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Análisis genético de GHR debe contener la

secuenciación de todos los exones de
codificación específica de Intrón Secuencias y
detección de exón supresiones
Resumen
Antecedentes: El trabajo de los pacientes con características clínicas y / o
bioquímicas de la insensibilidad de hormona de crecimiento (GHI) por lo
general contiene análisis genético del receptor de la hormona del crecimiento
gen (GHR), y si es negativa, de STAT 5 B, y IGFALS y IGF1. En un informe
anterior describimos 2 hermanos que presentan talla baja, bajos niveles de
IGF-1, la secreción elevada GH y ningún aumento de IGF-1 después de 1
semana de la administración de GH. Análisis repetido de GHR no mostró
alteraciones; Sin embargo, nuevas pruebas revelaron una heterozygous STAT5B
defecto en ambos hermanos .Subjects y Métodos: Dos muchachos de Origen
Surinam-Hindustan mostró la falta de crecimiento hasta la edad de 6-7 años,
seguida de la recuperación del crecimiento parcial asociado con el aumento de
índice de masa corporal. Reanálisis del GHR incluyendo publicación secuencias
de intrones se realizó en el ADN de los pacientes recogidos 7 años antes.
Resultados: La variante heterozygous STAT5B resultó ser funcionalmente
benigna. LA mutación intrónica homocigotos del GHR, c.618 + 792A> G (IVS6
+ 792A> G), posteriormente fue encontrado, lo que resulta en la activación del
pseudoexon 6ψ, y explicar la GHI fenotipo de los pacientes. Conclusión: Una
mutación intronica en el GHR se debe considerar en todos los pacientes con
signos de GHI y ningún codificación de las mutaciones de exón, incluso si el
fenotipo es leve y aunque se han encontrado otras variantes genéticas.
Introducción
En nuestro reciente documento sobre el análisis genético de los niños
pequeños con la aparente insensibilidad de la hormona de crecimiento (GHI)
[1] se informó de que no se encontraron crecimiento homocigotos del receptor
de la hormona mutaciones (GHR), y sólo tres variantes heterozygous GHR.
También informó de 3 pacientes con dos variantes nuevas heterozygous
STAT5B, y en 2 pacientes este hallazgo se combinó con la nuevas variantes
heterocigóticas IGFALS. En nuestra cohorte de pacientes, hubo 2 hermanos (RZ
y IZ) con severa GHI en términos de características clínicas así como los
hallazgos bioquímicos. Sin embargo, el análisis genético de GHR fue negativo
en dos laboratorios independientes. Los hermanos compartían una variante no
clasificados en heterocigotos STAT5B, pero en el análisis de predicción in silico
(PolyPhen-2 programa: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) sugirió la
variante era benigno.

de referencia) [3] y la altura de la madre era de 160 cm (-0. Símbolos para 4 variantes genéticas se indican. incluida su curvas de crecimiento y los resultados de estudios functional STAT5B. La altura del padre era 163 cm (-1. Su IGF-1 nivel fue -4. Al mismo tiempo.2 SDS [8] y mostraron ningún aumento en la administración de altas dosis de rhGH por 1 semana (2. sin ningún tratamiento. -3. una región que no se incluyó en el proyecto inicial. 2 a). el índice de masa corporal (IMC) fue de 1. OMS.5 para el Referencia holandesa [5]).2 SDS [7]. Los padres eran de ascendencia Surinam-Indostán.Fig.8 SDS para la referencia de la OMS [3]. 2 b) y . 1. su índice de masa corporal aumenta (fig. En el primer 7 años de vida la altura del paciente SDS disminuyeron y en el primer examen por el endocrinólogo pediátrico en 6. una mutación homocigota se encontró en el intrón 6 de GHR.8 SDS) [4]. Hace muy poco se nos informó por uno de los laboratorios que se había llevado a cabo el análisis genético inicial que al reanálisis.2 SDS en la carta de la OMS [3] (-2. Altura SDS se menciona según la referencia de la OMS [3].98 años a su altura fue de 107 cm (-2.3 para holandesa 1980 referencias [6] y la circunferencia de la cabeza fue -1.5 SDS.9 años de edad (fig. Sujeto y métodos IZ nació después de 38 semanas de gestación con un parto normal peso (0. y el más altura reciente SDS fue -1.0 en el gráfico holandés [5]) a 15.2 SDS) [2] (longitud desconocida de nacimiento). En esta breve nota se describe la clínica y los detalles de laboratorio de estos pacientes.8 mg / m2). El árbol genealógico se muestra en la figura 1.8 SDS según la Organización Mundial de la Salud. su altura SDS se incrementó a partir de entonces. target altura -0. Curiosamente. Pedigree.

