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los perfiles genticos de los tumores usando tanto el ADN libre circulante y

clulas tumorales circulantes aislado de la misma muestra de sangre entera


conservada
Abstracto
informacin molecular obtenido a partir de sangre de pacientes de cncer es
una herramienta de investigacin emergentes y de gran alcance con un
inmenso potencial como compaero de diagnstico para la estratificacin y la
monitorizacin del paciente. La sangre, que puede ser muestreada de forma
rutinaria, proporciona un medio de inferir el estado actual gentica de los
tumores de los pacientes a travs de anlisis de clulas tumorales circulantes
(CTC) o ADN tumoral (ctDNA) circulante. Sin embargo, la evaluacin precisa
tanto de los CTC y las ctDNA requiere que todas las clulas de la sangre que se
mantengan intactas hasta que las muestras se procesan. Esto dicta para ctDNA
anlisis de muestras de sangre EDTA deben procesarse con 4 h de drenaje, lo
que limita severamente el uso de ctDNA en ensayos multi-sitio. Aqu se
describe un protocolo de recogida de sangre que es susceptible para el anlisis
de ambas CTC y ctDNA hasta cuatro das despus de la recogida de sangre. Se
demuestra que los rendimientos de ADN circulante libre (cfDNA) obtenidos a
partir de muestras de sangre CellSave integrales son equivalentes a los
obtenidos a partir de plasma EDTA convencional procesada dentro de las 4 h
de la extraccin de sangre. Orientados y NGS en todo el genoma revel la
calidad del ADN comparable y informacin de la secuencia resultante de cfDNA
dentro de las muestras CellSave y EDTA. Tambin demuestran que los CTC y las
ctDNA se pueden aislar de la misma muestra de sangre del paciente, y dar a
los mismos patrones de la CNA que permite el anlisis directo del estado
gentico de los tumores de los pacientes.

En resumen, nuestros resultados demuestran la utilidad de un mtodo sencillo


que permite el anlisis molecular de los CTC y robusta cfDNA para las terapias
dirigidas genotipo en los ensayos clnicos en mltiples sitios y representan una
mejora metodolgica significativa para un beneficio clnico.

Palabras clave
ctDNA ;CTC ;La sangre ;NGS ;biomarcador
abreviaturas
cfDNA , ADN libre de clulas circulantes ;CTC , las clulas tumorales
circulantes ;ctDNA , el ADN tumoral libre de clulas circulantes ;NGS , prxima
generacin secuenciacin
1. Introduccin

Los avances tecnolgicos en transmitidas por la sangre biomarcadores de


cncer, hoy es posible analizar de forma rutinaria el ARN y el ADN de las
clulas individuales ( Rothwell et al., 2014 , Ramskld et al., 2012 y Guvi et
al., 2014 ), incluyendo las clulas tumorales circulantes aislados (CTC) s y la
hora de cantidades derivadas de tumores de ADN presentes en las muestras de
sangre de pacientes (revisado en Krebs et al., 2014 y Daz y Bardelli, 2014 ).
ADN libre de clulas de anlisis (cfDNA) que circula est emergiendo como un
relativamente simple biomarcador pero potente para controlar el estado de la
enfermedad y los mecanismos de informacin de la resistencia al tratamiento
en pacientes con cncer, con la importante ventaja de ser mnimamente
invasiva y adecuado para el muestreo longitudinal ( Murtaza et al. , 2013 ). CTC
tambin se han demostrado ser clnicamente informativo con CTC enumeracin
reconocido como un biomarcador de pronstico por la FDA en mama
metastsico, prstata y colorrectal ( Cristofanilli et al., 2004 , de Bono et al.,
2008 y Cohen et al., 2008 ). Ms recientemente, las CTC se han ampliado in
vitro e in vivo que proporciona informacin valiosa sobre la biologa del tumor
( Hodgkinson et al., 2014 ) y tienen el potencial de proporcionar una
oportunidad mnimamente invasivo para estudiar los perfiles genticos de
tumores, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y evaluar la
heterogeneidad del tumor.

