Cultivos celulares

Aislamiento de células de un organismo mantenidas en condiciones que
permiten su supervivencia y crecimiento (ambiente artificial con condiciones
favorables).
Ventajas de las células cultivas sobre los organismos intactos para la
investigación: puede ser cultivada un único tipo específico de células con
propiedades homogéneas en vez de todos los tipos de células existentes en
los tejidos de animales y vegetales. Es más factible controlar las condiciones
experimentales en un cultivo que en un organismo intacto. Una única célula
puede ser cultivada más rápidamente hasta formar una colonia de muchas
células idénticas (clonación celular). A la vez, son útiles para ser usadas
como “fabricas” para producir proteínas especificas.
Desventajas de las células cultivadas sobre los organismos intactos para la
investigación: al no encontrarse en su ambiente normal (forma y
comportamiento), sus actividades no están siendo reguladas por otras
células y tejidos como ocurre en un organismo intacto, por lo que sus
propiedades pueden verse afectadas de diversas formas.
Objetivo: desarrollar medios definidos libres de suero que mantengan el
crecimiento de las células
Cultivo exitoso en células animales que permita el funcionamiento y la
supervivencia: simular propiedades lo más cercano a las condiciones dentro
de un organismo intacto, como el acceso a nutrientes esenciales, placas con
recubrimientos especiales, temperatura (37ºC), pH, fuerza iónica. Para esto,
incubadoras permiten controlar temperatura, atmosfera, humedad. Para
protegerlo contra la contaminación del aire o microorganismos se añaden
antibióticos, reactivos, se transfieren células entre placas, se manipulan
especímenes dentro de gabinetes especiales que contienen aire circulante
que es filtrado.
A demás del medio suplementado con aminoácidos
esenciales, vitaminas, sales diversas, ácidos grasos, glucosa y suero.
(mezcla de nutrimentos y vitaminas, proteínas purificadas que incluyen
insulina, factor de crecimiento epidérmico y transferrina que proporciona
hierro a la célula)
Usos: industria farmacéutica y biotecnológica, producción de anticuerpos y
proteínas que los microorganismos son incapaces de sintetizar, screening de
toxicidad, para investigación científica
Importancia adhesión celular: la mayoría de las células animales crecen solo
sobre superficies solidas por ejemplo en vidrio o sobre plástico, para lo que
las células secretan componentes de la matriz extracelular que se adhieren
a esta superficie y crecen sobre la matriz secretada. Los iones de calcio
desempeñan una función clave en la adhesión celular y su eliminación en
los tejidos facilita mucho la separación de las células.

Células liberadas se colocan en un medio rico en nutrientes complementado con suero para adherirse a la superficie y entre sí. Cultivos secundarios: cuando un cultivo primario se es removido de su recipiente a uno donde proliferará. Deriva directamente de la disgregación de un tejido de un organismo sin proliferación (multiplicación). sus cromosomas tienen un número diploide (2n). No todas las células sobreviven al congelamiento y descongelamiento. entre otros). lo que es una propiedad de los cultivos celulares de dejar de proliferar al entrar en contacto entre sí.Cultivos primarios: cultivo con límite de divisiones (sustrato limitado). Fragmentos de tejidos son tratados con una combinación de proteasa y un quelante de catión divalente que reduce los niveles de calcio y magnesio del medio. Deriva de un clon obtenido por transformación de un cultivo primario. conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas. Se detiene por inhibición. No tiene inhibición por contacto. Para preparar células de tejidos: romper interacciones entre célula y célula y entre célula y matriz. su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto. Mantener cultivos por más de 100 duplicaciones para poder clonar células individuales (crecer de manera indefinida). Modelo más cercano a la realidad. cuando uno o varios tipos de células de cultivo primario se resiembran. Se trabaja con células derivadas de tumores o células primarias que atraviesan cambios genéticos espontáneos (transformaciones oncogénicas) (nuevos fenotipos). muerte alterada. La disociación se efectúa con ayuda de una enzima proteolítica como la tripsina que digiere los dominios extracelulares de las proteínas que median la adhesión celular. modificar el comportamiento celular o seleccionar mutantes. Cepa de células: linaje de células originado a partir de un cultivo primario inicial. Se lava el tejido para eliminar la enzima y se suspende en una solución salina que carece de iones de calcio (2+) y contiene una sustancia (EDTA) que se une con los iones de calcio *Cuando de un cultivo primario genera otro tipo de células que se pueden separar recibe el nombre de Cultivos Secundarios. Se utilizan tejidos de animales normales o embriones enteros. Se aleja de la realidad (proliferación. Se pueden congelar (estado de animación suspendida) y almacenar por periodos extensos a temperatura de nitrógeno liquido y utilizando un preservativo para prevenir la formación de cristales de hielo dañinos. . Línea celular: cultivo inmortal (sustrato abundante). Las células crecen hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo formando una monocapa.

