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Tema 14: Tecnicas

especiales de
investigación y/o
diagnostico.

mangos para cuchillas.COM) . guantes. potenciómetro. lavadora de pipetas. bandejas. primarios. microscopio de disección con luz incidente e instrumentos de disección: cuchillas. agujas de disección. centrifuga de mesa. Para prevenir y evitar la infección postoperatoria. tijeras. bandeja para desechos.1 Equipamiento del laboratorio. 1. gabinete para secado por aire caliente. sistema de filtración para producir agua tipo reactivo. pipetas Pasteur. Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido u órgano de origen y del tiempo de su duración distinguimos diferentes tipos de cultivos: de órganos. botellas y material de vidrio o plástico. gradillas para secado. bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños. -----1. bandejas. El término “cultivo de tejidos” suele ser usado como un término genérico que incluye el de cultivo de órganos y el de cultivo de células. filtros para la esterilización de medios de cultivo. con el fin de garantizar el éxito de la cirugía (WWW.JUSTDOCUMENT. horno de microondas. cámaras de alta humedad. etc.1. navaja de afeitar. frascos Erlenmeyer. mascaras. microscopio compuesto. suelo. destilador de vidrio. CUTIVO DE TEJIDOS: Podemos decir que un cultivo de tejidos. estufas para esterilización y secado. instrumental y material:  En el área de preparación: refrigerador. etc.2 Técnica aséptica: Es una serie de medidas preventivas contra los microbios y vía de infección objetivo tomada. pinzas. plancha eléctrica con agitador magnético. marcadores a prueba de agua. desionizador de agua. recipientes de plásticos grandes. agitador para cultivos en suspensión. secundarios. estanterías con iluminación para los cultivos. Otros equipos útiles incluyen: microscopio invertido. También se necesitan frascos con alcohol. termómetros de máxima y mínima y gradillas para tubos de varios tamaños. balanzas.  En el área de lavado y esterilización autoclave manual o automática. microscopio compuesto con objetivo de inmersión.  En el área de transferencia: gabinete de flujo laminar. iluminación y humedad relativa controlada. es el conjunto de técnicas que nos permiten mantener células in vitro con una gran aproximación a sus propiedades y funciones in vivo.  En el área de exanimación: microscopio estereoscopio. mechero de alcohol. cámaras de crecimiento controladas. lentes de aumento y elementos ópticos complementarios  En el área de crecimiento in vivo: macetas. explantes.  En el área de incubación: un cuarto con temperatura.

las levaduras y las esporas de los hongos. La temperatura de la autoclave se regula mediante la presión y es directamente proporcional a esta. Es obvio que todos los materiales esterilizados mediante calor seco deberán de estar limpios Vapor bajo presión (autoclave): es muy eficiente para destruir todas las formas de bacterias y hongos y sus esporas. la superficie de trabajo. y es el método más utilizado para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo.3 Esterilización del material: La esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material. los mico plasmas.A pesar de la utilización de antibióticos en los medios de cultivo. (WWW. En la terminología médica se utiliza generalmente la palabra asepsia para designar la condición en la que están ausentes los microorganismos patógenos. - - Calor seco: Los recipientes de vidrio seco que se utilizan para operaciones estériles se pueden esterilizar por medio de aire caliente.COM) 1. Una correcta y rigurosa técnica aséptica por parte del operador. la contaminación por microorganismos continúa siendo uno de los mayores problemas del cultivo de células. la atmósfera. conjuntamente con la utilización de soluciones y materiales probadamente estériles son imprescindibles para el mantenimiento de los cultivos libres de contaminantes biológicos. La desinfección se limita generalmente al proceso de destrucción de los microorganismos mediante métodos químicos. . Se puede usar en forma de llama directa. cuando se utiliza el calor húmedo puede ser en forma de vapor abierto o de vapor bajo presión. Es necesario extraer todo el aire antes de empezar el proceso de esterilización. Procedimiento de esterilización: El calor es uno de los agentes que se utiliza con más frecuencia en la esterilización. las soluciones. preferiblemente durante dos horas. La autoclave más utilizada actualmente en el laboratorio es la contraparte de mayor tamaño de la olla de presión común. El logro de esterilidad en cualquier preparación depende de muchos factores. sitio o superficie se libera completamente de cualquier microorganismo vivo o espora. el tamaño del recipiente y el número de unidades que se pueden manejar en una sola operación. pueden ser introducidas vía el operador. esto se logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire el aparato . el volumen contenido en cada unidad. de calor húmedo o de calor seco. Las bacterias. como son la naturaleza de las sustancias que se esteriliza.MONOGRAFIAS. para el efecto se coloca en una estufa de aire caliente a una temperatura mínima de 170ºC. etc. antes de cerrar la válvula correspondiente.