Sin embargo, para un anlisis preciso y sensible de ambos CTC y cfDNA, es


importante asegurarse de que la recogida de sangre, el transporte y el
procesamiento no dan lugar a dao celular o lisis resulta en la prdida de CTC o
dilucin de cfDNA de glbulos blancos lisados (WBC) contenido. La dilucin de
ctDNA debido a la lisis del CMB puede dificultar la capacidad de detectar
clnicamente importantes mutaciones asociados a tumores, o dar lugar a
estimaciones errneas de la fraccin mutante de cfDNA, perjudicando de este
modo los estudios de mecanismos de la enfermedad y emergentes residuales
de la resistencia al tratamiento ( Lucas et al., 2014 y De Mattos-Arruda et al.,
2013 ). En los protocolos estndar cfDNA, lisis del CMB se minimiza mediante la
preparacin de plasma dentro de un corto perodo de tiempo desde la
extraccin de sangre (por lo general 1-4 h), que puede ser un reto en sitios no
especializados y clnicas ocupadas. Este requisito para su procesamiento
inmediato de la muestra de sangre limita severamente el alcance de la
utilizacin de cfDNA en un entorno clnico ms grande, incluyendo ensayos
clnicos multicntricos genotipo dirigida donde las muestras necesitan ser
enviados a los laboratorios centrales. Recientemente, el uso de tubos de
recogida de sangre dedicados que contienen un conservante que permite el
transporte de sangre total a temperatura ambiente durante varios das antes
del aislamiento cfDNA se ha demostrado que ampliar la ventana dentro de la
cual las muestras se pueden utilizar para la extraccin de cfDNA ( Norton et al.,
2013 ). Para el anlisis de CTC, la prdida gradual de la integridad celular con
el almacenamiento prolongado de una muestra de sangre EDTA estndar se
supera mediante el uso de un CellSearch tubo CellSave preservacin. Esto
preserva las clulas en la sangre entera para un mximo de 4 das a

temperatura ambiente y permite el transporte internacional de muestras de


sangre y un flujo de trabajo estandarizado, sin necesidad de procesamiento de
muestras en los sitios de recoleccin. Utilizando el sistema de CellSearch
CellSave, CTC puede ser marcado con fluorescencia y enumer ( Hou et al.,
2012 ), y aislado y caracterizado genticamente mediante secuenciacin de
todo el genoma (WGS) ( Hodgkinson et al., 2014 ). El anlisis de los CTC y las
cfDNA de la misma muestra de sangre entera se extendera la informacin
molecular extrado de una muestra nica y permitir la comparacin directa de
los CTC, que proporcionan informacin a nivel de clulas individuales y cfDNA,
lo que representa una imagen molecular global de la enfermedad ( Kidess y
Jeffrey, 2013 ). A continuacin, se describe el aislamiento de los CTC y cfDNA
de muestras de sangre CellSave, seguido por todo el genoma y se centr la
secuenciacin de prxima generacin (NGS) para establecer un anlisis fiable y
eficaz de ambas CTC y cfDNA de sangre total transportada hasta 4 das a
temperatura ambiente . Potencialmente, esto permite a los sitios clnicos no
especializado para enviar las muestras de sangre a los laboratorios centrales
para el procesamiento y anlisis de expertos, reduciendo el tiempo requerido
para el procesamiento de sangre en las clnicas ocupadas, minimizando la
variabilidad en los datos moleculares resultantes obtenidos y la apertura de
anlisis molecular de CTC y cfDNA a grande ensayos clnicos multicntricos.

2. Material y mtodos
2.1. voluntarios sanos normales (HNV) y la recogida de muestras de sangre del
paciente

muestras de sangre pareadas se recogieron en un CellSave y un vacutainer con


EDTA y se transfieren al laboratorio clnico y experimental para su
procesamiento. Se recogieron todas las muestras ya sea desde HNVs (personas
contratadas dentro del Manchester, Instituto CR-Reino Unido que no se padece
actualmente o que son tratados para el cncer) o pacientes con cncer
despus de recibir el consentimiento informado de conformidad con la
Declaracin de Helsinki bajo la tica 07 / H1014 / 96 despus de la aprobacin
de la revisin interna y las Juntas de tica del hospital Christie NHS Trust.
Durante todo el estudio un total de 20 HNV, 11 cncer de pulmn de clulas
pequeas (SCLC) y 34 pacientes con melanoma fueron reclutados y cfDNA
aislado.