Existe también la ultracentrífuga que puede dar vueltas tan rápidamente como 80000 RPM. Primer paso en un esquema típico de purificación de proteínas. sedimentaran en el fondo de un tubo a velocidades diferentes. Los anticuerpos monoclonales se utilizan en la cromatografía para aislar y purificar proteínas de mezclas complejas.Primera línea celular humana: HeLa. a partir de un tumor maligno de cuello uterino. capaz de girar a diversas velocidades. Una técnica alternativa hormonal hace que las células del tejido de la hoja pierdan sus propiedades diferenciadas y se transformen en material de callo el cual puede transferirse a un medio líquido e iniciar un cultivo celular. para marcar y ubicar una proteína particular en células específicas de un órgano y dentro de células cultivadas con inmunofluorescencia. debido a las líneas celulares. Células hibridas: cualquier tipo de célula que contiene componente de uno o más genomas. Producen abundantes anticuerpos monoclonales por la fusión de un clon de linfocitos B descendientes de una célula madre y una célula plasmática tumoral. Fraccionamiento celular Objetivo: disgregar las células separando los organelos principales para estudiar sus funciones individuales. Plantas: en una técnica para crecer en cultivos. Aneuploides: células con un numero anormal de cromosomas además de la estructura en sí. las células pueden crecer en un cumulo indiferenciado de células llamado callo en el que se induce el desarrollo de brotes de los que la planta puede regenerarse. Desventaja: la mayoría de las líneas celulares pierde funciones características de las células de las cuales fueron derivadas (genética y morfológicamente) por lo que no son un buen modelo para investigar funciones normales de tipos especiales de células. En condiciones adecuadas. Instrumento: centrifuga. Medio HAT: utilizado para aislar células hibridas. Una centrifuga acelera la sedimentación al someter las partículas en suspensión a fuerzas centrifugas de hasta un millón de veces . aminopterina y timidina. Dos partículas en suspensión con masas y densidades distintas. Se utiliza como técnica preparativa para separar un tipo de material del resto y como técnica analítica para medir propiedades físicas. contiene hipoxantina. las células vegetales se tratan con la enzima Celulasa que digiere la pared celular y libera la célula desnuda o protoplasto que pueden cultivarse.