a diferencias de ellas . así o se mata necesariamente todas las formas de esporas y puede ser práctico efectuar la esterilización intermitente. la carga eléctrica del material filtrado. Teóricamente la primera exposición destruye todas las formas microbianas. la exposición puede ser de 3 a 60 minutos y se repite diariamente durante 3 días consecutivos. Sin embargo. Es claro que los filtros y otros aparatos se deben esterilizar antes de tratar de utilizar para remover los contaminantes de un líquido. pero no a las temperaturas mayores que tiene el vapor bajo presión. En este caso. Filtración: a través de filtros especiales a pruebas de hongos y bacterias. Este método no está exento de problema.- - Para esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se acostumbra a usar una presión de 15 LB durante 20 minutos. las cuales son tan efectivas como las soluciones de acido crónico y . la temperatura. Nunca de debe utilizar jabón. Adicionalmente. El tamaño del poro es el principal factor en la capacidad de retención de bacterias. así como el efecto de la absorción de proteínas y otras sustancias en el filtro. las soluciones limpiadoras son peligrosas y se deben utilizar con cautela para evitar quemaduras y problemas de contaminación ambiental.4 Reactivos y medios de cultivo: . Este método del calor húmedo a 100 ºC. otros factores son el pH. También existen soluciones inorgánicas para el lavado. 1. la presión y la duración del procedimiento. las esporas puede no desarrollarse en la soluciones no nutritivas. A veces el procedimiento se modifica utilizando temperaturas inferiores al del agua hirviendo y aumentando el número de las exposiciones asta cuando haya una seguridad razonable de esterilidad. hacerlo después con agua desionizada y finalmente con agua destilada Bajo circunstancias especiales puede ser necesario exponer los recipientes de vidrio a soluciones limpiadoras de acido crónico. Se debe recalcar que le tiempo de exposición requerido dependerá tanto del tipo del material que se va a esterilizar como de su cantidad. Limpieza de los recipientes de vidrio: Es de importancia vital en el trabajo de cultivos de tejidos vegetales. durante varias horas. se dice que son inocuas par el medio ambiente. Calor húmedo a 100 ºC: Probablemente sea suficiente una sola exposición de 15 minutos al calor vivo para matar todas las formas vegetativas microbianas. conocido como método de Koch se utiliza en la esterilización de medios que contienen componentes capaces de soportar la exposición a temperaturas de vapor vivo. Sin embargo. se deben adoptar detergentes que se laven y enjuaguen fácilmente. Se debe de utilizar agua caliente con el detergente. por lo cual se recomienda reemplazarlo por el método de filtración. enjuagar con agua caliente sola. En el mercado se encuentra una amplia gama de aparatos e filtración entre los cuales están el Millipore.

 Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos.  De los microorganismos a ser detectados. suero. anaerobio)  Tiempo.  Contienen sustancias nutritivas  pH adecuado  Deben estar estériles. Los requerimientos de los medios de cultivo son específicos de:  La muestra que se analiza.. 2. Incubación: Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar.  La atmósfera empleada. Medios de cultivo: Son necesarios para el aislamiento. semisólidos y sólidos. . microaerofílico. albúmina. la reproducción y la identificación de los microorganismos. Los medios de cultivo se preparan:  En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes.. Según su finalidad en microbiología:  No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.  Enriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser sangre.  A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o  Pueden adquirirse medios listos para su uso. etc.  Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de microorganismo. 2. mantenimiento.1. Según su estado físico: líquidos. Para microorganismos exigentes.(aerobio. Clasificación de medios de cultivo: 1.