2.2. preparacin cfDNA y cuantificacin

Por tanto EDTA y plasma CellSave muestras de sangre se separ de la sangre


entera por medio de dos centrifugaciones secuenciales (2000 g, 10 min) y se

almacenaron a -80 C en alcuotas de 1 ml. cfDNA se aisl de 1 ml de plasma


doble hilado usando el QIAamp circulante cido nucleico Kit (Qiagen) segn las
instrucciones del fabricante. Despus del aislamiento el rendimiento cfDNA se
cuantific utilizando el TaqMan Kit RNasa P de deteccin (Life Technologies)
segn las instrucciones del fabricante.

2.3. Enriquecimiento y aislamiento de los CTC

CTC y glbulos blancos (pre-teidas con anticuerpos frente a CD45, pan-CK y


DAPI) se aspiraron desde el cartucho CellSearch utilizado para el recuento de
CTC, y se aislaron clulas individuales utilizando el sistema de DEPArray (silicio
Biosystems) segn las instrucciones del fabricante. WGA de CTC individuales y
glbulos blancos se realiz utilizando el kit Ampli1 WGA (silicio Biosystems) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.4. preparacin biblioteca NGS y secuenciacin

Secuenciacin del genoma completo (WGS) de CTC tumores derivados de


explantes (CDX), CTC y los glbulos blancos se llev a cabo como se describi
previamente ( Hodgkinson et al., 2014 ). NGS centrado de las muestras con un
mnimo de 8 ng cfDNA se realiz utilizando el Panel de cncer de pulmn
Qiagen GeneRead v1 (Qiagen) como se describe por el fabricante, con
excepcin de entrada se redujo hasta un mnimo de 8 ng de ADN (ng asegurar
2 de entrada en cada uno de las 4 reacciones multiplex PCR Qiagen
GeneRead). Este panel de cubierta 20 genes comnmente mutado en el cncer
de pulmn (mTOR, las ANR, PTGS2, PTEN, HRAS, KRAS, RB1, AKT1, TP53,
ErbB2, STK11, ALK, CTNNB1, PIK3CA, PDGFRA, KIT, EGFR, MET, BRAF,
CDKN2A ). WGS de cfDNA se llev a cabo utilizando el NEBNext Kit de ADN
Biblioteca Prep Ultra para Illumina Kit (NEB) mediante la entrada de ADN 5
ng. NGS para ambos enfocados bibliotecas y bibliotecas GeneRead WGS cfDNA
se llev a cabo utilizando un Illumina secuenciador de escritorio MiSeq.

2.5. El anlisis NGS apuntado

Anlisis de los datos GeneRead NGS se realiz en el software Sequence


Analysis DNAseq variante basada en la nube Qiagen de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Para WGS, anlisis de secuencias de extremo
emparejado dice estaban alineados con el genoma humano referencia
GRCh37 / hg19 utilizando la herramienta de alineacin de Burrows-Wheeler
(BWA, versin 0.7.4) con los parmetros por defecto y el algoritmo BWA-MEM.

Las alineaciones fueron ordenados y catalogados por las coordenadas


cromosmicas utilizando SAMtools (versin 0.1.19), seguido por PCR duplica
eliminacin de material mediante la funcin Picard herramientas
MarkDuplicates (versin 1.96) ( http://picard.sourceforge.net). Variantes de
nucletido nico (SNVS) se identificaron utilizando VarScan2 (versin 2.3.7) con
los siguientes valores: min-cobertura = 8, min-reads2 = 2, min-avg.qual = 15,
min-var-frec = 0,01, p -valor = 0,01.

