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La Separacin de Organelos

En los aos 1950 y 1960, los cientficos utilizaron dos tcnicas


para estudiar organelos: microscopa y fraccionamiento.
Christian de Duve estaba a la vanguardia de fraccionamiento
celular. A principios de la dcada de 1950, utiliz
centrifugacin para distinguir un nuevo organelo, el lisosoma,
a partir de fracciones previamente caracterizados: el ncleo,
la fraccin rica mitocondrial, y los microsomas. Poco despus,
utiliz la densidad de equilibrio de la centrifugacin para
descubrir otro organelo.

Antecedentes:

Las clulas eucariotas estn altamente organizadas y compuestas


por las estructuras celulares conocidas como organelos que realizan
funciones especficas. Mientras que la microscopa ha permitido a los
bilogos describir la ubicacin y el aspecto de diversos organelos, esto
es de uso limitado en el descubrimiento de la funcin del organelo. Para
ello, los bilogos celulares se han basado en una tcnica conocida como
fraccionamiento de la clula. Aqu, las clulas se rompen, y los
componentes celulares se separan en funcin de su tamao, masa y
densidad usando una variedad de tcnicas de centrifugacin. Entonces,
los cientficos podran aislar y analizar los componentes celulares de
diferentes densidades, llamadas fracciones. Usando este mtodo, los
bilogos haban dividido la clula en cuatro fracciones: ncleos, fraccin
de mitocondrias, microcosmos, y la savia de la clula.
De Duve fue un bioqumico interesado en los lugares subcelulares
de las enzimas metablicas. l ya haba completado un gran nmero de
trabajos sobre el fraccionamiento de las clulas del hgado, en la que
haba determinado la localizacin subcelular de numerosas enzimas.

Mediante la localizacin de estas enzimas en fracciones de clulas


especficas, podra empezar a dilucidar la funcin del orgnelo. l ha
observado que su trabajo se basa en dos hiptesis: ". El postulado de la
nica ubicacin" y el "postulado de la homogeneidad bioqumica" y en
resumen, estas hiptesis proponen que toda la composicin de una
poblacin subcelular contendr las mismas enzimas, y que cada enzima
se encuentra en un sitio discreto dentro de la clula. Armado con estas
hiptesis y la poderosa herramienta de la centrifugacin, de Duve
subdividi la rica fraccin mitocondrial.

El Experimento

De Duve estudi la distribucin de enzimas en las clulas de


hgado de rata. De gran actividad en el metabolismo energtico, el
hgado contiene una serie de enzimas tiles para estudiar. Para buscar la
presencia de diversas enzimas durante el fraccionamiento, se bas en
pruebas conocidas, llamado ensayos enzimticos, para la actividad
enzimtica. Para conservar mxima actividad enzimtica, tuvo que
tomar precauciones, que incluyeron la realizacin de todas las etapas de
fraccionamiento a 0 C ya que el calor desnaturaliza las protenas que
comprometera la actividad enzimtica.

De Duve utiliza la tasa zonal de centrifugacin para separar los


componentes celulares por etapas de centrifugacin sucesivos. Se quit
el hgado de la rata y fue destrozada por homogeneizacin. A
continuacin, la preparacin cruda de clulas homogeneizadas se
someti a una centrifugacin de velocidad relativamente baja. Este paso
inicial separa el ncleo de la clula, el cual recoge como sedimento en el
fondo del tubo, a partir del extracto citoplsmico que permanece en el
sobrenadante. A continuacin, de Duve subdivide an ms el extracto
citoplasmtico en fraccin mitocondrial pesada, fraccin mitocondrial
liviana, y la fraccin microsomal. l lo llev a cabo separando el
citoplasma mediante el empleo de las sucesivas etapas de
centrifugacin de fuerza cada vez mayor. En cada paso, que recoge y
almacena las fracciones para el anlisis de enzima subsiguiente.