El laboratorio debe registrar la fecha : o de recepción o de apertura del envase. o de caducidad 2. Manejo de los medios de cultivo: 1. Almacenamiento de los medios de cultivo y diluyentes preparados Debe determinarse y verificarse el período de validez de los medios preparados en las condiciones de conservación especificadas. Reactivos: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para los ensayos realizados. almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. (http://www. En general los medios preparados se guardan:  En heladera no más de tres meses  A temperatura ambiente no más de un mes en condiciones que impidan que su composición sea modificada. diluyentes y reactivos Los medios de cultivo.scientificainc. (especialmente medios deshidratados) o No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color. o Envases: deben estar herméticamente cerrados.com/) . El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. soluciones y reactivos deben prepararse. Temperatura.  Debe haber un registro de preparación de medios de cultivo y reactivos.  En dicho procedimiento debe haber una descripción del equipamiento necesario.  El laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificación y otros datos en los medios de cultivo y reactivos. Procedimiento para preparación de medios de cultivo.

la sencillez y bajo coste del aparato lo hace ser una alternativa valiosa a los comerciales basados en técnicas de citometría de flujo y contador Coulter. y es adecuado para las cepas de levaduras comerciales. recibe el nombre de Línea Celular. Se preparó una . Cuando este cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le confieren capacidad ilimitada de multiplicación. Así. La invención comprende un método para la determinación de la viabilidad celular y un aparato especialmente diseñado para la aplicación de este método. y un límite de detección suficientemente bajo para detectar 2 x 104 células no viables. mientras que las muertas permiten la entrada del tinte y microscópicamente se observan teñidas. El método utiliza la técnica de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo con detección de fluorescencia. 1. repetitibilidad. recibe el nombre de Cultivo Primario. pruebas para determinar rompimiento de la integridad de la membrana. El azul tripán tiñe a las células que presentan daño en la membrana plasmática. el GrFFF puede ser fácilmente implementado en un sistema convencional de cromatografía de líquidos. fue utilizado para diferenciar entre células viables y no viables / teñidas con azul tripán. pudiendo crecer en forma de mono capa o en suspensión. Además. Funciona adecuadamente como lo demuestra la comparación de los resultados de viabilidad celular obtenidos mediante el GrFFF con los obtenidos utilizando las técnicas de citometría de flujo y de contador Coulter.6 Determinación de la viabilidad celular: La viabilidad mide la proporción de células vivas luego de procedimiento. mide la entrada de tinte que normalmente es impermeable… Las células vivas son impermeables a Trypan Blue y Naphthalene Black. Se determinó la concentración y viabilidad de una suspensión celular. Proporciona una buena linealidad.5 Cultivo celular primario: Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original recién extraído.1. Los cultivos de células animales también se pueden clasificar de acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada.

92 % de viabilidad y 580 0000 cel /mL de concentración celular. es dirigido hacia un finísimo chorro de líquido hidrodinámicamente enfocado. expresadas en células por mililitro. Se usó la cámara de Neubauer para contar e inferir el número de células viables. Se encontró a partir de las células (linfoma de células B) proporcionadas un 85.com. y por medio de un análisis en la fluctuación de la intensidad luminosa recogida por cada detector. presencia de biomarcadores.es/) (http://es. Esta combinación de de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los detectores.disolución 1:2 con 10 μL del cultivo y azul de tripán. mientras que los detectores laterales o SSC brindan información acerca de la . El detector frontal o FSC brinda información acerca del volumen de la partícula.blogspot. La citometría de flujo es una técnica utilizada en forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagnóstico y seguimiento de muchas enfermedades Un rayo de luz monocromático. usualmente de luz láser. Se coloca una serie de detectores en el punto en el que el chorro de líquido atraviesa el rayo de luz. (http://reportesparaestudiantesdequimica. CITOMETRIA DE FLUJO: La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser.slideshare. empleada en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas. y en la ingeniería de proteínas. la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados. El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución. como concentración celular. Cada una de las partículas suspendidas que atraviesan el rayo de luz lo dispersan. es posible derivar varios tipos de información acerca de la estructura física y química de cada partícula individual.net/) 2. y las sustancias químicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partículas son excitadas hasta emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz.

