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APUNTE DE MARCADORES MOLECULARES

Dr. CRISTIAN ARANEDA T.


Departamento de Produccin Animal
Facultad de Ciencias Agronmicas
Universidad de Chile

Las metodologas moleculares han revolucionado el anlisis gentico. Polimorfismos


basados en DNA se han usado para construccin de mapas de ligamiento, estrategias de
seleccin asistida por marcadores, pruebas de parentesco, identificacin de especies y
estudios de gentica de poblaciones. En las paginas subsiguientes brevemente revisaremos
los tipos principales de marcadores moleculares, la mayora de ellos derivados de la aplicacin
de la Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR. Un marcador molecular o de ADN que
debe presentar un patrn de herencia conocido y mostrar polimorfismo, es decir, deben existir
distintas variantes o alelos del marcador dentro de la poblacin bajo estudio.
RFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restriccin). Idealmente la deteccin
de polimorfismos a nivel del DNA requiere determinar la secuencia exacta de nucletidos,
pero aun la secuenciacin de segmentos de DNA de varios kilobases es laborioso y costoso,
aunque el costo esta decayendo exponencialmente con la aparicin de nuevos equipos cada
vez ms eficientes. Sin embargo, a un nivel de resolucin ms grueso se pueden usar clones
de las regiones gnicas de inters como sondas para southern blot luego de digerir el DNA
blanco con endonucleasas de restriccin. De modo que, el DNA genmico es aislado,
cortado con enzimas de restriccin, posteriormente los fragmentos separados por tamao en
una electroforesis, transferidos a una membrana e hibridados con sondas (normalmente
radioactivas) de la regin genmica de inters (southern blot). La mayora de los estudios
de RFLP usan endonucleasas de restriccin que reconocen secuencias de seis nucletidos,
estas enzimas cortan en promedio una vez cada vez 4096 pb, produciendo fragmentos de
DNA que son fcilmente resueltos en electroforesis en gel de agarosa. Para revelar
polimorfismos en una escala ms fina se debe cortar el DNA con enzimas de restriccin que
reconocen secuencias de cuatro nucletidos. Actualmente este tipo de marcadores tiene un
uso limitado debido a su complejo nivel de desarrollo en relacin con los marcadores basados
en PCR.
VNTRs (Nmero Variable de Repeticiones en Tandem). Existen dos tipos de VNTRs los
llamados Minisatlites y los Microsatelites (SSR = Secuencias nicas repetidas o STR =
Repetidos en Tandem simples). Estos marcadores difieren en el tamao del motivo que se
repite (entre 15 y 100 pb en los minisatlites o entre 1 y 4 pb en los microsatelites). Los
VNTRs se encuentran presentes en todos los genomas de los animales y plantas, aunque son
menos frecuentes en los microorganismos