y el índice de masa corporal es de 3.5 SDS [7].0 SDS [6].3 SDS [2].4 años a 0 SDS a la edad de 14. En 2010. d). seguido de dideoxi secuenciando el ADN de los productos de la PCR.5 años. y no hubo signos de inmunodeficiencia. Curiosamente. el padre no pudo ser probado. -4. El más reciente nivel de IGF-1 fue de -1. Él tenía una voz aguda y su desarrollo psicomotor fue retrasado.4 para la referencia holandesa [5]).12 U / l (normal). los dos hermanos llevan varias otras variantes de genes (Fig. Su altura SDS disminuyó en los primeros 6 años de vida. las pruebas genéticas del GHR (codificación de exones incluyendo secuencias de acompañamiento intrón hasta 30 nucleótidos en intrón y MLPA para detectar variantes de número de copias) y varios otros genes [1] se repitió. Por desgracia. se volvieron a analizar las muestras de ADN de 104 pacientes GHI de 97 familias con etiología desconocida. 10]. Análisis genético de GHR En 2007.3 años de la edad de su altura era de 83 cm (-3. En 2013.2 SDS a 7.actualmente es de 2.7 años su altura es de -1.2 SDS y una longitud nacimiento de -2. Su curva de crecimiento y el IMC la evolución fue similar a la de su hermano (fig. SDS altura actuales de ambos los niños no es diferente de la altura del objetivo SDS. fue amplificado por PCR utilizando cebadores GHRX6psiF 5 'TCCCTCTCTTCCTTACCAAGC-3' y GHR-X6psiR 5 '-TTTGACTTAGCATCCAATCAGG-3'. su nivel de IGF-1 aumentó de -4. IZ también lleva una variante heterocigota en STAT5B (p.Glu315Ala). La secuencia genómica que abarca la anteriormente definida GHR pseudoexon 6ψ [9. Él ha mostrado signos de inmunodeficiencia. Otras pruebas genéticas Como se informó anteriormente [1].8 para la referencia holandesa [5]). Su IGF-1 nivel estaba por debajo del límite de detección del ensayo y permaneció indetectable después de la administración de altas dosis de rhGH durante 1 semana.2 SDS de acuerdo con el cuadro de la OMS [3] (-1. Su más joven RZ hermano nació con un peso al nacer de 0. 1). La prolactina fue 0.3 SDS [6] y circunferencia de la cabeza era -2. La pubertad tiene no empezado.8 SDS [8] y la prolactina fue de 0. RZ también .6 años.16 U / l (normal). Pubertad comenzado a 13. De la nota.9 SDS de acuerdo con el cuadro de la OMS [3]. A 12. la variante STAT5B no se encontró en La madre. y en el primer examen en 3. 2 c.2 SDS. y de nuevo no se encontraron aberraciones en el GHR. ninguna aberración patógena se pudo detectar con el código de exones (incluyendo las secuencias flanqueantes del intrón hasta 75 nucleótidos) del gen GHR. el IMC fue del -0.

La Variante IGFALS y la supresión en el cromosoma X también fueron que se encuentra en la madre.Glu315Ala (p. 2. Altura (a) [5] y el índice de masa corporal (b) [6] de IZ paciente.Arg548Trp) y una deleción en el cromosoma X (Xq25 arr (SNP_A-2. la actividad transcripcional medida por ensayos de reportero de luciferasa) se realizaron en los HEK293 (hGHR) reconstitución sistematica . un heterocigotos en la variante IGFALS (p.Glu315Ala se generó y estudios funcionales (expresión variante. lleva la variante STAT5B y.Fig. STAT5B p. la fosforilación de la GH inducida variante.162 → SNP_A-215495) estera x0).E315A) Estudios funcionales la Variante STAT5B p. además.190.

El N-terminal FLAG-STAT5BE315A (FE315A) se generó por mutagénesis específica del sitio (QuickChange II dirigida al sitio Kit de Mutagénesis.) Resultados la Variante STAT5B p.Glu315A es Funcionalmente benigna Se determinó primero si el missense heterocigótica Variante STAT5B (exón 8) identificado en ambos hermanos podía .1 que llevan de tipo salvaje N-FLAGSTAT5B como plantilla. 2. Stratagene. Altura (c) [5] y el índice de masa corporal (d) [6] de RZ paciente Como se describió anteriormente [1]..UU. La Jolla. utilizando pcDNA3. EE.Fig. California.