 Un ordenador para el análisis de las señales. Un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales:  La celda de flujo laminar  Un sistema de medición  Un sistema de iluminación formado ya sea por lámparas de alta luminosidad láseres de alta potencia refrigerados por agua.complejidad interna de la misma. Los citómetros de flujo ofrecen una cuantificación automática de una serie de parámetros con altísima calidad. lineal o logarítmico.  Un detector y un conversor de señales ADC  Un sistema de amplificación. láser rojo de helio-neón (λ 633 nm). Los citómetros de flujo modernos son capaces de analizar varios miles de partículas por segundo. verde de helio-neón. láseres de baja potencia refrigerados por aire. Esto es debido a que los componentes internos de las células dispersan la luz. ultravioleta de helio-cadmio. . y pueden separar y aislar activamente partículas de acuerdo a propiedades específicas. láseres de diodo de baja potencia.

III. En la actualidad. en el equipamiento del laboratorio y en la experiencia de sus integrantes. El diagnóstico utilizando métodos de biología molecular ha tenido un gran impacto en el diagnóstico y manejo de las enfermedades infecciosas5. a partir de muestras de tejidos (especímenes de biopsias o autopsias) o células En cada análisis de diagnóstico molecular existen varias técnicas de biología molecular disponibles. Este campo es sin duda una de las áreas de la Patología Molecular que ha . Este desarrollo se ha extendido al diagnóstico en Patología Molecular. bacterias. La elección de la técnica más apropiada para un determinado examen de diagnóstico debe ser muy cuidadosa y basarse en el conocimiento acabado de las ventajas y desventajas de cada técnica. Patología molecular en el diagnóstico de enfermedades infecciosas. Patología molecular en el diagnóstico de neoplasias. básicamente ácidos ribonucleico (ARN) y desoxirribonucleico (ADN). I. han tenido un impacto significativo en Anatomía Patológica En la medida que los patólogos han participado en el estudio de las bases genéticas y moleculares de las enfermedades humanas se ha permitido el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas en Anatomía Patológica y la creación de una subespecialidad en esta disciplina. selección de terapias y evaluación del pronóstico de la enfermedad. los exámenes de diagnóstico molecular disponibles en Patología Molecular están referidos principalmente a la detección de microorganismos. II.BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A ANATOMIA PATOLOGICA: El desarrollo reciente de técnicas de biología molecular y la expansión acelerada del conocimiento de las bases genéticas y moleculares de las enfermedades humanas. estudio de población de riesgo. hongos y protozoos en muestras de tejidos y células aisladas. la Patología Molecular. La Patología Molecular se define por las técnicas que se utilizan en ella y por los elementos que se analizan. diagnóstico de determinados cánceres. Aunque casi la totalidad de estos exámenes se realizan en muestras de sangre de los individuos afectados o con sospecha de poseer la enfermedad y aún no corresponden estrictamente al campo de la Patología Molecular. especialmente en lo referente a estudios de predisposición genética. Estos métodos han sido desarrollados con el objeto de mejorar la sensibilidad y especificidad de los métodos tradicionales de diagnóstico microbiológico. Patología molecular en el diagnóstico de enfermedades hereditarias. al diagnóstico de enfermedades hereditarias y al diagnóstico auxiliar de neoplasias. estudio de micrometástasis. como asimismo acelerar el diagnóstico en casos de microorganismos de difícil cultivo o lento crecimiento. El análisis de la secuencia del genoma humano sin duda incrementará la lista de enfermedades en las cuales se identifiquen las alteraciones genéticas responsables y los exámenes que permitan su detección. en la cual se han implementado técnicas de diagnóstico de virus. sin duda en el futuro éstos también se aplicarán a muestras de tejidos o células aisladas de los mismos.

o Análisis de clonalidad en proliferaciones linfoides. o Traslocación de cromosomas en sarcomas y neoplasias hematológicas. 4. etc. o Estudio de metástasis o Selección de terapias.cl/) 3. ayudando al estudio y aplicación de los principios y las técnicas de biología molecular. diagnóstico de contaminación bacteriana de alimentos. Todas estas técnicas tienen diversa aplicaciones generalmente en le diagnostico de enfermedades hereditarias.scielo. (http://www. detergente para eliminar las . Este desarrollo. En resumen. - Detección precoz de cáncer con métodos moleculares - Diagnóstico de tipos específicos de neoplasias.1Técnica de obtención de ADN: Para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de sangre. que debe acompañarse de la capacitación de los anátomo-patólogos en los principios y técnicas de la biología molecular. cortarlo y pegarlo. búsqueda de alelos más o menos frecuentes asociados a una característica que nos interesa seleccionas.experimentado el desarrollo más acelerado en los últimos años. o Determinación del pronóstico. diagnostico vital. visualizarlo para ver su estado. amplificar una región. debiera incidir significativamente en el desarrollo del diagnóstico anátomo-patológico y en el incremento de la investigación científica en nuestra especialidad. TECNICAS EN BIOLOGIA MOLECULAR: Se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza. etc. o Distinción de doble tumor primario o metástasis. el desarrollo de las técnicas de biología molecular y la expansión acelerada del conocimiento de las bases genéticas y moleculares de las enfermedades humanas han tenido un impacto significativo en Anatomía Patológica. - Determinación de predisposición genética para el desarrollo de neoplasias. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteinasas que eliminan las proteínas del medio.