2.6. Copia anlisis del nmero de la aberracin de los datos WGS

Secuencia de extremo emparejado dice estaban alineados con el genoma


humano referencia GRCh37 / hg19 usando SMALT alineador (versin 0.7.1,
http://www.sanger.ac.uk/resources/software/smalt/). ndice SMALT fue
construido mediante el establecimiento de k = 20 y s = 13. Las alineaciones
fueron ordenados y catalogados por el cromosoma coordenadas SAMtools
usando (versin 0.1.18). Las variaciones del nmero de copias se predijo
mediante el uso de la tecla Control FREEC (versin 6.4) con los siguientes
valores: coefficientOfVariation = 0,1, ploida = 2, mateOrientation = FR.
Control-FREEC produce diferentes tamaos de ventana de acuerdo con la
profundidad de la secuencia en cada muestra. Con el fin de agrupar las
muestras por sus perfiles de nmero de copias, se descompuso las ventanas
superpuestas en disjuntos (es decir, que no se solapan) ventanas. Los
contenedores de nueva formacin heredan el estado nmero de copias que se
asign a la ventana de los padres antes de la descomposicin. Despus de esta
operacin, se obtuvo una matriz con igual nmero de contenedores a travs de
muestras. A continuacin, las muestras se agrupan jerrquicamente por sus
perfiles de nmero de copia basndose en la distancia euclidiana y el mtodo
de ligamiento Ward en R.

2.7. Evaluacin de los ndices de error NGS

Dos mtricas fueron utilizados para inferir la tasa de mutacin en las muestras
CellSave y EDTA: el primero se calcul como el nmero de SNV detectada
dividido por el nmero total de bases en el archivo cacharro; la segunda
mtrica se calcul dividiendo el nmero de SNV detectado por el nmero de
bases con por lo menos 8 cobertura en el archivo cacharro.

Para dar cuenta de la variacin en la profundidad de secuenciacin entre las


muestras, se realiz un muestreo descendente 100 de los datos alineados,
manteniendo 1 milln de pares de lectura en cada iteracin. Nos re-calcularon
las tasas de mutacin promediando la salida de todas las iteraciones. Una cola

de dos t -test se realiz para evaluar si la tasa de mutacin es


significativamente diferente entre las muestras CellSave y EDTA.

3. resultados
3.1. Aislamiento de cfDNA de EDTA y CellSave HNV muestras de sangre

Nuestro objetivo fue evaluar la utilidad de la 'vida real' de CellSave conserva la


sangre para su anlisis de cfDNA y CTC como se aplica a muestras de sangre
obtenidas en mltiples sitios y enviados a un laboratorio centralizado para el
anlisis. Esto tuvo el objetivo ms amplio de desarrollar un protocolo
estandarizado para facilitar la generacin de anlisis consistente, tanto cfDNA
molecular de los CTC y en muestras clnicas. Para determinar el efecto de WBC
de lisis en los rendimientos cfDNA despus del almacenamiento a largo plazo
(> 24 h) de la sangre completa en EDTA, aislamos plasma de la sangre dentro
de 1 h de la recogida en un tubo de EDTA vacutainers estndar y luego a los
24, 48, 72 y 96 h despus de la extraccin. Despus del aislamiento, el
rendimiento cfDNA se determin usando el tiempo real de ensayo PCR RNasaP
( Figura 1 A). Se detectaron cantidades crecientes de cfDNA lo largo del tiempo,
con un aumento de casi 3 veces visto por 24 horas despus de la extraccin,
aumentando a ms de 60 veces en 96 horas, lo que podra reducir la capacidad
de detectar la fraccin ctDNA dentro de las muestras clnicas.

A. Grfico que muestra el aumento de los niveles cfDNA en el plasma de la


sangre EDTA a la izquierda en la habitacin ...
Figura 1.
Una . Grfico que muestra el aumento de los niveles cfDNA en el plasma de la
sangre EDTA deja a temperatura ambiente durante un mximo de 96 horas
despus de la extraccin. B . Esquema de EDTA y CellSave cfDNA estudio de
estabilidad. C . cfDNA rendimientos de 20 muestras de sangre de elevado valor
natural con EDTA o CellSave y procesados ya sea 4 h o 96 h despus de la
extraccin. No hay diferencia significativa en los rendimientos globales entre el
4 h EDTA, 4 h CellSave y muestras CellSave 96 h con un aumento altamente
significativo en el rendimiento cfDNA siguiente 96 h en EDTA.
Figura opciones
Para evaluar la idoneidad de utilizar CellSave para reducir CMB lisis y facilitar el
anlisis cfDNA, se realiz un estudio de 20 voluntarios sanos normales (HNV)
donde cada HNV don dos EDTA y dos muestras de sangre CellSave. Para cada
donante HNV cfDNA fue aislado de uno de EDTA y un tubo CellSave dentro de
las 4 h de extraccin de sangre post (rango 2,0-3,3 aislamiento h, media = 2,8
h). El resto de los tubos de EDTA y CellSave fueron enviados a travs del

