utilizado un pptido sinttico conjugado con ovoalbmina


que presenta los aminocidos 81106 de la protena GP5 (48). Algunas de estas
pruebas parecen presentar una sensibilidad y especificidad casi idnticas a las de

la prueba NV y pueden detectar anticuerpos anti-EAV antes de que se pueda


obtener una reaccin positiva por la prueba de la NV (11. Sin embargo, pueden
ocurrir reacciones negativas falsas en algunas de estas pruebas. El anlisis al
azar de una batera de pptidos fgicos con sueros policlonales de caballos
infectados por el EAV permiti la identificacin de ligandos, que se purificaron y
emplearon como antgenos en un ELISA para el EAV (31). Sin embargo, no se
encontr correlacin entre los valores de absorbancia obtenidos con este ensayo
y los

ttulos de anticuerpos neutralizantes, lo que indica que los anticuerpos

detectados estaban dirigidos fundamentalmente contra eptopos no superficiales


del virus. Un ELISA basado en el uso combinado de las protenas estructurales
GP5, M o N del EAV, expresadas por baculovirus recombinantes, detect con xito
los anticuerpos en caballos infectados natural o experimentalmente, pero no en
animales vacunados contra AVE (30).
Respecto a cualquier ELISA para EAV basado en la protena GP5 es muy
importante considerar el hecho de que la sensibilidad de la prueba vara en
funcin de la secuencia del dominio o regin superficial que se utilice en el
ensayo de esta protena vrica. Entre aislamientos del EAV (47) se ha encontrado
una considerable variacin en la secuencia de aminocidos de este dominio (4).
Para aumentar la sensibilidad de un ELISA basado en GP5 puede ser necesario
incluir varias secuencias del dominio superficial que representen diferentes
aislamientos fenotpicos de EAV en vez de depender de una nica secuencia
superficial. Otros dos ELISA de descripcin ms reciente parecen ofrecer un
diagnstico ms prometedor y fiable de las infecciones por el EAV (14, 48). Se ha
descrito un ELISA bloqueante que utiliza MAbs producidos contra la protena GP5
con una sensibilidad del 99.4% y una especificidad del 97.7% en comparacin
con la prueba NV (14). Otra prueba, que es un ELISA con un pptido sinttico de
GP5 conjugado a ovoalbmina, tiene una sensibilidad y especificidad del 96.75%
y 95.6%, respectivamente, utilizando una referencia de 400 sueros positivos por
NV y 400 muestras negativas por NV (48). Es posible que se disponga en breve
de un ELISA con una sensibilidad y especificidad similar a la de la prueba NV.

ENCEFALITIS EQUINA VENEZOLANA


El diagnstico de la infeccin por el virus de la EEV requiere la demostracin de la
presencia de anticuerpos especficos en pares de muestras de suero recogidas
en las fases aguda y convaleciente. Despus de la infeccin, los anticuerpos
detectados en la prueba de PRN aparecern entre los das 57, los anticuerpos de
la FC entre los das 69, y los anticuerpos de la HI entre los das 67. La segunda
muestra de suero de la fase de convalecencia se debera tomar a los 47 das
posteriores a la recogida de la primera muestra de la fase aguda o en el
momento de la muerte. En el Captulo 2.5.3 se describen con detalle los
procedimientos serolgicos que se deben seguir. Para interpretar cualquiera de
los resultados de las pruebas serolgicas de la EEV se tendra que tener en
cuenta la historia de la vacunacin. En el caso de caballos que no se han
vacunado recientemente con una cepa del virus vivo atenuado, la demostracin
de la presencia de anticuerpos sricos del tipo IgM especficos de la EEV en una
muestra simple de suero confirma una exposicin reciente al virus.
Se debera considerar con cierta cautela cualquier diagnstico de la EEV en un
individuo que se base en la seroconversin en ausencia de una epizootia. A pesar
de que los subtipos y variantes enzoticos no son patognicos para los quidos,
la infeccin estimular

la produccin de anticuerpos

epizoticas del virus de la EEV.

frente a las variantes