proteínas y restos celulares 4. . reacciona con la hebra sencilla del ADN y se pega a lugares específicos por complementariedad de base. 3. Kary Mullis. Apareamiento o ‘’Anneling’’: Los cebadores ‘’primers’’ previamente diseñados. Este proceso incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más: 1. y coloca dinucleotidos trifosfatados de 5’ a 3’ leyendo el ADN de 3’ a 5’. - Se necesita ‘’primers’’ que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar - La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN - Puede contaminarse con el ADN.2 PCR: Es la ampliación de ADN in vitro por medio de la polimerización de cadena de ADN utilizando un termociclador. Polimerización o extensión: una polimerasa de ADN extiende los ‘’primers’’ en el espacio comprendido entre ambos ‘’primers’’. Su propósito es hacer muchas copias de un fragmento de ADN. Desnaturalización: consiste en separar la doble hebra de ADN y convertirla en hebra sencilla 2. se realiza la amplificación de un segmento específico de ADN teniendo poco material disponible. Ventajas del PCR: - A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para su estudio - Puede utilizarse para clonar . Fue diseñada por el Dr. Se sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de ADN molde.membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN. Desventajas del PCR: - Se puede reproducir solo parte del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia. secuencial y análisis - Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto - Sus aplicaciones son múltiples. Por eso se deja bajar la temperatura.

de manera que éste de desnaturaliza al romperse los puentes de hidrógeno. mayor conexión evolutiva entre especies. También se han desarrollado métodos rápidos por transferencia al vacío. entonces conviene dar antes un tratamiento con rayos UV o una solución ácida para introducir mellas que permitan que los fragmentos difundan a través de la agarosa. la sonda pueda encontrar su secuencia complementaria. hay que contar con una secuencia diana dentro de un fragmento de DNA y con una sonda. Para empezar. El DNA a hibridar debe digerirse previamente con una o varias enzimas de restricción para dar lugar a una serie de fragmentos individualizados que se pueden resolver en una electroforesis en un gel de agarosa. posteriormente. se rastrea (screening) el fragmento con la sonda específica. Cuando la sonda y la diana se encuentran. el dúplex se identifica con radiactividad. En general.4. Para que el DNA se transfiera es necesario sumergir el gel en una solución alcalina. Una vez inmovilizado el DNA sobre el filtro. Los tipos de hibridación son: - transferencia Southern - transferencia Northern - La transferencia en ranura - transferencia puntiforme - hibridaciones Grunstein - . A continuación. de manera que se favorezca su asociación y se disminuya la posibilidad de reasociaciones intracatenarias así como las hibridaciones inespecíficas. Este gel de agarosa se «replica» sobre un filtro de nitrocelulosa o nilón mediante la transferencia del DNA desde el gel hasta el filtro. el gel se neutraliza para permitir que el DNA desnaturalizado se transfiera como cadenas sencillas a la membrana. fluorescencia o colorante. según de la manera en que la sonda se haya marcado. Se forman así una serie de DNA híbridos bicatenarios cuya estabilidad va a depender de la cantidad de bases apareadas: cuanto más larga es la sonda y más bases se aparean y más estable es el híbrido. a mayor grado de hibridación. Si el DNA a transferir es de gran tamaño.3 Técnicas de hibridación: La hibridación entre secuencias se basa en la especificidad de la interacción entre las bases nitrogenadas de distintas cadenas. Esta transferencia se produce por capilaridad desde el gel hasta el filtro. La desnaturalización del DNA es esencial para que. y viceversa. que no es más que un fragmento pequeño de DNA de secuencia conocida y complementaria a la secuencia de diana.