EXTRACCIN,

CUANTIFICACIN E
IDENTIFICACIN DE
PROTENAS
GENTICA MOLECULAR 2016

UNIVERSIDAD DE MORN

PROTEMICA
Ciencia dedicada al estudio de la expresin de las
protenas y de sus cambios en dependencia del
contexto biolgico
Proteoma:
conjunto de protenas expresadas por un organismo (o
por una parte de l, por ejemplo un tipo de tejido) en
un momento dado.

PROTEMICA
Aplicaciones:
1.

Caracterizacin del proteoma de un organismo (identificacin del

mayor nmero de protenas expresadas por un organismo en una
condicin biolgica particular).

2.

Protemica comparativa (evaluar los cambios en la expresin de

protenas de un organismo sometido a dos o varias condiciones
biolgicas diferentes).

3.

Interaccin de protenas entre s y con otras molculas (aislamiento de

complejos de protenas y posterior identificacin de las protenas
componentes; establecimiento de mapas de interaccin y
esclarecimiento del mecanismo de determinadas funciones biolgicas).
3

PROTEMICA
Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula,
constituyendo ms del 50% del peso seco de la clula.
Una clula de un organismo superior contiene en un instante de tiempo
millones de molculas de protenas, correspondientes a unas 5000
especies diferentes de ARNm en promedio.
4000 de ellas existen en un nmero muy bajo de copias (una o dos
molculas por clula) y dan lugar a protenas poco abundantes o muy
escasas.
Se estima que una secuencia de aminocidos puede dar lugar a unas 20
variantes moleculares o especies, con lo cual 5000 ARNm diferentes
seran responsables por unas 100000 especies moleculares diversas a nivel
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de protenas.

PROTEMICA
Luego de ser sintetizadas por la clula, las protenas pueden tener distinta
solubilidad en el medio:
- una protena rica en aminocidos polares es en general ms soluble que

una rica en aminocidos hidrofbicos;

- las protenas fibrosas (alfa-queratina, colgeno) son en general menos

solubles que las globulares;

- los principales factores del entorno de la protena que pueden afectar su

solubilidad son la temperatura, la constante dielctrica del medio y el pH

del mismo y la fuerza inica.

CUERPOS DE INCLUSIN
Agregacin proteica: fenmeno que aparece frente a una situacin de
estrs celular, tal como el que se da cuando las clulas son forzadas a
producir una protena fornea en concentraciones elevadas (con
promotores fuertes).
Debido a que los chaperones celulares que se encargan de ayudar a las
protenas a adoptar su forma nativa se encuentran en cantidad limitante
respecto de la cantidad de protena sintetizada, las protenas que se van
produciendo se pliegan en forma incompleta y se acumulan en forma de
agregados insolubles denominados cuerpos de inclusin.
Los mismos han sido descriptos como agregados proteicos densos,
refrctiles, resistentes a algunos detergentes, cilndricos y de medida
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variable, y que contienen protena activa y funcional.

EXTRACCIN DE PROTENAS
La extraccin de protenas comienza siempre con una ruptura celular o lisis:

rganos u otros tejidos animales: es necesario disgregarlos antes de

proceder a la lisis celular, ya que las clulas se encuentran rodeadas de
tejido conectivo. En general se utilizan enzimas como la colagenasa y/o
una ruptura mecnica grosera con morteros, homogeneizadores elctricos,
tijeras o tamices metlicos.

Cultivo celular: la extraccin puede realizarse adicionando un detergente,

realizando un shock osmtico o por sonicacin.
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EXTRACCIN DE PROTENAS
a) Mtodos fsico-mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin
a alta presin o extrusin por presin;

b) Mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacindescongelacin, sonicacin o secado;

c) Mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes,
cidos o sustancias caotrpicas.

EXTRACCIN DE PROTENAS
Destruccin fsica mcanica:
homogeneizacin: hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan
casi totalmente.
moler en un mortero con arena.
molino con perlas de vidrio.
prensa de French, que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un pequeo
orificio.

Destruccin fsica no mcanica:

sonicacin: someter las clulas a vibraciones de ultrasonido.
congelacin-descongelacin: la rotura se produce al someter las clulas a un cambio
brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) y
pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).
lisis celular: para clulas sin pared celular como las de tejidos animales (para clulas
vegetales o bacterias no es suficiente) se suspenden las clulas en una solucin
hipotnica y debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula,
causando su hinchamiento y rotura.
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Durante el proceso de rotura, se

utilizan buffers de extraccin para
solubilizar
las
protenas,
que
pueden ser disoluciones acuosas
de
buffers
especficos
para
protenas solubles o bien que
adems contengan detergentes si
se pretende purificar protenas
asociadas a membranas.

