Aplicaciones de FISH

a. Identificacin de microorganismos de inters clnico

Para su crecimiento y posterior identificacin, muchas bacterias patgenas requieren de medios de cultivos con
caractersticas nutricionales bastante exigentes, y otras necesitan periodos largos de incubacin, lo cual
dificulta el suministro de un tratamiento antimicrobiano efectivo en corto tiempo.
Afortunadamente, en los ltimos aos se ha incursionado el empleo de diversas tcnicas de diagnstico
molecular, y en conjunto con FISH han sido tiles para identificar o caracterizar rpidamente los
microorganismos de importancia mdica (7, 8, 9), desde aquellos asociados a enfermedades de la boca hasta
los que generan infecciones internas en rganos,y de esta manera dar un manejo adecuado del paciente
cuando se trata de establecer la terapia antimicrobiana especfica (10).
Respecto a la microbiota que ataca los dientes, las fases de la infeccin del tejido pulpar por microorganismos
de la dentina siguen siendo un misterio; por esto diversos estudios se han enfocado a dilucidar estos agentes
microbianos mediante la hibridacin fluorescente in situ, empleando secciones del tejido, el cual es embebido
en resina.
De esta manera, se ha logrado identificar los consorcios bacterianos asociados con caries avanzada de la
dentina. Los principales grupos microbianos aislados estn dominados por las bacterias de las familias
Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Veillonellaceae, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Coriobacteriaceae,
Bifidobacteriaceae, Propionibacteriaceae y Prevotellaceae, as como fusobacterias. Las sondas de ARNr 16S
correspondientes a los taxones principales de las bacterias en la dentina cariosa se han utilizado para
proporcionar informacin sobre las caractersticas de la infeccin de la pulpa dental (11).
La relacin entre las bacterias periodontopatognicas y el desarrollo de la aterosclerosis ha estado bajo
investigacin durante muchos aos, y ha proporcionando evidencia creciente de que la inflamacin crnica de
la enfermedad periodontal podra actuar como un factor adicional para la aterognesis.
El uso de la tcnica de FISH apoya la hiptesis de que patgenos periodontales metablicamente activos,
como Treponema denticola y Porphyromonas gingivalis aislados a partir de biopsias de pacientes
periodontopticos o desdentados que sufren de arteriosclerosis, pueden estar ubicados dentro de la pared de
la arteria en la capa ntima a la lesin aterosclertica (12). Otra de las enfermedades muy comunes en nuestro
medio es la faringitis, la cual es unainfeccin causada por diversos virus o bacterias, siendo el estreptococo
betahemoltico del grupo A (EBHGA) el principal agente causal.
Sin embargo, el cuadro clnico de la faringoamigdalitis es inespecfico, debido a que los casos de infeccin
estreptoccica moderada son indistinguibles de una infeccin vrica.
Dado que no es posible realizar un estudio microbiolgico completo de los potenciales microorganismos
responsables, las pruebas deben dirigirse a identificar el EBHGA, por el riesgo de complicaciones supuradas e
inmunolgicas que implica su presencia. Es aqu cuando las tcnicas moleculares, y entre ellas FISH, son
indispensables para la identificacin rpida de S. pyogenes por su alta sensibilidad y especificidad (13) y para
iniciar lo antes posible la terapia con antibiticos que permitan evitar complicaciones y detener la transmisin
de la infeccin a otras personas. El tracto digestivo puede ser infectado por varios patgenos, y entre estos la
bacteria Helicobacter pylori, la cual es conocida por su capacidad de colonizar el estmago humano, y aunque
la mayora de los portadores son asintomticos, la colonizacin puede conducir al desarrollo de varias
enfermedades gstricas, como la enfermedad de lcera pptica, la mucosa gstrica asociada a tejido linfoide
(MALT) y el carcinoma gstrico. La infeccin puede ser diagnosticada mediante sondas fluorescentes de
oligonucletidos que van dirigidas a regiones especficas del H. pylori. Adems, mediante la hibridacin se
puede detectar la resistencia de la bacteria al antibitico claritromicina cuando la sonda se une al gen
ribosmico 23S (ARNr 23S), lo cual permite obtener resultados al cabo de tres horas, garantizando de esta
manera un tratamiento efectivo (14).
La infeccin de las vas digestivas tambin es causada por espiroquetas y se asocia con el crecimiento
excesivo de bacterias del gnero Brachyspira en el intestino grueso. El diagnstico microbiolgico mediante
cultivo se ve obstaculizado por el lento crecimiento y, a su vez, por la naturaleza exigente de Brachyspira spp.,
por lo que en la prctica clnica la infeccn intestinal es diagnosticada histopatolgicamente, y an as, una
porcin significativa de los casos analizados pueden presentar falsos positivos. Debido a que FISH permite la
visualizacin e identificacin de bacterias individuales en secciones de tejido, se han diseado sondas que
permiten identificar todas las especies de Brachyspira con base en la secuencia de datos del gen ARNr 16S
actualmente disponibles (15).