N-terminalmente FLAGSTAT5B de tipo salvaje variante (F-STAT5B) o F-STAT5B-Glu315Ala (F-E315A) se transfectaron en HEK293 (hGHR) como anteriormente se describe [1] y tratados con GH a las concentraciones indicadas. Cantidades iguales de lisados celulares se utilizaron en la analysis. Los anticuerpos primarios se indican a la izquierda lado de las actividades reportero de luciferasa inducida por GH-panels. cada uno realizado al menos por duplicado. Ambos hermanos son portadores homocigotos de la c. 3 pacientes incluyendo los 2 hermanos que se describen aquí (= 2 familias) fueron encontrado para llevar mutación del GHR 'pseudoexon'. 3 a. Fig. Esta mutación da lugar a la inclusión adicional de 108 bases entre el exón 6 y 7 (6ψ pseudoexon). 3. en los estudios de la reconstitución. Estudios previos incluyendo funcional El análisis mostró una reducción significativa en la expresión del GHR mutante en la superficie celular como el . la Variante F-STAT5BGlu315Ala (F-E315A. 618 + 792A> G Mutación Secuenciación 104 pacientes de 97 familias. Estudios de la reconstitución de la heterozygousSTAT5B variante p.1).Fig. La identificación de un Homocigóto GHR c. como se describe por Metherell et al. Poner en peligro las actividades STAT5b y explicar el Fenotipo GHI observado. [11].618 + 792A> G mutación (IVS6 + 792A> G) del GHR (fig. Esto se traduce en la adición de 36 aminoácidos en el dominio extracelular del receptor. b). Estos resultados demostraron que el variante era funcionalmente benigno y poco probable que sea la causa de la GHI en estos probandos. Sin embargo. 4). Vector (pcDNA3.Glu315Ala. [10] y David et al. Relativa veces de inducción (± SD) en comparación con no tratados (GH 0 ng / ml) células transfectadas pcDNA3.b. 3) se expresó así como de tipo salvaje F-STAT5B y GH inducida fosforilación y actividades transcripcionales de la variante eran de forma reproducible comparable a la de tipo salvaje F-STAT5B (fig.1 (arbitrariamente designados como 1) de 2 experimentos independientes.a Western análisis de inmunotransferencia de GH inducida por fosforilación de la tirosina STAT5B (PY-STAT5).

además. . Esto condujo a GHI con cierta variabilidad de las manifestaciones fenotípicas [10] Discusión Este breve informe es presentado por tres razones. por lo tanto. electroferogramas de análisis de secuenciación de ADN de los 2 hermanos IZ y RZ y un control de tipo salvaje (WT). la mutación específica en intrón 6 había sido descrita en 1 altamente consanguínea Familia paquistaní [9] y se consideró que era demasiado raro y demasiado específicas para un grupo étnico especial que se incluirán en el análisis de la mutación rutinario de GHR. -end 3 'de la 6ψ pseudoexon se indica por la flecha gruesa. La variante STAT5B. una prueba negativa para algunos defectos genéticos no es necesariamente definitiva. y debe ser interpretado con cautela. en particular la variante heterocigota STAT5B. ha demostrado ser funcionalmente normal (fig.618 homozygousGHR + 792A> G mutación (marco negro). En primer lugar. La segunda razón es que sirve como una fe de erratas para el artículo anterior donde se describen estos 2 pacientes como no teniendo ninguna mutación en el GHR y. Sin embargo. Si se justifica.resultado de un defecto de tráfico [11]. los pacientes carecían de algunos de las características fenotípicas típicas de la deficiencia STAT5B: no había señales de la inmunodeficiencia y niveles de prolactina fueron normales. En el momento del primer análisis GHR en 2007. La reciente reanálisis de un mayor número de pacientes reveló que esta mutación en particular es más frecuente de lo esperado. 4. ilustra que el clínico siempre debe interpretar una resultado negativo de una prueba genética a la luz de las limitaciones de las técnicas utilizadas en el laboratorio. 3). debe ser reevaluado cuando la nueva causa de defectos el fenotipo clínico esté disponible. Por lo tanto. se centró en las otras variantes identificadas. Fig. que muestran la c.