sistema postal britnico de regreso a la institucin de acogida utilizando un


Royal Mail Caja fuerte, despus se mantuvo a temperatura ambiente
durante el almacenamiento hasta 96 horas despus de la extraccin (rango
93.3-95.3 aislamiento h, media = 94.5 h) ( Figura 1 B). El rendimiento de cfDNA
de todas las muestras se determin utilizando un ensayo en tiempo real PCR
RNasaP, y no mostr ninguna diferencia significativa entre el 4 h EDTA, 4 h
CellSave y muestras CellSave 96 h ( Figura 1 C). Como era de esperar, un
aumento significativo en cfDNA se observ en la muestra EDTA 96 h en
comparacin con las muestras tanto CellSave y la muestra EDTA 4 h, lo que
refleja extensa lisis WBC.

3.2. La evaluacin de las tasas de error de EDTA y CellSave cfDNA NGS

Aunque el conservante CellSave redujo significativamente el nivel de WBC lisis,


manteniendo de este modo la fraccin ctDNA dentro de las muestras, es
posible que los componentes del tubo CellSave podran actuar como un agente
que daa el ADN y aumentar de manera efectiva la secuencia de errores de
fondo. Para probar esto, EDTA estndar y 96 h muestras CellSave cfDNA del 20
HNV se sometieron a WGS. Para estimar la carga global de aprobados de
mutaciones baja datos de secuenciacin de Illumina WGS MiSeq se generaron a
partir de tres repeticiones tcnica de cada conjunto de muestras, con cfDNA
agrupado de cada conjunto de muestras que se utiliza para obtener la entrada
cfDNA 5 ng. Ms de 1,0 10 8 bases fueron secuenciados para cada biblioteca
con aproximadamente 9,5 10 3 variantes de nucletido nico (SNVS)
identificados por muestra cuando se analizaron en contra del genoma Hg19. No
se encontraron diferencias significativas entre la calidad global de los datos de
NGS en trminos de la cobertura total, mapability, duplicados y el total de lee,
y las tasas de mutacin de la CellSave (60,4 SNV por millones de bases) en
comparacin con las muestras de EDTA (58,9 SNV por milln de bases ) indica
CellSave cfDNA es compatible con las estrategias de NGS extendidas ( Figura 2
A y 2 C). Tambin se realiz el anlisis de los tipos de SNV detectados dentro
de la cfDNA en cada uno de los tubos de recogida, con frecuencias similares de
transiciones y transversiones visto tanto en el tipo de muestra que sugiere
ningn efecto del conservante CellSave en la integridad cfDNA ( Figura 2 B).

A. Nmero de variaciones de un solo nucletido identificados en un charco de


HNV cfDNA ...
Figura 2.
Una . Nmero de variaciones de un solo nucletido identificados en un charco
de HNV cfDNA prepara a partir de EDTA procesada hasta 4 h extraccin de
sangre y de post procesado CellSave 96 h posterior extraccin de sangre. No
hubo diferencia significativa en SNPs por milln de bases para las muestras de

EDTA y CellSave cfDNA (emparejado t -test p> 0,05). B . Repertorio de


mutaciones detectadas en cada coleccin con frecuencias iguales de
transiciones y transversiones visto en las dos muestras con EDTA y CellSave.
C . Resumen de la calidad general de los datos generados a partir de NGS EDTA
y CellSave deriva cfDNA mostrando niveles comparables de mapeo, ley la
alineacin y la duplicacin.
Figura opciones
3.3. Aislamiento de cfDNA de EDTA y CellSave muestras de sangre del paciente