La presencia de parsitos tambin es detectada mediante FISH.

Un ejemplo es el parsito del gnero Cryptosporidium, que puede causar infeccin gastrointestinal en el
hombre, la cual presenta un cuadro de diarrea acuosa y voluminosa con moco, sin sangreni leucocitos, tras
una semana de incubacin.
De manera caracterstica, la identificacin de las especies de este gnero a partir de la morfologa del ooquiste
constituye una gran dificultad, ya que las diferencias en algunos casos son indetectables. En la actualidad se
recurre a la biologa molecular con tcnicas de hibridacin para identificar especies y genotipos de este y otros
parsitos (16).
En infecciones sanguneas, el hallazgo de cocos Gram positivos dispuestos en racimos (CGPR) en una
muestra de hemocultivo es sugestivo de bacteriemia, pero la relevancia del diagnstico depende de la
identificacin correcta del microorganismo y su evaluacin dentro del contexto clnico de cada paciente. En
estos casos, el uso de la
Hibridacin in situ ha mostrado ser un mtodo rpido, fidedigno y practicable para la identificacin directa de
bacterias que se han desarrollado en hemocultivos, mediante sonda dirigida, por ejemplo, al gen ribosmico de
Staphylococcus aureus (17).
Se ha reportado el empleo de FISH para detectar biopelculas formadas por bacterias en diferentes procesos
infecciosos. De esta manera, ha permitido esclarecer cul es la distribucin espacial de las bacterias
formadoras de biofilms que predominan en las heridas crnicas de la piel humana y para obtener la medida de
la respuesta inflamatorias celular contra las bacterias en dichas heridas (18). Otros estudios estn enfocados a
la bsqueda de bacterias causantes de infecciones del tracto urinario. En este caso, en comparacin con los
mtodos convencionales de identificacin, el mtodo de FISH produce resultados positivos para el > 90 % de
las muestras analizadas y tiene el potencial de convertirse en una herramienta de diagnstico muy til en este
tipo de infecciones, por tener una alta precisin y un tiempo de respuesta rpido (3-4 h).
De igual manera, la rapidez y sensibilidad se pueden apreciar en otro tipo de muestras, como en la deteccin
de bacterias que no crecen en cultivos a partir de muestras de lesiones de tejido blando y de biopelculas que
se forman en fracturas de huesos en proceso de cicatrizacin.
Las infecciones intrahospitalarias (IIH) son un problema de salud pblica en nuestro pas por su frecuencia,
severidad y alto costo, de manera que la identificacin fiable y rpida de los microorganismos es de suma
importancia para dar el tratamiento adecuado y comprender su papel en la patognesis de las infecciones. En
la prctica clnica, FISH puede ser utilizado en situaciones en las que una identificacin rpida es necesaria
para un tratamiento ptimo del paciente, y por otra parte, para conocer la abundancia, distribucin espacial y la
morfologa de las clulas bacterianas que puedan presentarse en las diversas salas, como urgencias,
obstetricia, pediatra o ciruga, entre otras, y determinar los tipo de microbios que puedan estar adheridos a
material como vendas, ropas, sondas, monitores o instrumentales.
b. Ambientes acuticos
FISH permite detectar los microorganismos individuales en su microhbitat sin ningn paso de purificacin
selectiva o amplificacin, por lo que puede ayudar a desvelar la funcin ecolgica que cumplen all. Se han
realizado revisiones del empleo de esta tcnica en el estudio de la diversidad de las poblaciones ambientales
como en hbitats acuticos y en los grupos microbianos especficos que participan en la eutroficacin del agua
marina, y ms recientemente ha permitido estudiar la comunidad bacteriana presente en el fitoplancton del
noroeste del ocano Pacfico con el apoyo de la tcnica inmunocitoqumica con bromodesoxiuridina (BICFISH).
Las arqueobacterias cuyo hbitat son fuentes termales, depsitos profundos de petrleo caliente, fumarolas
marinas, lagos salinosos o ambientes polares han sido estudiadas mediante FISH, y en algunos casos con el
uso combinado de microsensores, lo cual permite el anlisis simultneo de la comunidad bacteriana y su
actividad metablica
(2-24). Se han diseado sondas para cuantificar miembros especficos de una comunidad microbiana que
habita en el hielo, como Octadecabacter, Glaciecola y Polaribacter, y se ha determinado la influencia de los
cambios estacionales en la identidad y la actividad in situ de las asociaciones microbianas que habitan en el
rtico.
c. Plantas de tratamiento
Los primeros trabajos realizados empleando FISH se enfocaron a determinar la cantidad de microorganismos
presentes en las aguas residuales de las plantas de tratamiento. Posteriormente se orient su uso a evaluarla
relacin entre el volumen de lodos activados y la presencia de bacterias filamentosas; asimismo, ha sido til en
el monitoreo microbiano de procesos de degradacin de una mezcla de lodos activados a partir de desechos
vegetales.
Las recientes investigaciones se han orientado a analizar la distribucin in situ y la funcin de las bacterias
sulfato-reductores presentes en tapetes microbianos de aguas termales y su participacin en el ciclo del