lisosomas y Peroxisomas. Este tipo de centrifugación requiere del tiempo adecuado para separarse en zonas. El material no precipitado (sobrenadante) se centrifuga a mayor velocidad para sedimentar cloroplastos.la fuerza de gravedad. haciéndolos menos densos de lo que son y permitiendo una separación limpia. Centrifugación en gradiente de densidad: una vez re suspendida la fracción. Los distintos componentes celulares se separan por tamaño. El homegenado resultante es filtrado para eliminar las células intactas y luego centrifugado a una velocidad medianamente baja para sedimentar como un precipitado en el fondo al núcleo (organelo más grande). Durante la centrifugación por varias horas. terminara todo sedimentado en el fondo del tubo formando un precipitado. se coloca en la parte superior de una solución que contiene un gradiente de una sustancia densa no iónica. se someten a la fuerza centrifuga a distintas velocidades. si la muestra se centrifuga por un periodo demasiado corto no se separaran lo suficiente. Como difieren en tamaño y densidad. se le añade además una solución que contiene detergente que se incorpora a las células por endocitosis y transferido a los lisosomas.: con un medio con gradiente de concentración creciente de soluciones de sacarosa cada vez más densa. Si se centrifuga más de lo necesario. Centrifugación diferencial: separación de las proteínas mas solubles del material celular insoluble. Ej. Al principio el homogeneizado se somete a fuerzas centrifugas bajas por un periodo corto para que solo los organelos celulares mas grandes se sedimenten en un pelotilla. Disgregación de tejidos -> Método físico: ultrasonido Método químico: detergentes Método mecánico: vástagos . mitocondrias. cada organelo se sedimenta hasta que llegan a su sitio en el tubo igual a su propia densidad. Se procede primero a la rotura mecánica de las células con un homogeneizador mecánico que corresponde a una solución amortiguada isotónica la cual previene la rotura de las vesículas de membrana por osmosis. El tubo se centrifuga a alta velocidad durante varias horas permitiéndole a cada partícula migrar a una posición de equilibrio donde la densidad del líquido circundante es igual a la de la partícula. Luego deben ocurrir ultracentrífugas para seguir separando el material. *para separar entre lisosomas y mitocondrias. donde forman bandas.

Lente del ocular: utiliza la imagen formada anteriormente para formar una imagen virtual y aumentada. dificultad para estudiar funciones y procesos en células vivas Limites de resolución: visibilidad. - - - Fuente de luz: ilumina la muestra. ilumina el espécimen con un pequeño cono de luz brillante que permite ver las partes muy pequeñas de este después de la magnificación Lente del objetivo: recibe los rayos de luz enfocados en la muestra por la lente condensadora. Instrumentos que producen una imagen aumentada de un objeto. dificultad para observar objetos traslucidos para lo que se utilizan técnicas citoquímicas como: - - Reactivo de Schiff: permite la detección de ácidos nucleícos. puede estar incluida en su base o estar en la parte externa Lente condensadora: reúne los rayos difusos de la fuente de luz. *Aumento total (magnificación total): el producto entre los objetivos y los oculares Poder de resolución: capacidad que tiene un microscopio de distinguir entre dos puntos que se encuentren muy juntos entre sí. de modo que la estructura de la célula se mantiene lo mas similar posible a la de la célula viva. - Montura completa: objeto intacto. dificultad para marcar una proteína en particular. la cual penetra en su membrana celular e inmoviliza su material macromolecular. más detalles pueden verse. El tejido se deshidrata por transferencia a través de una serie de alcoholes y se impregna con parafina (cera) porque éste rara . carbohidratos y lípidos que tienen grupos aldehídos.Microscopia Microscopio óptico: sistema de lentes ópticos mantenidos por un tubo. un microorganismo entero o una pequeña parte de un organismo grande Corte: se matan las células mediante inmersión del tejido en alguna solución química llamada fijador. ya sea vivo o muerto. 0. Mientras mas fotorreceptores proporcionen información respecto a la imagen. La versión específica para el ADN es la Reacción de Feulgen Nuclear Tinción con lugol: tiñe los granos de almidón de color azul morado Preparación de muestras: encontramos monturas completas y cortes. contraste (diferencia entre las partes adyacentes de un objeto o entre un objeto y su fondo).2 y 1 um Limitaciones: bajo contraste entre lo que nos interesa (señal) y lo que no (ruido). Forma una imagen real y magnificada del objeto dentro de la columna del microscopio.