con disminuyendo gradualmente la altura SDS.la causa de la triple A síndrome [12]. El fenotipo clínico es amplio. Nuestra familia es de ascendencia Surinam-Hindustan. pero que la Variante IGFALS podría contribuir a la baja estatura de RZ. El aumento de la IGF-1 en el tiempo es interesante. Como los dos chicos se han convertido en obesos. que contiene un gen (WDR40C). con posible efecto en estatura.0 SDS [10. Sin embargo. numerosas variantes moleculares se encontraron en un solo paciente. que también se presentó con deficiencia de cortisol primaria. que van desde los rasgos faciales normales a una típica facies Laron. otros 14 pacientes de 6 no relacionada familias con una mutación del GHR pseudoexon 6 tienen han descrito [10. posiblemente por la acción de esteroides sexuales en IGF-1 a través de la secreción de estradiol [9]. 13]. En los últimos años.3 a -6. 13]. que parecía ser el resultado de una mutación homocigota en el gen theAAAS . estos defectos del GHR improbables tendrían que haber sido considerado. no tuvo ningún efecto en la altura. La talla baja es el síntoma más común y va desde -3. y sugiere que en estos muchachos hay factores-GH independiente que estimulan la secreción de IGF-1. o digenicos incluso efectos causales oligogenicos no hacen más probable. Esto fue apoyado por un 150-kDa pico complejo ternario inferior y un nivel ALS sérica menor que en IZ [1]. lo que puede haber un efecto fundador procedente de la Subcontinente indio. Si los pacientes se habían visto por primera vez en la adolescencia.618 homocigotos + 792A> mutación GGHR (IVS6 + 792A> G). cuando no había ponerse al día en el crecimiento y de IGF-1 los niveles estaban dentro del rango normal. IGF-1 y IGFBP-3 niveles son generalmente bajos o en la parte baja de lo normal alcance. mientras que el IMC aumenta. especialmente cuando se asocia con consanguinidad. después de lo cual ponerse al día Se observó el crecimiento. El fenotipo leve es compatible con los pacientes diagnosticados con talla baja idiopática. En los primeros 6-7 años presentaron una patrón de crecimiento consistente con mutación a GHR. Se especuló que la Xq25 delecion.RZ tenía dos variantes adicionales. continuó la colaboración entre los médicos y el laboratorio de genética es esencial. 11. Esto podría explicar la aumento de IGF-1 en IZ. especular que factores hormonales implicados en la obesidad podrían desempeñar un papel en la el aumento de IGF-1 y el crecimiento alcanzar observada circulante. 5 de estas familias eran de Origen paquistaní y 1 familia era de Palestina árabe. RZ no tiene signos de la pubertad. Se trata sin duda de que con el rápido surgimiento de nuevas metodologías analíticas genéticas. la madre también llevado a ambas variantes y tiene una altura dentro de la gama normal. sin embargo. Por lo tanto. Tiene Se ha demostrado que el IGF-1 los niveles aumentan con el avance etapa puberal. La tercera razón es las presentaciones clínicas inusuales de los hermanos. Este es ilustra en un informe sobre un caso reciente de un paciente con GHI causada por un c. 11. Pese A la mayoría de estas variantes es probable que sean benignos.origen. Se ha sugerido que los diferentes fenotipos pueden ser causados por la presencia de heterogeneidad transcripción y que los sujetos medianamente afectadas podrían tener relación transcripción a GHR a favor de .

la pubertad y la obesidad también podrían contribuir al patrón de crecimiento observado. incluso si el fenotipo es leve. En adición.5 cm / año en el primer año. Sólo 2 pacientes se han reportado haber recibido rIGF-1 tratamiento [13]. . Recientemente. respectivamente. Los resultados de los análisis genéticos deben interpretarse a la luz actual técnicas y conocimientos. La velocidad de crecimiento en el paciente con la mutación combinedGHR andAAAS aumentó de 4. Su hermano. pero disminuyó a 5. que era homocigoto para la mutación GHR intrónico solamente. tenía una mejor respuesta de 10. las pruebas genéticas en niños con corta estatura requiere una estrecha colaboración en curso entre el clínico y el laboratorio de genética. En nuestro pacientes la velocidad de crecimiento cada vez mayor podrían ser el resultado de un tipo salvaje relación de cambio / mutante con el tiempo. mientras que los pacientes gravemente afectados tener una proporción en favor de la proteína mutante [10]. En conclusión. El intronic descrito mutación del GHR debe ser considerada en todos los pacientes con signos de GHI y con la falta de codificación de las mutaciones de exón.0 cm / año en el segundo año.1 cm / año durante el primer y segundo año de rIGF-1 tratamiento.0 a 9.2 y 8. una prometedor estudio en oligonucleótidos antisentido omisión de exón como una nueva herramienta terapéutica para corregir el aberrante empalme por defecto GHR 6ψ fue publicado como una alternativa para rIGF-1 tratamiento en esta condición [14].la proteína normal.