Tubos al vaco CellSave se utilizan habitualmente para el recuento de CTC


mediante el CellSearch plataforma y el anlisis molecular de los CTC
recuperados de CellSearch cartuchos se puede lograr utilizando ambos NGS
amplios centrados y Genoma ( Hodgkinson et al., 2014 , Gasch et al., 2013 y
Heitzer et al., 2013 ). Desde el CellSearch sistema requiere 7,5 ml de
entrada de sangre y el vacutainer CellSave puede contener hasta 10 ml a
menudo hay sangre excedente, que se puede utilizar para los anlisis
adicionales. Para probar la idoneidad de CellSave para el anlisis cfDNA de
muestras clnicas, se compararon los rendimientos de cfDNA obtenidos a partir
de sangre CellSave excedente a los rendimientos de cfDNA obtienen a partir de
muestra obtenida de una muestra de sangre EDTA paralelo a un tratamiento
que plasma dentro de 4 h a partir de dos cohortes clnicas. El anlisis de 11
SCLC y 34 muestras de pacientes de melanoma mostr rendimientos
comparables de paciente cfDNA de 4 h plasma EDTA (de aqu en adelante
como estndar EDTA) a cfDNA aisladas de sangre CellSave mantenido a
temperatura ambiente durante hasta 96 h ( Figura 3 A). Esto refleja los
resultados del experimento de elevado valor natural y mostr la sangre
CellSave ser fuente estable de ambos cfDNA y CTC para el anlisis de muestras
clnicas.

A. Los rendimientos de cfDNA de muestras clnicas recogidas en EDTA


duplicados y ...
Figura 3.
A . Los rendimientos de cfDNA de muestras clnicas recogidas en EDTA
duplicados y sangres CellSave de una cohorte de 11 SCLC y 34 pacientes con
melanoma. No se encontraron diferencias significativas entre cada tipo de
coleccin en ambas cohortes. B . Las mutaciones identificadas en cinco
muestras de pacientes de SCLC utilizando un enfoque de NGS objetivo. De la
lnea germinal gDNA, EDTA cfDNA y CellSave cfDNA se analiz para cada
paciente. Las mutaciones se denominan con recuentos de lectura> 200 y
frecuencia de> 10%. Muestras mutados se indican por llenar de color rojo con
alelos WT indicados por relleno verde.

Figura opciones
3.4. NGS selectivos de EDTA y CellSave cfDNA

Con la unidad de utilizar cfDNA para identificar las mutaciones asociadas a la


enfermedad prximo a prueba la idoneidad de CellSave cfDNA NGS para el
anlisis especfico de las muestras clnicas. Con este fin, 5 de los 11 pacientes
con CPCP con sobre 8 ng de cfDNA disponible tanto para EDTA estndar y
CellSave cfDNAs se analizaron utilizando el Panel de cncer de pulmn Qiagen
GeneRead. Este panel consta de 4 piscinas de amplicones basados en la PCR
que cubre el cncer de pulmn asociado genes 20. Anlisis de los datos de NGS
se llev a cabo y se compara con una muestra de la lnea germinal
correspondiente de cada paciente para cada EDTA y CellSave muestra. En
consonancia con la alta frecuencia de mutaciones de TP53 en el CPCP ( Peifer
et al, 2012. Y Rudin et al, 2012. ; . George et al, 2015 ), TP53 mutaciones
somticas se identificaron en 4 de los 5 pacientes con CPCP analizados con
esencialmente idnticos resultados observados tanto para EDTA y CellSave
acertaron muestras ( Figura 3 B). Para 1 paciente (SCLC-03) que no albergan
una mutacin TP53 detectable, se detect una mutacin ALK, de nuevo con
niveles similares observados tanto para EDTA y CellSave acertaron muestras.
Para paciente SCLC-05, adems de una mutacin TP53, una segunda mutacin
de frecuencia ms baja en erbB2 se identific tambin constantemente en
ambas muestras de EDTA y CellSave que sugieren la posible heterogeneidad
tumor dentro de este paciente.

3.5. el nmero de copias del genoma entero alteracin (CNA) de emparejado


cfDNA y CTC

As como la identificacin de mutaciones asociados a tumores, baja


profundidad de secuenciacin del genoma completo (WGS) de cfDNA puede ser
utilizado para caracterizar los patrones de la CNA que surgen a partir del ADN
tumoral circulante (ctDNA) presente en el cfDNA totales ( Leary et al., 2012 y
Mohan et al., 2014 ). El anlisis CNA Puesto que nosotros y otros han
demostrado puede aplicarse fcilmente a los CTC aislado despus del
enriquecimiento CellSearch ( Hodgkinson et al., 2014 , Gasch et al., 2013 y
Heitzer et al., 2013 ), el uso de CellSave para el aislamiento cfDNA permitira
combinado CTC y cfDNA anlisis del mismo tubo de recogida ( Figura 4 A),
maximizando as el potencial de informacin clnica que puede ser dilucidado.

A. Procedimiento esquema que muestra para el procesamiento de una sola


muestra de sangre para dar ...
Figura 4.

Una . Esquemtica que muestra el procedimiento para la tramitacin de una


nica muestra de sangre para dar NGS anlisis de cfDNA y CTC . B & C . Sin
supervisin agrupamiento jerrquico de los perfiles de la CNA en dos pacientes
de SCLC. CNA perfiles fueron generados a partir CTC aislados, EDTA cfDNA,
CellSave cfDNA, dos tumores CDX (A solamente), la lnea germinal ADNg y
aislada del CMB. Emparejan patrones de ganancia (regiones de rojo) y prdida
(regiones de azul) se observaron en todos los materiales del tumor y estaban
ausentes de los controles de la lnea germinal. Las flechas indican la ubicacin
del nmero de copias aberraciones comunes que se encuentran en el CPCP con
el aumento de la prdida indicando rojo y azul. Flechas oscuras indican loci
lleno alterados en la muestra del paciente.
Figura opciones
Para establecer anlisis CTC y cfDNA combinado, se utiliz 7,5 ml de una
muestra de toda CellSave sangre para el aislamiento CTC a travs de
CellSearch y DEParray como se ha descrito previamente ( Hodgkinson et al.,
2014 ) y se utiliz la sangre CellSave restante (tpicamente de 1-2,5 ml) para
preparar cfDNA. Los glbulos blancos se utilizaron como un control de la lnea
germinal para el anlisis CTC CNA y WGS de ADN de sangre entera sirvi como
control de lnea germinal para las muestras cfDNA. Para un paciente, tambin
hemos sido capaces de generar tumores en un CDX-ratn inmune
comprometido siguiente CTC enriquecimiento de una muestra de sangre con
EDTA paralelo. Hemos demostrado anteriormente que estos CTC enriquecidos
pueden dar lugar a C tumorales irculating celular D erived X enografts ( CDX
tumores) que proporcionan material tumoral ( Hodgkinson et al., 2014 ), para
comparar los patrones de la CNA de ambos CTC y cfDNA obtenido a partir del
correspondiente muestra de sangre CellSave. Figura 4 muestra la comparacin
de los perfiles generados a partir de CNA CTC aislados, EDTA cfDNA, CellSave
cfDNA, dos tumores CDX, lnea germinal gDNA y el ADN aislado de WBC 2
pacientes de SCLC. Los resultados muestran una clara tumoral relacionada
patrones CNA en emparejado CTC, CDX y cfDNA con patrones similares
observados para ambos CellSave y EDTA cfDNA. El patrn de ganancia y la
prdida de los dos tumores CDX en el paciente 1 ( Figura 4 B) son consistentes
con estudios previamente publicados sobre la CNA en SCLC ( Peifer et al., 2012
y Rudin et al., 2012 ) con las regiones que contienen RASSF1 y FHIT se pierden
y las regiones que contienen SOX2 y BCL2 que muestra la amplificacin. Los
tumores CDX tambin muestran la amplificacin de las regiones de los
cromosomas 2 y 14, con este patrn tambin se observa en ambos CTC y todas
las muestras cfDNA. En el caso 2 ( Figura 4 C) no haba ningn tumor CDX
disponible, pero las regiones de prdida y ganancia en los CTC se corresponden
bien con los datos publicados, incluyendo la prdida del cromosoma 17 (TP53)
y la amplificacin del cromosoma 3 (Sox2). Un patrn similar de prdida y
ganancia tambin se ve en la CNA de las muestras cfDNA, con buena
correlacin entre las muestras con EDTA y CellSave que muestran CellSave
cfDNA sea adecuado para NGS CNA y compatible con la recoleccin y el
anlisis combinado de CTC.

4. Discusin
La utilizacin de marcadores biolgicos de transmisin sangunea como ctDNA
y CTC para el perfil molecular de los tumores y de muestreo longitudinal tiene
un inmenso potencial clnico que est empezando a hacerse realidad ( Murtaza
et al., 2013 y Garca-Murillas et al., 2015 ). Sin embargo, para realizar
plenamente este potencial es importante que los biomarcadores son aplicables
a los estudios multicntricos y representar con precisin el estado molecular
del tumor en el momento de la recogida. En un intento de asegurar esto,
hemos evaluado el uso de toda la sangre CellSave conservado como una
fuente tanto de los CTC y las cfDNA.

