Divisin de Ciencias Biolgicas y de la salud.

Mdulo II:
Procesos Celulares Fundamentales.
Grupo:
BB05B

Profesor:
M.V.Z. Torres Barranca Jorge Isaac.
Reporte de prctica:
"Aislamiento de bacterias".

Galn Hernndez Kenia Izel.

Herrera Garca Juan Pablo.
Minjares Corts Diana.
Sols Batalla Claudia Erika.

_________________________________________
AISLAMIENTO
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza,
en la mayora delos casos, mediante la produccin de colonias
aisladas en cultivos slidos. El crecimiento explosivo de las bacterias
permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica clula
inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones
ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple
vista y formada por individuos iguales (un clon bacteriano).
Material y reactivos
Material de laboratorio
Asa bacteriolgica
Caja de Petri
Mechero

Material biolgico
Agar Nutritivo
Muestra de agua sucia

Desarrollo
CULTIVO EN PLACA AGAR
Se utilizan variaos mtodos de
siembra por estras en superficie
entre las cuales tenemos el mtodo
francs, cuya finalidad es obtener
colonias separadas. Para esto se
flamea el asa y se toma la muestra
del material a estudiar. Colocando el
inoculo en uno de los extremos de la
caja de Petri con el medio de cultivo
indicado se extiende el cultivo
haciendo 4 o 5 estras paralelas, sin
romper el agar; despus se flamea
de nuevo el asa para enfriarla y sin tomar ms muestra, se hacen 4 o
5 estras paralelas formando un ngulo recto con las anteriores. Este
paso se repite hasta cubrir toda el rea de la caja. Se elaboraron 3
cultivos.
INCUBACIN
Se llevan las placas a incubar a 37C, durante 24 horas.

_________________________________________OBSERVAC
IN

Tras el perodo de incubacin se recogen las placas y SIN ABRIR se

observa el crecimiento bacteriano.

Colonia
s
Forma
Color
Tamao
(mm)
Borde
Superfic
ie
Aspecto
Elevaci
n
Luz
transmit
ida
Luz
reflejad
a
Consist
encia

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

Circular
Incolora
1-5

Circular
Incolora
1-5

Circular
incolora
1-5

Entero
Lisa

Entero
Lisa

Entero
Lisa

Butirosa
Convexa

Butirosa
Convexa

Hmeda
Convexa

Opaca

Opaca

Opaca

Mate

Mate

Mate

Mucoide

Mucoide

Mucoide

_________________________________SEGUNDO
AISLAMIENTO
Es aconsejable hacer un segundo aislamiento antes de proceder a la
obtencin del cultivo puro. Si todas las colonias de la segunda placa
resultan idnticas, puede usarse una de ellas para establecer el
cultivo puro.

Material y reactivos

Material de
laboratorio
Asa bacteriolgica
Caja de Petri
Mechero

Material biolgico
Agar MacConkey
Cultivo de bacterias

Desarrollo

Resiembra
Se seleccionan
resiembra.

cepas

para

la

Cada cepa se siembra por el mtodo

francs en la mitad de una caja de
Petri.
Se rotulan y se llevan a incubar por
24 horas.

______________________________IDENTIFICACIN DE
LA CEPA
Obtenido el cultivo puro es conveniente comprobar su pureza
mediante una tincin de Gram.
Material y reactivos
Equipo

Microscopio
ptico

Material de
laboratorio
Asa
bacteriolgica
Gradilla
Mechero
Portaobjetos
Soporte de
varillas de vidrio

Material
biolgico

Agar
Nutritivo
Cepa

Reactivos
Cristal violeta
Solucin de
Lugol
Alcohol
acetona
Safranina
Aceite de
inmersin
Solucin salina

Desarrollo
TINCIN DE GRAM
Se dibujan con lapiz graso dos crculos en el portaobjetos. Se esteriliza el
asa y se coloca una gota de solucin salina en cada uno de los crculos;
nuevamente se esteriliza el asa, se toma una muestra de la cepa y se
diluye en el primer circulo del portaobjetos. Se vuelve a esterilizar el asa y
se toma una alicuota del primer crculo para diluirla en el segundo.
Posteriormete se fija el frotis llevando a mechero, cuidando no quemar la
muestra.
Finalmente se procede a la tincin de la manera siguiente:

Cubrir con Cristal violeta cada

1 minuto
circulo
Enjuague a chorro dbil
Cubrir con Lugol cada circulo
1 minuto
Enjuague a chorro dbil

Cubrir con Alcohol cetona cada

7
crculo
segundos
Enjuague a chorro dbil
Cubrir con Safranina cada circulo
1 minuto
Observacin al microscopio
Bacilos Gram - sin agrupacin aparente. No se diferencian
esporas.