Las laminillas que contienen cortes adherentes de parafina se sumergen en tolueno que disuelve la cera y deja una rebanada del tejido unido a la laminilla. Presenta un gran poder de resolución debido a las propiedades de ondas de los electrones (mientras mayor sea la longitud de onda. Microscopia de campo oscuro: utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen.vez se disuelve con solventes orgánicos. Microscopia de interferencia (DIC) Microscopia de luz polarizada Microscopio electrónico: forma imágenes en blanco y negro (zonas más oscuras son las zonas de mayor densidad). La luz ultravioleta (negra) brinda un gran contraste para los objetos teñidos con fluorocromo que se ven más brillantes. versatilidad de estudiar funciones y procesos en células vivas Microscopia de campo claro: el material se observa sin tinción. Convierte las diferencias del índice de refracción en diferencias de intensidad (brillantez y oscuridad relativa) Microscopia de fluorescencia: la fuente de luz produce un rayo de luz ultravioleta que viaja por un filtro que bloquea todas las longitudes de onda excepto la que puede excitar el fluorocromo. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Puede aumentar un objeto hasta un millón de veces. Permite examinar objetos vivos así como el seguimiento de procesos celulares. No se puede observar una muestra fresca ni un evento celular “in vivo”. La luz se reemplaza por un haz de electrones que se obtienen al calentar un filamento en un tubo al vacio. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados. es menor la resolución). Tipos de microscopios ópticos: Microscopia de contraste de fases: hace más visible los objetos muy transparentes. Los tejidos se fijan y tiñen con soluciones de materiales pesados para aumentar la dispersión electrónica y obtener el contraste necesario. Ventajas: contraste. Microscopia laser confocal: Combina la microscopía de fluorescencia con el análisis electrónico de imágenes para obtener una imagen tridimensional del espécimen. . Tipos: Microscopio electrónico de transición (TEM): forma imágenes con los electrones que se transmiten a través de una muestra. se necesitan cortes muy finos y las muestras deben someterse a procesos de preparación. utilizando anticuerpos dirigidos contra una proteína permite ubicarla en un células y en relación a otras proteínas o estructuras.

depende entonces del pH del medio. su paso por la columna será más lento. se pasan por una serie de alcoholes y se secan en un proceso de secado de punto crítico. Tipos: Cromatografía de intercambio iónico: separa biomoléculas con distintas cargas. Mientras mayor sea la afinidad de una proteína por el material de la matriz. Las muestras del SEM se fijan. existe un pH para cada proteína en el que el número total de cargas negativas es igual al de cargas positivas. proteínas acidas) . luego se cubre con una capa delgada de metal lo que la deja adecuada para un rayo de electrones. Este tipo de cromatografía separa las proteínas que difieren en carga neta en columnas llenas de perlas especiales que poseen carga positiva o negativa. mientras que las proteínas con carga opuesta se unen a las perlas. conocido como punto isoeléctrico es el que la proteína es neutra. Cuando el pH aumenta. los grupos con carga negativa se neutralizan y los con carga positiva se vuelven más numerosos. Las proteínas en la mezcla con la menor afinidad por la columna aparecen en las primeras fracciones que salen de la columna. Cuando el pH disminuye. El objetivo de la muestra es producir un objeto que tenga las mismas propiedades de forma y superficie que en el estado vivo (careciendo de líquido). Cromatografía Mezcla de componentes disueltos se fracciona a su paso por cierto tipo de matriz porosa. Los componentes pueden relacionarse con una de dos fases alternativas: una fase móvil (solvente en movimiento) y una fase inmóvil (matriz a través de la cual se mueve el solvente) Cromatografía en columna: las proteínas que van a fraccionarse se disuelven en un solvente y luego pasan por la columna (fase inmóvil) que contiene sitios con materiales a los que la proteína en solución puede unirse. Produce una imagen similar a la que se observa en una pantalla de televisión. Se utilizan perlas especialmente modificadas cuyas superficies están cubiertas por grupos aminos o carboxilos NH₃+ y COO. *la carga general de una proteína es la suma de todas las cargas individuales de sus aminoácidos componentes. Las proteínas con la misma carga neta que las perlas son repelidas y fluyen a través de la columna.Microscopio electrónico de barrido (SEM): utiliza electrones que rebotan en la superficie de la muestra.(carga negativa.