azufre. De igual manera, FISH ha sido til para determinar la asociacin sintrfica que se presenta en la
comunidad de bacterias que oxidan el amonio (AOB) y el nitrito.
d. Biorremediacin
Se destacan trabajos con FISH en procesos de tratamiento de aguas de desecho con residuos txicos y
recalcitrantes como los compuestos fenlicos, en el empleo de bacterias Gram positivas, tiles en la
degradacin anaerbica del benceno, as como en la identificacin de microorganismos empleados en la
biorremediacin de compuestos xenobiticos y de hidrocarburos poliaromticos.
Otras aplicaciones estn orientadas a evaluar los procesos metablicos que realizan ciertas bacterias
empleadas en la oxidacin de hierro y el uso de bacterias magnetotcticas.
El empleo de oligos especficos ha sido til en la deteccin de cepas que colonizan superficies de las rocas y
estn involucradas en procesos de biodeterioro de monumentos.
e. Simbiosis
Algunos microorganismos que realizan simbiosis son difciles de aislar en cultivos puros. en estos casos FISH
se convierte en una herramienta que facilita la identificacin de microorganismos asociados a plantas, ya que
permite la localizacin del microorganismo dentro del husped. Esta tcnica se ha aplicado a la deteccin de
bacterias intracelulares de yemas y races de plantas; de igual manera, para mostrar la presencia de bacterias
fijadoras de nitrgeno en la caa de azcar y en trabajos de identificacin de Micromonospora spp., y
Paenibacillus spp. en ndulos de la planta Lupinus y de bacterias endofticas del cactus.
La interaccin de bacterias con otros organismos ha sido tema de muchos trabajos en los que la tcnica de
FISH se convierte en una enorme herramienta de utilidad. Por citar algunos ejemplos, se ha aplicado para
determinar el arreglo espacial de las bacterias en tejidos de esponjas, en la identificacin de endosimbiontes de
amebas de vida libre, en hongos micorrizas arbusculares, en el estudio de la microbiota intestinal de gusanos
marinos y de termitas, as como de bacterias quimiosintticas hospedadas en vertebrados marinos.