Los primeros experimentos que buscan en los rendimientos cfDNA de sangres


CellSave eran compatibles tanto con una reduccin efectiva de la lisis del CMB
y el aislamiento cfDNA eficiente a partir de muestras de sangre completa
CellSave mantiene a temperatura ambiente durante un mximo de 96 h.
Adems, el anlisis WGS NGS de carga mutacional en general despus del
almacenamiento en CellSave no mostr diferencias significativas en la muestra
con EDTA 4 h. Ambos resultados sugieren que toda CellSave sangre es una
fuente viable de cfDNA.

NGS selectivos de diferentes muestras de EDTA y CellSave paciente cfDNA en 5


pacientes con CPCP identificaron las mismas mutaciones con frecuencias de los
alelos de tumores similares apoyando la idoneidad de CellSave sangre para su
anlisis molecular cfDNA de muestras clnicas. Mutaciones especficas del
tumor se identificaron tanto en EDTA y CellSave aislados ctDNA, con
mutaciones de TP53, que se asocian comnmente con SCLC, vistos en 4 de los
5 pacientes. Una mutacin ALK se identific tanto en el EDTA y CellSave ctDNA
en el paciente restante. Aunque las mutaciones en este locus ALK no se ha
informado anteriormente, las translocaciones de ALK de baja frecuencia se han
observado en SCLC ( Toyokawa et al., 2013 ) que plantea la posibilidad de que
la mutacin detectada est implicado en la patologa de la enfermedad.

Una ventaja importante de la sangre CellSave es que permite el anlisis de


ambas CTC y cfDNA desde el mismo tubo. El anlisis CTC proporciona anlisis
molecular del tumor a nivel de clulas individuales y tiene el potencial de dar
una idea de la heterogeneidad del tumor y EMT y los mecanismos de
diseminacin metastsica de la enfermedad. ctDNA anlisis proporciona una
visin global de la situacin gentica de la enfermedad con ctDNA ser liberado
de todos los sitios de la enfermedad que permiten la deteccin de posibles
longitudinal de mecanismos de evolucin del tumor y de resistencia. Este
anlisis es interesante ya que permite la comparacin directa de los dos como

biopsias lquidos potenciales y permite una evaluacin de la importancia de


determinar si las alteraciones genticas recogidos por evaluacin ctDNA son
co-expresados en CTC individuales.

En resumen, hemos demostrado la idoneidad de las muestras de sangre entera


CellSave tanto para CTC y el anlisis molecular cfDNA. La capacidad de generar
perfiles moleculares informativos tanto de los CTC y las cfDNA partir de una
simple muestra de sangre entera enviado a temperatura ambiente durante
hasta 4 das representa una mejora metodolgica significativa para un
beneficio clnico. La capacidad de procesar las muestras en un solo sitio
receptor evita la variabilidad de sitio a sitio, un problema importante de
confusin en el anlisis cfDNA ( Gormally et al., 2004 , 2007 ). Por otra parte, el
uso de un simple protocolo de recogida de sangre no requiere equipos
especializados, tales como centrfugas o incluso de refrigeracin, se ampla el
nmero de sitios clnicos que pueden participar en la evaluacin del paciente a
travs de biopsias lquidos a cualquier lugar donde se toma una muestra de
sangre. Por ejemplo, despus de la terapia inicial de cncer, los pacientes en
remisin se pueden monitorizar a travs de una extraccin de sangre en una
prctica mdica local en lugar de que requiere a menudo largos viajes / caros a
un centro de oncologa especializada.

En septiembre de 2015, el primer compaero ctDNA diagnstico de la


evaluacin de la mutacin EGFR para la estratificacin de pacientes fue
aprobado por la EDA ( Douillard y col., 2014 ). Postulamos que las biopsias
quirrgicas mnimamente invasivas, como lquido se vuelva cada vez ms
utilizados para el manejo de los pacientes de cncer, la capacidad de dibujar
de forma rutinaria y simplemente muestras de sangre y de la nave a los
laboratorios acreditados de evaluacin de biomarcadores que facilitar los
albores de este nuevo desarrollo en la entrega de medicamentos para el cncer
personalizados.