PRENSA
FRENCH
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FRACCIONAMIENTO DEL
EXTRACTO CRUDO
Centrifugacin diferencial para obtener fracciones subcelulares o para
aislar organelas especficas

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FRACCIONAMIENTO DEL
EXTRACTO CRUDO

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MTODOS
CROMATOGRFICOS PARA
SEPARACIN DE PROTENAS
Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga,
tamao o afinidad de las diferentes protenas.

Filtracin o exclusin molecular

Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa hidrofbica
Cromatografa de afinidad
FPLC (cromatografa lquida de separacin rpida de protenas)
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FILTRACIN EN GEL O
CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN
MOLECULAR

CROMATOGRAFA DE
INTERCAMBIO INICO

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MTODOS DE CUANTIFICACIN
DE PROTENAS
Absorcin a 280 nm: es proporcional a la concentracin de la protena.

Ensayos colorimtricos: el cambio de color en la solucin es cuantificado

mediante absorbancia. Son ms sensibles que la cuantificacin directa a
280 nm, pero involucran la adicin de una sustancia qumica que es
capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacdicos.

Anlisis de resultados: se interpolan las mediciones a una curva de

calibracin construida con una protena estndar de concentracin
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conocida como la albmina srica bovina (BSA).

MTODOS DE CUANTIFICACIN
DE PROTENAS

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MTODOS DE CUANTIFICACIN
DE PROTENAS
Ensayo de Bradford (595nm)
Es uno de los ms sensibles, rpido y muy sencillo y adems no presenta
interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el -mercaptoetanol,
que s interfieren con los ensayos de Lowry y BCA.
Desventaja: altamente sensible a detergentes y lpidos.

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MTODOS
ELECTROFORTICOS
PAGE nativa
SDS-PAGE
SDS-PAGE +
condiciones reductoras
Isoelectroenfoque
Electroforesis
bidimensional

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MTODOS
ELECTROFORTICOS
Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de las
protenas es un campo elctrico, y el gel acta como filtro
molecular, ralentizando la migracin de las protenas en funcin de
su relacin carga/masa.

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20

PAGE NATIVA VS. SDS-PAGE

Electroforesis en condiciones nativas: las protenas se separan en funcin
de su carga/masa.

En condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia

de un detergente aninico, el SDS (dodecilsulfato sdico), que se une a
todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de
micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS
enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que stas se
separan solo en funcin de su masa e independientemente de su carga.

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SDS-PAGE
Dodecilsulfato sdico: desnaturaliza a las protenas y se une a ellas en una
proporcin masa/masa constante (1.4 g SDS/g de protena).
Como resultado, las molculas de protena quedan completamente desplegadas y
recubiertas de una carga negativa uniforme, y por ello su movilidad electrofortica
es inversamente proporcional a su nmero de aminocidos.

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SDS-PAGE + CONDICIONES
REDUCTORAS
Agentes reductores

Compuestos qumicos capaces de reducir los enlaces disulfuro de las

protenas (-S-S-) a grupos sulfhidrilo (-SH).
Permiten desplegar completamente una protena y separar las
subunidades de una protena multimrica; ambos efectos son necesarios
para que la movilidad de la protena en una electroforesis SDS-PAGE sea
acorde con su masa molecular. Los ms habituales son el betamercaptoetanol, el ditiotreitol (DTT) y la urea.
El SDS desnaturaliza a las protenas en sus estructuras 2ria. y 3ria.,
mientras que los agentes reductores lo hacen en la 3ria. y la 4ria.23

ESTRUCTURAS DE LAS
PROTENAS

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PAGE NATIVA VS. SDS-PAGE +

CONDICIONES REDUCTORAS
La electroforesis con SDS en condiciones reductoras -adems de permitir
calcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas- nos indica las
distintas subunidades que posee la protena

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ELECTTROFORESIS
BIDIMENSIONAL
Es un proceso de separacin e identificacin de protenas en dos
dimensiones, orientando los frentes de corrida en ngulo recto uno de
otro
1) Las molculas primero son separadas por su carga o punto isoelctrico (pI)
por la tcnica de enfoque isoelctrico o IEF (Isoelectric Focusing).
2) Posteriormente, las protenas son separadas de acuerdo a su tamao o peso
molecular por electroforesis en SDS-PAGE.

Electroforesis en una dimensin: se puede resolver cerca de 50 bandas.