MINISATLITES. Estos marcadores fueron los primeros VNTR estudiados, en ellos el motivo
repetido no siempre es idntico y su uso fue inicialmente para pruebas de paternidad por
DNA fingerprint. Esta es una metodologa multilocus, es decir se detectan muchos loci que
poseen el minisatlite a la vez, pero no se sabe en qu regin del genoma en que se
encuentran. La muestra de DNA genmico de cada individuo es digerida con enzimas de
restriccin, nuevamente los fragmentos son separados por tamao en una electroforesis,
transferidos a una membrana e hibridados con sondas que en este caso corresponden al
motivo del minisatlite (southern blot). El producto final del DNA fingerprint es un patrn de
bandas que es especfico de un individuo (normalmente entre el 15 al 20% de las bandas son
compartidas por dos individuos debido al azar). Las bandas reveladas por esta tcnica tienen
un patrn de herencia mendeliana, pues en promedio la mitad de las bandas son derivadas de
cada progenitor. Al igual que el RFLP los MINISATLITES han perdido popularidad respecto
de los MICROSATLITES debido a las dificultades tcnicas en desarrollarlos.
MICROSATLITES. Este tipo de marcadores son ms polimrficos que los minisatlites y
poseen la ventaja que pueden ser analizados por PCR. En la amplificacin por PCR de los
microsatelites, los partidores utilizados se ubican en las regiones genmicas que rodean el
microsatlite propiamente dicho. Por lo tanto, estos marcadores son especie especficos
puesto que las secuencias flanqueantes varan de una especie a otra. La metodologa
consiste en utilizar partidores especficos (obtenidos de otros estudios o desarrollados por uno
mismo) para amplificar el microsatlite por PCR, hacer electroforesis en geles de
poliacrilamida de las muestras amplificadas y teir los fragmentos con una tcnica con
plata. Actualmente, el anlisis de los microsatlies se puede realizar en un secuenciador
automtico marcado uno de los partidores con un fluorforo que emite una coloracin
especfica que permite identificar los alelo del microsatlite con presicin. Los marcadores
microsatlites muestran un patrn de herencia codominante, es decir siempre se puede
identificar los individuos heterocigotos.
PCR-RFLP. Esta metodologa combina la amplificacin por PCR de una secuencia conocida
de DNA (un locus) usando partidores especficos, seguido de la digestin del amplificado con
enzimas de restriccin que permiten cortar el fragmento amplificado en algunos individuos y
no en otros, detectando el polimorfismo. ste revelado en electroforesis en gel de agarosa al
ser teido con bromuro de etidio.
RAPD (Amplificacin Aleatoria de Fragmentos Polimrficos de DNA). En un ensayo de
RAPD se utiliza un slo partidor de secuencia arbitraria (tpicamente de 10 bases o 10-mer)
para realizar un PCR (en un PCR ordinario se usan dos partidores). Los partidores son
diseados para contener un porcentaje de G+C de 50 a 70%. Estos partidores se unen a
sitios complementarios presentes en el DNA genmico bajo estudio, si dos partidores se unen
en sitios presentes en hebras opuestas, dentro de una distancia amplificable (normalmente de
2500 bases) se amplifica un fragmento discreto. El nmero de fragmentos amplificados vara
entre 1 y 10 por partidor, cada fragmento corresponde a un locus donde en algunos individuos
hay amplificacin y en otros no la hay, no se puede distinguir el homocigoto del heterocigoto
por lo tanto se detectan como marcadores dominantes.

En esta Tabla se muestra un resumen de los principales marcadores polimrficos de DNA y sus
caractersticas ms importantes. (Tomado de Cushwa y Medrano, Animal Biotechnology 7(1):11-31, 1996)
Caractersticas

RFLP

Minisatelites

RFLP-PCR

Microsatelites

RAPD

Principio

Digestin con Ez. de Digestin con Ez. de Amplificacin


por Amplificacin
por PCR con partidores
restriccin, Southern restriccin, Southern PCR de secuencias PCR de locus simple arbitrarios.
blot e hibridacin
blot e hibridacin
repetidas simples
y digestin con Ez.
de restriccin

Tipo de
polimorfismo

Cambios de bases
en sitios de
restriccin,
inserciones y
deleciones

Cambios de bases,
inserciones y
deleciones

Diferencias en
longitud debido a
nmero de unidades
repetidas

Cambios de bases
en sitios de
restriccin,
inserciones y
deleciones

Cambios de bases
en sitios de unin del
partidor al templado
inserciones y
deleciones

Polimorfismo

Moderado

Bajo

Alto

Moderado

Moderado a Bajo

N loci detectados

1a3

Muchos

1 a 10

Dominancia

Codominante

Dominante

Codominante

Codominate

Dominante

Conocimiento del
genoma estudiado

Ninguno

Ninguno

Si

Si

No

Dificultad
tcnica

Intermedia

Intermedia

Baja

Baja

Intermedia

Costo de
desarrollo

Intermedio

Intermedio

Alto

Alto

Bajo