Se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobina humana conjugado con fluorocromo que reaccionara con el anticuerpo del complejo anterior . receptores con ligandos. Aprovecha las propiedades estructurales únicas de una proteína. En el caso de proteínas. Las proteínas unidas a las columnas son eludidas agregando un exceso de ligando o variando la concentración de sal o el pH o la composición iónica. por lo tanto se desplazan por la columna con mayor lentitud que las más voluminosas. Si el antígeno esperado está presente se formara un complejo antígeno-anticuerpo Inmunofluorescencia indirecta: se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido. Cromatografía de afinidad: separa biomoléculas con distintas características químicas. el resto de las proteínas. antígenos con anticuerpos) *cromatografía de afinidad a los anticuerpos. entonces todo el complejo es retenido en la columna. lo que permite que una especie de proteína se retire de manera específica de la solución mientras que las demás queden en esta. atraviesan la columna sin unirse a ella. Las moléculas de ligando que se unen a una proteína de interés se ligan covalentemente a las perlas de la columna.Cromatografía de filtración en gel: separa biomoléculas de distinto tamaño (masa). Si la reacción es positiva se formara el complejo antígeno-anticuerpo. independientemente de sus cargas o masas. dextran o agarosa). Las proteínas más pequeñas pueden penetrar en los orificios con mayor facilidad que las más grandes. (enzimas con sustratos. Capacidad de proteínas de unirse específicamente a otras moléculas. mayor será el volumen de elución. Cuanto menor sea la masa. Inmunofluorescencia directa: la muestra que tiene antígenos del microorganismo en estudio se pone en contacto con un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho microorganismo conjugado con fluorescencia. donde el ligando fijado es un anticuerpo especifico para la proteína deseada La columna solo retiene las proteínas que fijan el ligamento unido a las perlas. Se utiliza una columna compuesta de perlas porosas fabricadas a partir de polisacáridos con enlaces cruzados (poliacrilamida. En caso de que la proteína retenida interactué con otras moléculas formando un complejo. los ligandos pueden ser sustratos de enzimas u otras moléculas pequeñas que se unen a proteínas específicas. Inmunofluorescencia Fluorescencia: propiedad de una sustancia de emitir luz cuando es expuesta a radiaciones de baja longitud de onda y alta energía.

Según las cargas. las proteínas más pequeñas migran más rápido a través del gel que las proteínas más grandes El tamaño de poro de un gel se puede variar mediante ajustes en las concentraciones de poliacrilamida y del reactivo que forma enlaces cruzados. . la de mayor carga neta se desplazara mas rápido hacia el electrodo Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS): Geles son suspensiones semisólidas en agua. las proteínas son expuestas al detergente iónico (negativo) SDS antes y durante la electroforesis en gel. En la técnica más poderosa. se desnaturaliza por completo un extracto celular mediante el agregado de altas concentración de urea y luego se extiende sobre una tira de gel que contiene un gradiente continuo de pH formado por anfolitos con lo mas ácidos en un extremo y los más básicos en el otro. haciendo que las proteínas multimericas se disocien en sus subunidades y todas las cadenas polipeptidicas son forzadas a adoptar conformaciones extendidas con relaciones carga:masa similares. Cuando una mezcla de proteínas se aplica un gel y se le pasa una corriente eléctrica. La velocidad a la cual una proteína se mueve a través del gel depende del tamaño del poro del gel y de la fuerza del campo eléctrico.Electroforesis Técnica de separación de moléculas a través de una matriz gelatinosa utilizando una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica (velocidad determinada por su relación carga: masa) Si dos moléculas tienen masa y formas iguales. El SDS desnaturaliza las proteínas. Por lo que la longitud de la cadena es el parámetro que determina la masa y no su forma Electroforesis bidimensional en gel: para separar proteínas de masa similar. Las proteínas se separan primero por sus cargas y luego por sus masas.