Electroforesis de dos dimensiones: permite resolver 2500 manchas de
polipptidos.
26

ISOELECTROENFOQUE

27

BIDIMENSIONAL

BIDIMENSIONAL

PREPARACIN DE GELES DE
POLIACRILAMIDA
La electroforesis de protenas es discontinua y desnaturalizante
Es discontinua porque est conformada por dos geles de poliacrilamida
(uno de empacamiento y otro de resolucin) que presentan diferente
concentracin, composicin y pH.
Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por una fase de
separacin visible a trasluz.
Debido a que en estado lquido ambos geles pueden mezclarse
fcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total
polimerizacin del primero para continuar con la polimerizacin del otro.
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PREPARACIN DE GELES DE
POLIACRILAMIDA
El gel de empacamiento, apilamiento o concentracin se localiza en la
parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarn
las muestras: posee baja concentracin de acrilamida (4%) en tampn
ligeramente cido (Tris/HCl 1M pH 6,8), de forma que ofrezca poca
resistencia a la mezcla de protenas sometidas a electroforesis; por eso
lo atraviesan con relativa rapidez.
El gel de resolucin o de separacin forma el cuerpo del gel por donde
migrarn y se separarn las protenas: debe tener mayor concentracin
de acrilamida (10% o ms) y pH ms bsico (8,3-8,8) de manera que
ofrezca mayor resistencia en la corrida a los polipptidos.
.
31

PREPARACIN DE GELES DE
POLIACRILAMIDA
.

Dato importante: la metilbisacrilamida es un

compuesto qumico neurotxico, mientras que la
poliacrilamida no lo es
32

SDS-PAGE

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SDS-PAGE
La electroforesis termina cuando
se haya producido la mxima
separacin de los componentes
de la muestra, pero sin sobrepasar
los lmites del gel.
Para evitar que se sobrepasen
estos lmites, se utilizan molculas
coloreadas con una movilidad
electrofortica superior a la de
cualquier componente de la
muestra (poseen elevada carga
respecto a su tamao).
Entre los ms utilizados se
encuentran la dinitrofenil-lisina
(DNP-Lys) y el azul de bromofenol.

SDS-PAGE
Marcadores moleculares: permiten determinar el peso
molecular de la cadena polipeptdica

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SDS-PAGE
Cuba de electroforesis con 4 geles sembrados y listos para correr
Electrodo
s

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SDS-PAGE
Comienzo de la corrida electrofortica

Burbujeo
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TINCIN CON COMASSIE BLUE

No se sabe a ciencia cierta cul es el mecanismo de adhesin a las protenas de
este colorante, pero se especula que se puede unir al grupo amino o bien que
reconoce y se une a los siguientes aminocidos:

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TINCIN CON COMASSIE BLUE

1

10

BSA
(Seroalbmi
na bovina.
66,00 kDa)
Protena a
cuantificar:
Eg95 ( 37,40
kDa)

Patrn del marker

Kaleidoscope prestained
standards de BIO-RAD

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WESTERN BLOT
*Es la transferencia de las protenas a una membrana*
Finalizada la PAGE, se puede obtener informacin acerca de las protenas si stas se
transfieren desde el gel a una membrana.

El proceso de transferencia se denomina blotting y fue originariamente descripto

por E. M. Southern para el ADN (Southern blot); posteriormente y continuando con la
misma terminologa, se describi para el caso del ARN y las protenas (Northern y
Western blot respectivamente).

Una vez en la membrana, las protenas estn accesibles a diferencia de en el gelpara interaccionar con otras molculas que permitan su identificacin; en la mayora
de los casos, estas molculas son anticuerpos y el proceso se conoce como
immunoblotting, pero tambin pueden ser lecitinas, cidos nucleicos, receptores o
cualquier otro ligando.

WESTERN BLOT

Membrana de nitrocelulosa:
posee una buena
capacidad de unin de
protenas (250g/cm2), que
quedan unidas a la
membrana de forma no
covalente mediante
interacciones electrostticas
e hidrofbicas.

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WESTERN BLOT

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REVELADO
Membrana transferida y teida reversiblemente con rojo ponceau

Muestras

Estndar

Marker

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REVELADO

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REVELADO
Mtodo indirecto de deteccin: el anticuerpo primario sin marcar
reacciona con el antgeno. Luego, un anticuerpo secundario
marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.

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REVELADO
Placas radiogrficas: confirman la identidad de la protena de inters

La presencia de bandas indica inequvocamente -por medio del pegado del

anticuerpo especfico- que la protena sembrada es la de inters. Si el
anticuerpo 1rio. no se pega, el 2rio. tampoco y no hay revelado (es decir, no
se impresiona la placa)
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