Una vez que el fraccionamiento fue completa, de Duve a cabo


ensayos enzimticos para determinar la distribucin subcelular de cada
enzima. A continuacin, representa grficamente la distribucin de la
enzima a travs de la clula. Tal como se haba demostrado
anteriormente, la actividad de la citocromo oxidasa, una enzima
importante en el sistema de transferencia de electrones, se encuentra
principalmente en las fracciones mitocondriales pesados. La fraccin
microsomal fue mostrado para contener otra enzima glucosa-6-fosfatasa
previamente caracterizado. La fraccin mitocondrial liviana, que se
compone de los lisosomas, mostr la actividad de la fosfatasa de cido
caracterstico. Inesperadamente, de Duve observ un cuarto patrn
cuando se ensay la actividad de uricasa. En lugar de seguir el patrn de
los enzimas de referencia, la actividad de uricasa se concentr
bruscamente dentro de la fraccin mitocondrial liviana. Esta
concentracin aguda, en contraste con la amplia distribucin, sugiri a
De Duve que la uricasa puede ser aislada en otra poblacin subcelular
separada de las enzimas lisosomales.

Para probar esta teora, de Duve emplea una tcnica conocida


como el equilibrio de centrifugacin de densidad gradiente, que separa
macromolculas sobre la base de la densidad. Equilibrio
centrifugacin de densidad gradiente, se puede realizar utilizando un
nmero de diferentes gradientes incluyendo sacarosa y glucgeno.

Adems, el gradiente puede estar compuesta, ya sea en agua


o "agua pesada" que contiene el istopo de hidrgeno deuterio
en lugar de hidrgeno. En su experimento, de Duve separaba la fraccin
mitocondrial preparado por centrifugacin en cada uno de estos
diferentes gradientes (verFigura 5.1). Si la uricasa era parte de un
compartimiento subcelular separado, se separara de las enzimas
lisosomales en cada gradiente probado. de Duve llev a cabo los
fraccionamientos en esta serie de gradientes, luego realizaron ensayos
enzimticos como antes. En cada caso, se encontr uricasa en una

separada poblacin que la fosfatasa cida lisosomal y la enzima la


enzima mitocondrial citocromo oxidasa (ver Figura 5.2). Mediante la
observacin de la actividad de uricasa en repetidas ocasiones en una
distinta fraccin de la actividad de la enzimas lisosomal y mitocondrial,
de Duve lleg a la conclusin de un organelo era parte de uricasa
separada. El experimento tambin demostr que dos otras enzimas, la
catalasa y la D-amino cido oxidasa, segregadas en las mismas
fracciones como uricasa. Debido a que cada uno de estas enzimas
producidas o utilizadas perxido de hidrgeno, ya sea que de Duve
propuso que esta fraccin representa un orgnelo responsable del
metabolismo de perxido y apodado el perioxisome

Figura 5.1
Representacin esquemtica de la separacin de los lisosomas,
mitocondrias, peroxisomas y por centrifugacin de densidad de
equilibrio. La fraccin mitocondrial por la centrifugacin se separ en un
gradiente de sacarosa, y los organelos se separan sobre la base de la
densidad
Figura 5.2
Representacin grfica del anlisis de la enzima de productos de un
gradiente de sacarosa. La fraccin mitocondrial se separ como se
representa en la figura 5.1, y luego la enzima se llev a cabo ensayos.
La concentracin relativa de enzima activa se representa en el eje y; la
altura en el tubo se representa en el eje x. Los picos de actividad de la
citocromo oxidasa (arriba) y la fosfatasa cida (parte inferior) se
observan cerca de la parte superior del tubo. El actividad mxima de la
ureasa (medio) migra a la parte inferior del tubo.

Discusin

El trabajo de de Duve en el fraccionamiento celular proporcion una


visin en la funcin de las estructuras celulares, como l trat de mapa
la ubicacin de enzimas conocidas. Examinando el inventario de las
enzimas en una fraccin de determinada clula le dio pistas sobre su
funcin. Su cuidadoso trabajo dio como resultado el descubrimiento de
dos organelos: el lisosoma y el peroxisoma. Su trabajo tambin
proporcion pistas importantes para la funcin de los organelos. El
lisosoma, donde de Duve encontr tantas enzimas potencialmente
destructivas, ahora se sabe que es un sitio importante para la
degradacin de biomolculas. El peroxisoma ha demostrado ser el sitio
de los cidos grasos y la oxidacin de aminocidos, las reacciones que
producen una gran cantidad de perxido de hidrgeno. En 1974, de
Duve recibi el Premio Nobel de Fisiologa y Medicina en reconocimiento
a su trabajo pionero.