____________________________________Pruebas
metablicas
La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse
utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes
criterios en la evaluacin de similitudes.
Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas
pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la
actividad de una va metablica a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer
transforma o no. Los mtodos disponibles para realizar estas
determinaciones comparten muchas caractersticas comunes pero
tambin tienen diferencias importantes.
Material y reactivos
Material de
laboratorio
Asa bacteriolgica
Mechero de Bunsen
Tubos para cultivo
Gradilla

Resultados

Reactivos

Material biolgico

Rojo de Metilo
Solucin de KOH
-naftol
Azul de Metileno
Oxidasa
Catalasa
Agua oxigenada

Caldo MR-VP
Citrato de Simons
Agar de Tres
azucares y Hierro
(TSIA)
SIM
Caldo de Urea

Colonia
1
2
3
4

TSI
ALC/
A
A/A
A/A
A/A

GAS

H2S

RM

VP

IND

CIT

URE

MOV

+
+
+

+
+
+

+
+
+

IDENTIFICACIO
N
PROTEUS
VULGARIX
No aislada
No aislada
No aislada

Desarrollo
Medio
Caldo MR-VP
Prueba de
Rojo de
Metilo
Caldo VP
Prueba de
VogesProskauer

SIM

Propsito

Inoculacin

Tratamiento
postincubacin

Determinar habilidad de las bacterias

para producir cidos estables por
fermentacin de la glucosa

48h/ 37C

2 a 3 gotas de Rojo
de Metilo (despus
de los siete das)

Determinar la capacidad de producir

acetona por fermentacin de la
glucosa
1. Determinar si la bacteria a travs
de Triptofanasas puede degradar
el Triptfano a indol.
2. Determinar si hay produccin
de H2S a partir de aminocidos
azufrados
3. Determinar si la bacteria es mvil.

Agar de Tres
azucares y
Hierro (TSIA)

Ver el patrn de fermentacin de la

bacteria

Simmons
Citrate

Utilizacin del citrato como nica

fuente de carbono.

Caldo de
Urea

Determinar si la bacteria degrada la

Urea
Determinar si la bacteria produce
catalasa para degradar el H2O2.

Catalasa
Oxidada

Utilizada para la deteccin de la

enzima citocromo-c-oxidas

48h/ 37C

24-48h/
37C
Estocada
hasta el
fondo

18-28h/
37C
1-estocada
2-estriar
24-48h/
37C
Estriar
48h / 37C
loop

10 gotas de naphtol
5 gotas KOH 40%

Para Indol: 2 a 3
gotas del reactivo de
Kovac

Resultados
Positivo

Negativo

Rojo, presencia de cidos, pH 4

Amarillo
No produccin de cidos
estables.

Color rosa, presencia de acetona

No desarrollo de color
rosa, ausencia de
acetona

Rojo (anillo) presencia de indol

(triptfano fue degradado).

Amarillo, la bacteria no
puede degradar el
triptfano

Negro (precipitado), produccin de

H2S
Difuminacin de la bacteria hacia
los lados
1.Rojo
Utilizacin de glucosa
2.Amarillo
Utilizacin de Lactosa y/o sacarosa
Am
En ambos puede haber produccin
de gas y H2S (negro)

Medio de cultivo se
queda igual.
La bacteria slo crece en
la lnea de inoculacin

Utilizacin de peptonas
Rojo

Azul

Verde

Rosa intenso

Medio permanece igual

Efervescencia

Permanece igual

Observacin de color rojo-fucsia en

la solucin.

Permanece sin cambio

de color.

1 gota de H2O2 a una

colonia
1 gota de Oxidasa
sobre papel filtro y la
colonia

Resultados observados
a Coloni

Caldo MR

1
2
3
4

Antes

Caldo VP

Despu
s

Antes

Desp
us

SIM

Antes

TSIA

Desp
us

Ante
s

Despu
s

Simmons
Citrate
Ante
s

Desp
us

Caldo de
Urea
Ante
s

Desp
us

Catalasa:
Agar
Nutritivo
Ante Desp
s
us

Oxidasa

Ante
s

Desp
us

Resultado

Antes

Des
pus

LLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL