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DETERMINACIN POR MEDIOS INSTRUMENTALES DEL PERFIL

CROMATOGRFICO Y LA COMPOSICIN MSICA DEL VENENO DE LA AVISPA


SOLITARIA Pepsis sp. Y SU RELACIN CON LOS PPTIDOS REPORTADOS
PARA OTRAS ESPECIES DE AVISPAS DEL FAMILIA POMPILIDAE

FRANKLIM ALAN GONZLEZ VILA


DUBERNEY PEZ RINCN

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS


FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGA
BOGOT D.C.
2015

DETERMINACIN POR MEDIOS INSTRUMENTALES DEL PERFIL


CROMATOGRFICO Y LA COMPOSICIN MSICA DEL VENENO DE LA AVISPA
SOLITARIA Pepsis sp. Y SU RELACIN CON LOS PPTIDOS REPORTADOS
PARA OTRAS ESPECIES DE AVISPAS DEL FAMILIA POMPILIDAE

FRANKLIM ALAN GONZLEZ VILA


DUBERNEY PEZ RINCN

Proyecto de Trabajo de Grado para optar al ttulo de Licenciados en Biologa

Director
Dr. Sc. JULIO CESAR CALVO
Director del Grupo de investigacin Proteoma Universidad Distrital

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS


FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGA
BOGOT D.C.
2015

NOTA DE ACEPTACIN
Director
___________________________
Jurado
___________________________
Jurado
___________________________

La universidad no se hace responsable de las ideas, ni el contenido del presente


trabajo, debido a que estas hacen parte nica y exclusivamente de sus autores

Capitulo XV, articulo 117, Acuerdo n 29 de 1988 del Consejo Superior de la


Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas.

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por brindarnos la fortaleza necesaria para afrontar las dificultades presentadas
en el camino.
A Nuestro Director de tesis el Doctor Julio Cesar Calvo Mozo, por el apoyo
incondicional durante esta investigacin.
Al profesor lvaro Granados, por su colaboracin.
Al grupo de extractos marinos de la Universidad Nacional de Colombia, especialmente
a Sandra Martnez.
Al profesor Cesar Segura, por sus enseanzas y su hospitalidad.
A todos aquellos que supieron brindar una palabra de aliento, de motivacin y de
esperanza en los momentos ms difciles.

DEDICATORIA

A mis padres: Flix Pez Manrique y Lucila Rincn Chacn, a quienes agradezco
infinitamente por brindarme la vida, todo el apoyo, cario y confianza necesarios para
poder soar y cumplir todas mis metas.
A mis hermanas, por respaldarme en todos y cada uno de los momentos difciles.
A mi sobrino, de quien espero mucho.
A Cristhel Moreno, por los momentos compartidos y sus palabras de aliento.

A mis padres Gonzalo Gonzlez y Mara Odalinda vila, a quienes les estoy
inmensamente agradecido por su apoyo incondicional para poder seguir adelante con la
realizacin de mis proyectos.
A Jessica, por su Amor incondicional.
A mi Hermano Gonzalo Gonzlez y a mi Hermana Cristina Gonzlez, por alentarme a
seguir adelante.
A Felipe Martnez Camacho, por brindarnos una sincera amistad.

CONTENIDO

Pg.

RESUMEN

14

INTRODUCCIN

15

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

17

2. JUSTIFICACIN

18

3. PREGUNTA PROBLEMA

19

4. OBJETIVOS

20

4.1. Objetivo general

20

4.2. Objetivos especficos

20

5. MARCO TERICO

21

5.1. Generalidades Avispas.

21

5.2. Pomplidos.

21

5.2.1. Pepsis sp.

23

5.3. Veneno de Vspidos.

24

5.3.1. Composicin Qumica.

24

5.3.2. Composicin Peptdica.

24

5.3.3. Pptidos reportados en Avispas.

26

5.3.3.1. Pptidos de avispas solitarias.

26

5.4. Tcnica de separacin pptidos.

28

5.4.1. HPLC-RP.

28

5.4.1.1. Columna RP-18.

28

5.5. Tcnicas para identificacin pptidos.

28

5.5.1. Espectrometra de Masas (MS).

28

5.5.1.1. Funcionabilidad MS.

29

5.5.1.2. Ionizacin por electronebulizacin (ESI/MS).

29

5.6. Tipos de analizador de masa.

30

5.6.1. Analizador de trampa de iones IT-MS, ion-trap MS o ITD.

30

5.7. Cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas LC/EM.

30

5.7.1. Sistemas de acople nano-ESI Chip-HPLC-MS/MS.

31

6. MATERIALES Y MTODOS.

32

6.1. Obtencin del material biolgico.

32

6.1.1. Caracterizacin de la zona de colecta.

32

6.1.2. Identificacin de los individuos.

32

6.1.3. Captura de especmenes.

33

6.1.4. Extraccin y conservacin de los sacos de veneno.

35

6.2. Preparacin de las muestras.

35

6.3 Anlisis por HPCL-RP.

35

6.4. Anlisis LC/MS-MS.

36

6.5. Obtencin de Datos.

37

6.5.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas.

37

6.5.2. Relacin masas Obtenidas Masas no reportadas.

37

6.6. Masas obtenidas relacionadas con los pptidos reportados


para la familia Pompilidae.

37

7. RESULTADOS.

38

7.1. Anlisis HPLC en Fase reversa.

38

7.2. Anlisis LC/MS-MS.

39

7.3. Anlisis de Datos.

41

7.3.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas.

41

7.4. Anlisis Espectros de masas.

43

7.5. Masas encontradas no registradas en Bases de Datos.

46

7.6. Relacin pesos moleculares y pptidos reportados para Familia


Pompilidae.

46

8. DISCUSIN.

48

9. CONCLUSIONES.

53

10. SUGERENCIAS.

54

BIBLIOGRAFA.
ANEXO 1. Compuestos del anlisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house
versin 5.3. Avispa - Pesis sp.
ANEXO 2. Base de datos pptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROPMoscow)
ANEXO 3. Tiempos de Retencion de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos.

GLOSARIO

ACN: Acetonitrilo.
CI: Fuentes de ionizacin qumica.
CL/EM: Cromatografa lquida-espectrometra de masas.
DA: Dalton.
EI: Impacto de electrones.
EM: Espectrometra masa.
ESI: Ionizacin Electrospray.
ESI/MS: Ionizacin por electro nebulizacin.
FAB: Iones rpidos bombardeo.
FD: Fuentes de desorcin por campo.
FI: Fuentes de ionizacin por campo.
HPLC: Cromatografa liquida de alta resolucin.
ION TRAP: Trampa iones.
IT-MS: Analizador de trampa de iones.
KV: Kilo Voltios.
LC/MS-MS: Cromatografa liquida acoplada a masas en tndem.
MALDI: Desorcin lser asistida por matriz.
M/Z: Masa Carga.
NIST: Instituto Nacional de Estndares y Tecnologa
PAM: Pptidos Anti Microbianos
PD: Desorcin por plasma.
PMTX: Pompilotoxina
RP: Fase reversa.
SIU: Centro de investigaciones universitaria.

TFA: Acido trifloro actico.


TOF: Analizador de tiempo de vuelo.
TS: Ionizacin por termo nebulizacin.
UNAL: Universidad Nacional de Colombia
Ul: Microlitros
UV-VIS: Espectroscopia visible Ultravioleta o en ingles Ultravioletvisible
spectroscopy

NDICE DE TABLAS

Pg.

Tabla 1: Pptidos aislados de venenos de Avispas Solitarias

26

Tabla 2: Gradiente Utilizado en la HPLC

38

Tabla 3: Gradiente empleado en el anlisis de LC/MS-MS

39

Tabla 4: Masa Observada Vs Masa Reportada (Compuestos Obtenidos


de BD Uniprot y EROP-Moscow.

42

Tabla 5: Pptidos Reportados para Pompilidos.

46

NDICE DE FIGURAS

Pg.

Figura 1: Avispa halcn cazando.

22

Figura 2: Theraphosidae Hembra.

22

Figura 3: Venacin Sub marginales y marginales.

32

Figura 4: Pepsis Sp. Posicin placas Subgenitales.

33

Figura 5: Zona de observacin A. Zona de observacin B.

34

Figura 6: Hembra Pepsis sp, Vista Dorsal, cuerpo completo

34

Figura 7: Espectrmetro de masas Agilent SL 6300 con fuente de


ionizacin nano Hplc chip- cube.

36

Figura 8: Hplc Agilent 1200 equipada por bomba de nanoflujo.

36

Figura 9: Nano Chip 150mm Agilent.

36

Figura 10: Perfil cromatogrfico obtenido en el anlisis.

39

Figura 11: Perfil obtenido con concentracin de TFA de 0.1%.

39

Figura 12: Cromatograma de masas completo y total tiempo corrida.

40

Figura 13: Cromatograma obtenido en el anlisis de LC/MS-MS.

40

Figura 14: Espectro de masas 1153.9 Da. Masa Observada.


Compuesto 103 Tiempo de retencin 67.8 min.

43

Figura 15: Espectro de masas 1240.2 Da. Masa Observada.


Compuesto 142 Tiempo de retencin 86.7 min.

43

Figura 16: Espectro de masas 1243.7 Da. Masa Observada.


Compuesto 144 Tiempo de retencin 88.0 min.

44

Figura 17: Espectro de masas 1359.3 Da. Masa Observada.


Compuesto 175 Tiempo de retencin 99.5 min.

44

Figura 18: Espectro de masas 1386.1 Da. Masa Observada.


Compuesto 181 Tiempo de retencin 102.4 min.

45

Figura 19: Espectro de masas 1623.2Da. Masa Observada.


Compuesto 216 Tiempo de retencin 109.5 min.

45

RESUMEN

El estudio del contenido peptdico del veneno de los himenpteros ha cobrado una
gran relevancia en las ltimas dcadas, se ha demostrado que dentro de dichos
complejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen una actividad
biolgica importante; la gran mayora de investigaciones en el campo de la
bioqumica han mostrado que se puede reconocer un nmero importante de
sustancias activas entre las cuales se encuentran toxinas, antimicrobianos y
depresores del sistema nervioso.

La gran mayora de investigaciones se han centrado en la caracterizacin y


purificacin de uno o un grupo de pptidos de actividad biolgica especfica, pero
an se desconoce la complejidad desde el punto de vista de la composicin de
estos venenos. Por esta razn, se realiz una investigacin del veneno de la avispa
solitaria Pepsis sp. con el fin de determinar el perfil cromatogrfico, la composicin
msica de los compuestos presentes en el veneno de la avispa solitaria e identificar
si hay alguna relacin de estas masas con pptidos que ya hayan sido reportados
para la familia Pompilidae.

En esta investigacin se colectaron y liofilizaron 11 sacos de veneno de hembras de


la especie Pepsis sp., los liofilizados fueron preparados y posteriormente analizados
por el mtodo de cromatografa lquida en fase reversa ejecutado en la sede de
postgrados de qumica de la Universidad Nacional de Colombia (UNAL), se
determinaron los parmetros generales para el anlisis por cromatografa lquida
acoplada a espectrometra de masas LC/MS-MS, el cual se realiz en la ciudad de
Medelln en el laboratorio de cromatografa lquida y espectrometra del SIU de la
Universidad de Antioquia con un equipo Agilent Nanochip cube y un espectrmetro
de masas de fuente Nano-ESI-ion trap.
Como resultados se pudo establecer una relacin entre el perfil cromatogrfico y
los pesos moleculares de 6 sustancias con pptidos reportados para venenos de
avispas en las bases de datos Uniprot.org y Erop- Moscow con una diferencia peso
a peso de menos de 0.4 Da. Los cuales correspondieron a grupos de Quininas,
antimicrobianos y un pptido de funcin potenciadora de la contraccin del musculo
liso . Entre los que se destacan fulvonina y Anoplina, los cuales son pptidos
reportados para la familia Pompilidae a la cual pertenece Pepsis sp. Estos pptidos
poseen caractersticas antimicrobianas (Dos Santos Cabrera et al., 2008) y
bloqueadoras de los receptores nicotnicos (Kinoshita et al., 2001) respectivamente.
De igual manera se registraron un gran nmero de pesos moleculares que oscilan
entre 1000 y 3000 Da. Los cuales no registran reportes en bases de datos para este
tipo de individuos. Lo cual nos hace inferir que este tipo de venenos constituye una
mezcla bastante compleja desde el punto de vista peptdico, lo que abre camino a
futuras investigaciones que permitan su caracterizacin.

14

INTRODUCCIN

El anlisis de los pptidos presentes en el veneno de los animales, sin duda ha sido
un gran campo para el desarrollo de tcnicas qumicas instrumentales en las cuales
se ha invertido mucho esfuerzo y dinero para realizar investigacin en bsqueda de
sustancias que por su actividad biolgica especifica puedan dar una utilidad al
hombre; inicialmente los estudios de composicin qumica de los venenos de
animales se centraban en la identificacin de las toxinas que contenan, para poder
reconocerlas y minimizar sus efectos; sin embargo, en esta bsqueda poco a poco
el hombre fue encontrando que adems de estas sustancias txicas, los venenos
eran ricos en diversos compuestos de actividad biolgica diversa. Es por ello que
en las ltimas dcadas se aumentan de manera estrepitosa los hallazgos de
pptidos con caractersticas interesantes desde el punto de vista mdico y
farmacolgico (Palma, 2006).

Una de las lneas de investigacin ms grande en esta materia, sin duda ha sido la
bsqueda de antimicrobianos, los cuales tienen una gran aplicabilidad
farmacolgica. Estos pptidos antimicrobianos se encuentran en todos los grupos
animales incluyendo a los humanos (Kastin, 2006), individuos como artrpodos e
insectos al no presentar sistemas inmunolgicos definidos, se caracterizan por
poseer una elevada cantidad de estos pptidos antimicrobianos de origen natural
(Cuadrado Cano, 2012; K. Konno et al., 2001; K. Konno et al., 2006; M. A. Mendes,
de Souza, & Palma, 2005; Montao-Prez & Vargas-Albores, 2002). Estos pptidos
en todos los insectos una vez fabricados son expresados en su cuerpo graso y son
repartidos a diversas zonas de su anatoma para protegerlos de ataques
bacterianos y de otros individuos (hongos, protozoos) (Raa, 1996).

El estudio del contenido peptdico del veneno de los himenpteros (abejas avispas y
hormigas), ha cobrado una gran relevancia en los ltimos aos; se ha demostrado
que dentro de dichos complejos se pueden identificar diversas sustancias que tienen
una actividad biolgica importante, principalmente sustancias con funcin
antimicrobiana (Monteiro, Romao, & Soares, 2009).

Las avispas solitarias han sido un grupo de individuos ampliamente analizado, tanto
en la bsqueda de pptidos con actividad biolgica como en potentes neurotoxinas.
Inicialmente se enfocaron las investigaciones en encontrar las sustancias del
veneno que eran capaces de paralizar por un tiempo extenso a las presas y se pudo
determinar que para la familia Pompilidae las sustancias responsables eran dos
toxinas las cuales se describieron como Pompilotoxina alfa y beta (Katsuhiro
Konno et al., 2000). Por otro lado, los estudios de purificacin por HPLC-RP
permitieron identificar pptidos antimicrobianos en familias como Scolidae,
Eumeninae, Polistinae y Pompilidae (Santos LD, 2011); la importancia de estos
pptidos antimicrobianos hallados radica en que han mostrado menor actividad de
hemolisis de eritrocitos en los estudios realizados en ratas. Dentro del grupo de los
insectos los pptidos antimicrobianos ms comunes son la Cabrolina y el
Mastoparn puesto que presentan un amplio espectro de accin frente a cientos de
15

cepas bacterianas; sin embargo, su actividad hemoltica era muy alta (K. Konno et
al., 2001) (K. Konno et al., 2006) logr demostrar que la Anoplina y Eumenitina
aisladas de avispas solitarias tienen una actividad de lisis de los eritrocitos mucho
menor e incluso Anoplina y Eumenitina mostraron una alta efectividad frente a
promastigotes de Leshmania (K. Konno et al., 2001) y Plasmodium sp. (Carter et al.,
2013).

Cabe resaltar que el veneno de las avispas solitarias es un gran complejo peptdico,
el cual posee actividades que permiten evitar que la presa de la avispa sea
colonizada por una gran variedad de bacterias y hongos, tambin se indica que
genera un aumento de la permeabilidad celular sin inducir la muerte celular a bajas
concentraciones y como conservantes a largo plazo de la presa, (Ji Hyeong Baek,
Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011). Pptidos especficos como el Eumenitina de la avispa
eumenine puede desempear un papel en prevencin de la infeccin potencial por
microorganismos durante el consumo de presas por sus larvas (K. Konno et al.,
2006), investigaciones han demostrado que otros pptidos pueden conducir a
cambios de comportamiento de las presas como es el caso de la Avispa Ampulex
Compressa (Libersat, 2003). Hasta el momento la caracterizacin y purificacin de
pptidos de actividad biolgica especfica en diferentes individuos se desconoce, a
ciencia cierta el nmero de pptidos que estn presentes en el veneno de las
avispas solitarias en especial las pertenecientes a la familia Pompilidae (Yashad,
Dhananjaya, Rakesh Kumar, & Gopi, 2014).

Gracias a la amplia gama de publicaciones realizadas en diversas especies de


avispas solitarias de todo el mundo podremos establecer relacin entre sustancias
reportadas anteriormente y los pptidos que se puedan identificar por medio del
anlisis del veneno por cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas
LC/MS-MS. Con el fin de observar si existen pptidos que tengan masas
moleculares similares a los pptidos reportados para este tipo de insectos y de esta
manera establecer por anlisis comparativo qu tipo de pptidos presenta esta
avispa y qu relacin existe entre esta composicin especfica y la de otros
individuos.

16

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El veneno de los Pomplidos es una fuente rica de pptidos con variadas actividades
biolgicas, debido a la naturaleza y al uso que la avispa le da al momento de la caza
(Coello 2000; K. Konno et al., 2001). Las investigaciones sobre el contenido
peptdico del veneno de este tipo avispas se ha centrado en la identificacin de uno
o un grupo de pptidos para cada especie; Se han aislado antimicrobianos,
citotxinas, miotxinas, entre otros (Ji Hyeong Baek et al., 2011). Estos estudios han
permitido aportar en la construccin de conocimiento y bsqueda de nuevas
alternativas de defensa biolgica frente al ataque de nuevos organismos patgenos;
sin embargo, se desconoce la complejidad desde el punto de vista peptdico que
puedan presentar estos venenos, puesto que en nuestro pas no existen estudios
que determinen el grupo de sustancias que los compone.

La avispa solitaria Pepsis sp. es un Pomplido comn en Colombia, en trminos


generales de dieta, comportamiento y hbitos de caza es muy similar a los
individuos estudiados en otros pases. Por tanto se espera encontrar una amplia
variedad de compuestos peptdicos en la investigacin de su veneno.

17

2. JUSTIFICACIN

Las avisas solitarias comprenden un grupo de individuos de hbitos especiales y


caractersticas biolgicas muy particulares, las hembras poseen un veneno que
usan nicamente con fines reproductivos, el cual principalmente est compuesto por
sustancias de alto inters biolgico como pptidos antimicrobianos, quininas,
citotxinas, miotoxinas, entre otras. En las ltimas dcadas se ha abordado el
estudio de la composicin peptdica con el inters de identificar pptidos que
puedan generar alguna utilidad al ser humano. Producto de estas investigaciones se
han logrado purificar sustancias con accin antibactericida y antifngica; sin
embargo, en Colombia no existen estudios que aborden la composicin del veneno
de los individuos de la familia Pompilidae. Resulta importante desarrollar esta
investigacin, puesto que aporta al conocimiento de los mecanismos de accin que
tiene el veneno y da un punto de partida para el desarrollo de nuevas
investigaciones en esta materia.

Al realizar una revisin exhaustiva de las investigaciones que se le han realizado al


veneno de Avispas se describen pptidos antimicrobianos para las distintas
especies de avispas como componente abundante en sus venenos. Por tanto el
desarrollo de investigaciones en diversas especies colombianas puede
desencadenar en la obtencin de nuevos pptidos con funcin antimicrobiana, que
no solo presenten la misma o una mayor actividad frente a los microorganismos, si
no que tengan un impacto mnimo en la lisis de eritrocitos; si bien, los pptidos
aislados de venenos de avispas solitarias actualmente no se pueden utilizar
directamente en seres humanos en pases como Espaa y Estados Unidos se
investiga su accin biolgica frente enfermedades como la leishmaniasis o el cncer
(Moreno, Zurita, & Giralt, 2014).

18

3. PREGUNTA PROBLEMA

En Colombia la avispa Pepsis sp. est ampliamente distribuida; sin embargo, no


existe una investigacin en torno a la composicin de su veneno, de acuerdo a
estos planteamientos surge la siguiente pregunta:

Qu tan complejo es el veneno de la avispa solitaria Pepsis sp. respecto a su


composicin peptdica?

19

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general.

Establecer el perfil cromatogrfico y la composicin msica de los


compuestos peptdicos presentes en el veneno de la Avispa Solitaria Pepsis sp.

4.2. Objetivos especficos.

Realizar un anlisis cromatogrfico del veneno de la avispa solitaria Pepsis


sp.

Obtener el registro de las masas moleculares entre 1000 y 3000 Da de los


compuestos presentes en el extracto de veneno.

Comparar las masas moleculares identificadas con los pptidos reportados


para otras especies de avispas.

20

5. MARCO TERICO

5.1. Generalidades Avispas.

Las avispas son insectos pertenecientes al grupo monofiletico de los Aculeata, el


cual agrupa a los himenpteros que tienen el ovopositor transformado en un aguijn
ponzooso. Las avispas comprenden un grupo extenso de individuos sociales o
solitarios. Existe mucha variacin entre las diversas especies de avispas pero en
general su morfologa se constituye por cabeza, trax y abdomen, protegidos por un
exoesqueleto duro poseen ojos u ocelos que les dan capacidad de diferenciar
luminosidad y oscuridad (Storer, 1980). Poseen 2 pares de alas, 1 par grande y otro
par posterior ms pequeo, unidos por una serie de ganchos llamados frenillos. Las
hembras de algunas especies estn desprovistas de alas. Sus antenas estn
formadas por una serie de segmentos denominados escapo, pedicelo y flagelo.
Tambin cuentan con piezas dentales con las que pueden morder, el cuerpo en
algunas especies est cubierto de pelillos. (de la Fuente, 1994).

5.2. Pomplidos.

La familia Pompilidae comprende avispas solitarias depredadoras de tamao


pequeo a grande con aproximadamente 5000 especies en ms de 230 gneros
alrededor del mundo (Cambra-Torok, Quintero-Arias, & Miranda, 2004). Este tipo de
avispas presentan hbitos crepusculares y nocturnos. Los Pomplidos son un grupo
avanzado de aculeados que presenta una avanzada estenofagia centrada en las
araas. Con una relacin intraespecfica de predoparasitismo. Este grupo de
Avispas es interesante debido a que toman su presa la inmovilizan y aguijonean su
cuerpo hasta provocar la paralizacin a causa un poderoso veneno. La presa es
llevada a una madriguera donde se introducir un huevo en su interior el cual
crecer a expensas de la vida de la araa (Coello 2000).

Una de las tcnicas de caza de este tipo de avispas es dar saltos cortos y carreras
rpidas en el piso haciendo vibrar sus antenas, logrando con esto un avanzada
exploracin del terreno y posteriormente la atencin de la araa. Tomndola por la
base de la coxa, plegara su abdomen ventralmente y as podr aguijonear a su
presa. En este momento empieza el desarrollo de una nueva avispa por medio de
una ovoposicin in-situ. Paralizada y vencida la araa es alimento de la nueva larva
que nacer poco tiempo despus. El transporte de la presa puede ocurrir a un sitio
determinado o la madriguera del Pompilido, para facilitar el transporte la avispa
amputa las patas de la araa en un comportamiento singular (Coello 2000). Estas
avispas tienen prevalencia por las araas del tipo Theraphosidae las cuales
posteriormente son sepultadas y abandonadas por la avispa. Un claro ejemplo de la
caza de la avispa se muestra en la siguiente imagen (Ver Figura 1).

21

Figura 1: Avispa halcn cazando. (Kishinami, 2011) Tarantula Hawk [fotografa].


Recuperado de https://www.flickr.com/photos/kishlc/8021687451/
En casos particulares por ejemplo las avispas de la familia Sphecidae, aprovisionan
las larvas con mltiples presas para que estas puedan ser consumidas. Caso
contrario de los Pomplidos que tienen preferencia de ovopositar en araas macho
(Prez-Miles, Oca, Postiglioni, & Costa, 2005), confirindoles prioridad de
supervivencia a las araas hembras (Ver Figura 2), las cuales son las encargadas
de ovoposiciones de generaciones futuras.

Figura 2: Theraphosidae Hembra. (Hedin, 2009) Theraphosidae [fotografa].


Recuperado de http://www.flickr.com/photos/23660854@N07/3405613471/
Su ciclo de vida se caracteriza por un comportamiento sereno y cumplimiento
estricto de las funciones vitales, son individuos tranquilos, nectivoros y solitarios,
cuando se aproxima la necesidad de reproducirse todo cambia; la hembra caza y
parasita la araa y a continuacin sepulta o empareda. La araa puede recuperar
parte de su movilidad si es picada por el veneno de algunas especies como P.
22

cinereus (Cambra-Torok et al., 2004). Tres das ms tarde del parasitismo nace la
larva, perfora el tegumento y comienza a depredar el interior de la araa, mientras la
larva crece la araa se debilita y posteriormente muere, es aqu donde los pptidos
antimicrobianos surten un efecto de preservacin de la presa en va de
descomposicin (Konno et al., 2006). La pupacin se produce al interior de la
cmara en un capullo sedoso. La mayora de las especies pasa el invierno como
larva (Cambra-Torok et al., 2004); sin embargo, Anoplius viaticus lo pasa como
adulto, algunas especies poseen una sola generacin anual mientras otras pueden
tener mltiples generaciones al ao siendo multivoltinas frecuentemente se solapan
unas con otras (Coello 2000). Esta caracterstica particular de pasar de un estado
nectarvoro a predador y de larva carnvora a adulto nectarvoro posiblemente
influir en la variacin de pptidos representativos de cada individuo, sin dejar de
lado la familia y especie especfica a la cual pertenece el individuo, el tipo de
alimentacin y la posicin geogrfica donde se encuentran distribuidas, adems de
la variacin de los venenos segn el tipo de presas que depredan (Ji Hyeong Baek,
Ji, Shin, Lee, & Lee, 2011; Copperi, Pompozzi, Barneche, & Ferretti, 2011).

En cuanto a la copula, dura unos pocos segundos pasando los espermatozoides al


espermateca de la hembra, donde son almacenados y utilizados por ella a voluntad.
Una caracterstica singular es la que ocurre con Evagetes lapeletier, y Ceropales
latreille, el cual localiza los nidos de las araas parasitadas, los excava devora la
larva puesta por el otro Pompilidae y deposita su propio huevo, sella o lapida de
nuevo y abandona la cmara nuevamente; esto es considerado un
cleptoparasitismo, en cuanto a Ceropales, intercepta a la hembra Pompilidae le
quita su presa y ovoposita en frete de ella, despus deja que esta culmine su
trabajo, la larva del cleptoparasito nacer ms pronto y devorara su competidor
(Coello 2000; Copperi et al., 2011).

Pomplidos de argentina especficamente Pepsis aciculata y Notocyphus sp.


encuentran simpatria con tarntulas vachoni y P. longisternal (Costa, Prez-Miles &
Mignone, 2004). Pepsis aciculata introduce un huevo aproximado en tamao de 3,9
mm, a los dos das obtiene un tamao aproximado de 5,8 mm y a los 7 das alcanza
un tamao de 13,5 mm. Esto contempla un ejemplo del desarrollo de la larva con
respecto a una tasa de tamao versus tiempo (Costa et al., 2004) (Copperi et al.,
2011).

5.2.1. Pepsis sp.

El gnero Pepsis Comprende un amplio grupo de avispas cazadoras de araas, su


distribucin es cosmopolita con presencia en el Sudeste de Asia, frica, Australia y
Amrica (Fernndez F, 2006). Son avispas caza tarntulas que comnmente son
llamadas avispas halcn, se estima que en Suramrica existen cerca de 250
especies descritas (Vardy, 2002). Dentro de este gnero hay variabilidad de
tamaos y coloraciones. Todas estas especies conservan los hbitos reproductivos
de la familia Pompilidae aunque se desconocen muchos aspectos en cuanto la
anidacin o el desarrollo larval de estos individuos (Fernndez F, 2006). En norte y
23

centro Amrica especficamente en las zonas desrticas la abundancia de estos


individuos es alta y se han descrito comportamientos de dos especies (Pepsis
Formosa y Pepsis thisbe). La picadura de la especie Pepsis Formosa es
considerada como la segunda picadura ms dolorosa dentro de todos los artrpodos
registrando 9.5 puntos en el ndice de dolor de Shmith, superada nicamente por la
hormiga bala. A pesar de la reputacin de sus hbitos, las avispas del gnero
Pepsis sp. son individuos tranquilos que muy rara vez atacan a los seres humanos.
En Suramrica y en general el neotrpico se carece de claves que puedan permitir
su identificacin certera a nivel de especies (Fernndez 2006).

5.3. Veneno de Vspidos.

5.3.1. Composicin Qumica.

El veneno de los Himenpteros tiene caractersticas especiales en cuanto a su


composicin qumica, las avispas y abejas se constituyen como los principales
organismos objeto de estudios y de investigaciones, los cientficos se han enfocado
principalmente en el aprovechamiento de los pptidos que tienen actividad
antimicrobiana aunque los venenos de estas avispas tambin contienen
neurotxinas, algunos compuestos alrgenos y protenas que podran tambin
tener propiedades farmacolgicas.

En la literatura se reportan cerca de 2000 investigaciones que se dirigen al


aprovechamiento de pptidos y protenas del veneno de los Himenpteros (Santos
LD, 2011). En el caso de las avispas el campo investigacin se centra en los
pptidos catinicos de bajo peso molecular, la gran mayora de compuestos
aislados y purificados han sido extrados de avispas de hbitos sociales y solitarios.
Se estima que uno de los pptidos mejor aislado y reportado de estos insectos es la
Anoplina el cual posee propiedades antimicrobianas y un amplio rango de accin
frente a colonias de bacterias Gram + y Gram - (Konno et al., 2001). A partir de este
estudio se ampliaron las perspectivas en torno a esta lnea de investigacin
permitiendo identificar pptidos que tienen una conformacin estructural similar a la
Anoplina y debido a que muchos de ellos se han evaluado con el fin de establecer la
actividad hemoltica, se ha podido determinar que el mecanismo de accin muy
similar.

5.3.2. Composicin Peptdica.

Los componentes peptdicos de los venenos de himenpteros se distribuyen en el


rango de masa molar de 1400 a 7000 Da y juntos comprenden hasta el 70% del
peso total de los venenos liofilizados (Santos LD, 2011). La mayora de estas
toxinas son pptidos lineales policatinicos anfipticos con un alto contenido de alfa
hlices en sus estructuras secundarias (Albericio & Barany, 1984; Kastin, 2006;
Konno et al., 2007; Picolo et al., 2010; Zelezetsky & Tossi, 2006), los venenos de
24

himenpteros tambin puede contener compuestos como las neurotoxinas las


cuales accionan en los canales de Na + y/o Ca +2, o incluso en el receptor
nicotnico de ACh. Las avispas solitarias utilizan sus venenos para la captura de
presas en las cuales inyectan la Pompilotoxina A y B paralizando las araas u
otros insectos. Los pptidos miotoxicos, citotxicos y antimicrobianos del veneno de
la avispa, conservan el cuerpo de la araa para que este sea consumida por sus
larvas (Ji Hyeong Baek et al., 2011; Coello 2000). Por lo tanto, el veneno de las
avispas solitarias contiene un rico material biolgico con el que se pueden estudiar
variados productos de inters farmacolgicos y cientfico para combatir sin nmero
de bacterias Gram + y Gram - (Zalat SM, Nabil Z, A, & M, bradicinina,1999).

Los venenos de avispas solitarias pueden contener una variedad de bioactivos


(Kinoshita et al., 2001), adems la Bradiquinina y pptidos relacionados con cininas
neurotxicas reportadas en el veneno de las Avispas, como la TreoninaBradiquinina (Thr6- BK) y megascoliaquinina (Thr6-BK-Lys-Ala), aislado a partir del
veneno de la avispa europea Scolide Megascolia lavifrons, Thr6-BK tambin se
inform en el Veneno de la avispa Colpa interrupta. Un anlisis con los extractos de
veneno de 27 especies de las avispas de las familias, Pompilidae, Eumnide y
Scoliidae; mediante MALDI-TOF MS como la herramienta experimental, demostr
que pptidos BK-relacionados estn presentes en cuatro de estas especies, con
Thr6-BK como el componente principal en el veneno de Megacampsomeris
prismtica (Palma, 2006).

Desde hace aproximadamente tres dcadas se ha demostrado por medio de


estudios, que los venenos de las avispas solitarias contienen pptidos con una alta
capacidad similar a los antimicrobianos (Kastin, 2006). Un novedoso pptido
denominado Anoplin se aisl en el veneno de la avispa solitaria del gnero Anoplius
samariensis cuya secuencia de aminocidos es GLLKRIKTLL-NH2; es un
decapptido ampliamente activo contra bacterias Gram + y Gram - (Dos Santos
Cabrera et al., 2008; Konno et al., 2001), presentando una actividad hemoltica
hacia eritrocitos humanos ms baja que el Mastoparn, de all su importancia. Este
pptido fue sintetizado y purificado; el primer ensayo con seres vivos fue realizado
por Konno en el 2001 en ratas, mostrando una eficacia muy amplia como el
Mastoparn X., a partir de all Konno en el 2006 realiz estudios en otros individuos
Eumenes sp. Encontrando un nuevo pptido que denomin Eumetinina. Estudios
realizados en la ltima dcada en otras especies de avispa se encontraron cerca de
4 nuevos pptidos que presentan caractersticas de estructuras alfa helicoidales que
tienen accin bactericida (Konno et al., 2006; M. A. Mendes, de Souza, & Palma,
2005), en el 2005 descubrieron dos anlogos del Mastoparn y el Protonectin en el
veneno de Orancistrocerus drewseni drewsenii corroborando que dentro de esta
familia de avispas solitarias y especficamente en su veneno, existe una gran
cantidad de pptidos que tienen como caracterstica una estructura alfa helicoidal.
Estos pptidos alfa-helicoidales se encuentran entre los amtimicrobianos ms
abundantes y generalizados en la naturaleza, y parecen representar una disposicin
estructural particularmente exitosa en la defensa innata contra microorganismos;
ellos tienden a ser cortos (menos de 40 residuos de aminocidos) tienen estructuras
relativamente simples y son fciles de hacer por sntesis qumica, por lo que los
pptidos de este tipo tanto natural como sintticos, han sido objeto de numerosos
25

estudios en cuanto a su estructura o actividad (Won, Pripotnev, Ruscito, & Ianoul,


2011). Antimicrobianos bastante potentes y de amplio espectro, activos contra una
amplia gama de patgenos, incluyendo bacterias promastigotes de lesmania y
variedad de cepas de bacterias resistentes a antibiticos, as como tambin una
excelente opcin frente al aniquilamiento de hongos y protozoos.

5.3.3. Pptidos reportados en Avispas.

Gracias a los avances tecnolgicos y la perspectiva de la investigacin de los


pptidos presentes en venenos de avispas solitarias a lo largo del mundo se
empezaron a estudiar con el fin de dar respuestas a diferentes preguntas en cuanto
a su composicin y actividad benfica para el ser humano. Desde que se report el
primer pptido extrado del veneno de avispas solitarias con efectos antimicrobianos
hasta la fecha se demuestra que bsicamente cada especie desvela un nuevo
pptido de estructura y composicin diferente en cada especie, un ejemplo de esto
se muestra en la siguiente tabla. (Ver Tabla 1).

Pptido obtenidos
Anoplina
Eumenitina

Decoralina

Especie
Anoplius
samariensis
Eumenes
rubronotatus
Oreumenes
decoratus

Secuencia
Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-Ile-LysThr-Leu-Leu-NH2
LeuAsnLeuLysGly
IlePheLysLysValAla
SerLeuLeuThr
Ser-Leu-Leu-Ser-Leu-Ile-ArgLys-Leu-Ile-Thr

Tabla 1: Pptidos aislados de venenos de Avispas Solitarias


Los datos contenidos en la anterior tabla muestran una amplia gama de compuestos
la mayora de ellos capaces de atacar gran nmero de cepas de bacterias multiresistentes y adems agentes como los promastigotes en el caso del pptido
Decloralina.

5.3.3.1. Pptidos de avispas solitarias.

Anoplina: estructuralmente tiene una alta homologa con Crabrolina y Mastoparn-X,


los cuales son pptidos que provocan degranulacin de mastocitos y se
encuentran presentes en venenos de avispas sociales (Konno et al., 2001). Por
medio del anlisis de dicromismo circular se pudo predecir que este pptido tiene
una estructura alfa-helicoidal, caracterstica de los pptidos antimicrobianos que
permiti su sntesis. Se corroboro su amplio espectro frente a cepas de S. aureus
ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922. Los mecanismos de accin de este decapptido
consisten principalmente en una accin que se produce entre la Anoplina y
membranas de las bacterias (Dos Santos Cabrera et al., 2008) generando la
26

apertura de poros en la misma, esta accin se potencia cuando la porcin carboxiterminal se encuentra amidada (Dos Santos Cabrera et al., 2008). El Anoplin se ha
considerado como una interesante biomolcula que podra llegar a usarse en
tratamientos farmacolgicos.

Eumenitina: Es un pptido linear con estructura LeuAsnLeuLysGlyIlePhe


LysLysValAlaSerLeuLeuThr. Sus caractersticas son muy similares a las de
la Anoplina. Es un pptido linear catinico con estructura antiptica que forma
estructuras de alfa-hlice juega un papel determinante en el ciclo biolgico de este
individuo ya que protege a la larva de las posibles colonizaciones o infecciones de
microorganismos a la presa mientras que la larva o futura avispa se alimenta de la
ella (Araa). (Konno et al., 2006) Al igual que los homlogos encontrados en otras
especies de avispas su posibilidad de inhibir la replicacin de colonias bacterianas
es muy amplia, su actividad frente a los protozoarios como leshmania muestra gran
eficacia. Rangel y colaboradores en el 2011 hallaron 4 pptidos anlogos al
Eumenitina en las especies: Eumenes rubrofemoratus y Eumenes fraterculus dichos
pptidos difieren en la composicin de la estructura secundaria y fueron designados
como:

-Eumenitina- R
-Eumenitina- F
-Emp-ER
-Emp_EF.

Decoralina: Es un pptido linear catinico compuesto por 11 aminocidos, Ser-LeuLeu-Ser-Leu-Ile-Arg-Lys-Leu-Ile-Thr. Este pptido fue aislado del veneno de la
avispa Oreumenes decoratus esta vez en Japn lo que da cuenta de la gran
diversidad de estos individuos que han logrado colonizar prcticamente todos los
hbitats. Las caractersticas que diferencian este compuesto de los otros pptidos
aislados anteriormente; es que este pptido no mostro una amidacin en el grupo
carboxi-terminal (Konno et al., 2007) y debido a esta conformacin la accin
antibacteriana es muy mnima a comparacin a muchos PAM, pero al sintetizar este
pptido en fase slida y adicionndole un grupo NH2 terminal la actividad de esta
sustancia fue mucho ms amplia que la Anoplina incluso frente a promastigotes de
Leshmania (Konno et al., 2007).

Aislar diversos pptidos del veneno de varias especies de avispas de hbitos


solitarios contribuyeron para corroborar que la funcin biolgica de estos pptidos
en la naturaleza es proteger a la larva de la invasin de microorganismos patgenos
mientras que completa su desarrollo y puede emerger (J. H. Baek & Lee, 2010).

En sntesis extraer y sintetizar pptidos antimicrobianos con un alto valor cientfico


ya ha sido demostrado por diferentes estudios dirigidos a comprobar la actividad de
los PAM que inducen cambios intracelulares en la clula y el rompimiento de la
bicapa lipdica de organismos bacterianos y protozoarios (Corrales-Garca, 2010;
27

Costa Neto, Pino, & Ramos-Elorduy, 2006; Cuadrado Cano, 2012; Konno et al.,
2006). Se encuentra una variedad de pptidos similares en estructura y actividad
como los encontrados en Anoplius samariensis, Oreumenes decoratus, Eumenes
rubronotatus y Polybia paulista (Konno et al., 2001; Konno et al., 2006; Konno et al.,
2007; Ribeiro et al., 2004).

5.4. Tcnica de separacin pptidos.

5.4.1. HPLC-RP.

Cromatografa lquida de alta resolucin en fase inversa (RP-HPLC) implica la


separacin de las molculas sobre la base de la hidrofobicidad. El compuesto pasa
por la columna a travs de una fase fija, mediante el bombeo de alta presin. Los
anlisis realizados en estas columnas particularmente muestras se retrasan
dependiendo de las interacciones fsicas y qumicas. El tiempo en que tarda un
compuesto en ser eluido se denomina tiempo de retencin, por tanto los solutos
eluyen en orden creciente de hidroficidad molecular (Aguilar, 2003).

5.4.1.1. Columna RP-18.

La columna de HPLC est diseada en dos partes; la primera el relleno qumico de


la columna y la segunda el soporte (Rieger, 2003). Los tamaos de columna ms
habitualmente recomendados para el desarrollo de mtodos analticos son 4,6 x 150
mm y 4,6 x 75 mm (Agilent, 2009). Una caracterstica destacada de las columnas
de fase reversa (RP) es que posee una mayor durabilidad a su vez que estn
compuestas por silica modificada. Habitualmente se recomienda que no se utilice
bases en medio acuoso debido a que daaran el esqueleto silica, tambin se
recomienda no exponer al acido por largos periodos de tiempo. Las columnas de
HPLC que tienen dimetros superiores a >10mm se utilizan en purificacin de
compuestos y las de un dimetro entre 4-5 mm o tambin denominadas de rango
analtico se utilizan para el anlisis cuantitativo muestras, comnmente asociadas a
estas detectores tipo UV-VIS. (Rieger, 2003).

5.5. Tcnicas para identificacin pptidos.

5.5.1. Espectrometra de Masas (MS).

Un espectrmetro de masas permite la determinacin de la caracterizacin de un


pptido y una protena, es una potente herramienta para el anlisis donde el
constante cambio y la tecnologa hace que las tcnicas sean ms depuradas. Los
pptidos y protenas analizados con este instrumento y la aplicacin de tcnicas
permiten determinar su secuencia de amino cidos y su peso molecular.
28

El espectrmetro de masas compite con mtodos clsicos como la degradacin de


Edman siendo est muy buena solucin cuan se buscan o se tratan de analizar
pptidos con su terminacin animo bloqueada o de aquellos modificados qumica o
enzimticamente (Joaquin., 1997). La volatilizacin de la muestra en gas; ms
especficamente hablando, tomar la muestra y ionizarla (convertir un pptido en
iones) para despus ser analizada, esto es el mayor impedimento que tiene el EM,
pero despus de unos aos con nuevas tcnicas como la ionizacin suave ha
ampliado el rango para el anlisis de molculas las cuales eran termolbiles. La
manera ms ingeniosa para llevar un anlisis a buen fin es el poder combinar una
buena tcnica de ionizacin con una tcnica de anlisis para obtener los mejores
resultados (Plascencia, 2003).

5.5.1.1. Funcionabilidad MS.

La espectrometra de masas posee una fuente de iones la cual convierte por


diversos mtodos la muestra en iones en fase gaseosa. Se separan entonces por
masa- carga (m/z), y un detector que simplemente genera una seal elctrica
proporcional al nmero de iones incidentes. La representacin de la corriente inica
frente a la masa carga, constituye el espectro denominado, espectro masas. Los
analizadores ms utilizados son los de cudruplo de sectores y TOF, donde la
resolucin de anlisis es de aproximadamente 500-1000 m/z. (Joaquin., 1997).

5.5.1.2. Ionizacin por electronebulizacin (ESI/MS).

Esta tcnica se ha convertido en una de las ms importantes para el anlisis de


biomolculas de pesos superiores a 100.000 Daltons (ver Figura 93). Se realiza en
condiciones atmosfricas de presin y temperatura. La disolucin de la muestra se
bombardea a travs de una aguja capilar de acero inoxidable a un flujo de algunos
microlitros por minuto. Las agujas se mantienen a un potencial de varios kV con
respecto al electrodo cilndrico que rodea a dicha aguja. La niebla de finas gotitas
cargadas resultantes pasa a travs de un capilar de desolvatacin donde se
produce la evaporacin del disolvente y de las molculas del analito y donde estas
adquieren la carga. Debido a que las gotitas se vuelven ms pequeas por la
evaporacin del disolvente, su densidad aumenta producindose la desorcin de los
iones en la atmsfera gaseosa.(Joaquin., 1997).

Se introduce un analito disuelto en un solvente ms voltil por un capilar de metal


muy pequeo y cargado ya que debido a la repulsin de las cargas elctricas, el
lquido se sale del capilar y forma un aerosol, una nube de pequeas gotas
altamente cargadas las cuales conforme el solvente se evapora, las molculas del
analito se aproximan, se repelen y finalmente, cuando la repulsin de las cargas
positivas vence la tensin superficial, estallan las gotas la cual es llamada la
Explosin de Coulomb El proceso se repite hasta que el analito est libre de

29

solvente, de modo que no quedan ms que iones y estos se mueven hacia el


analizador de masa (Chowdhury, Katta, & Chait, 1991).
5.6. Tipos de analizador de masa.

Aunque el funcionamiento del analizador de trampa de iones fue descrito por


primera vez a mediado de los aos 50, los espectrmetros de masas con este tipo
de analizador no empezaron a comercializarse hasta 1983. Actualmente, las
aplicaciones descritas en la bibliografa que utilizan este tipo de instrumentacin son
innumerables, y abarcan campos tan variados como por ejemplo estudios de
reactividad en fase gaseosa, anlisis de pptidos o aplicaciones medioambientales
(March, 2000; Hao et al., 2001).

5.6.1. Analizador de trampa de iones IT-MS, ion-trap MS o ITD.

Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos


pueden ser formados y confinados durante largos perodos de tiempo por la accin
de campos elctricos y/o magnticos. Se han desarrollado varios tipos de trampas
de iones que en general son cuadrupolos, pero en el espacio lo que hacen es
manipular iones y permitir hacer masas/masas.

Los iones de m/z circulan en una rbita estable dentro de la cavidad que est
rodeada por un anillo. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta, las
rbitas de los iones ms pesados llegan a estabilizarse, mientras que las de los
iones ms ligeros se desestabilizan, lo que causa colisiones. En un espectrmetro
de masas los iones quedan atrapados en el interior de la trampa mediante la
aplicacin de los voltajes y radiofrecuencias adecuados. Se sacando as los iones
que no interesan de la trampa y dejamos a estudio los iones que chocaran con el
He y as se hara se producira masas/masas (Corral, 2006).

5.7. Cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas LC/EM.

El acoplamiento CL/EM es ms complicado debido principalmente a dos factores: en


la espectrometra de masas se tienen que producir iones en fase gaseosa y resulta
necesario eliminar el disolvente utilizado en la elucin.
Acoplamiento por interfase de flujo de partculas: Se trata de un
procedimiento mediante el cual se puede separar el disolvente de las
molculas eluidas en una columna de cromatografa lquida de forma rpida y
eficiente. El eluato cromatogrfico se bombea a travs de un capilar hacia un
nebulizador concntrico de vidrio. Seguidamente el eluato se transforma en
una nube de gotas que son dispersadas mediante un flujo concntrico de
helio. La nube pasa a travs de una cmara de desolvatacin cuyas paredes
estn calentadas y en la que existe una presin ligeramente inferior a la
30

atmosfrica. Durante el trayecto estas gotas sufren una desolvatacin parcial


y producen gotas de los compuestos eludos ligeramente solvatadas. Cuando
el flujo abandona la cmara de evaporacin la mezcla de helio, vapor de
disolvente y molculas eluidas sufre una expansin en la primera etapa de
bombeo, de lo cual resulta un flujo de gas a alta velocidad que contiene a las
molculas eluidas. Estas molculas difunden ms lentamente del centro del
flujo hacia la periferia. Mediante un selector se escogen las capas perifricas
del flujo de manera que el vapor de disolvente escogido y el helio son
extraidos y bombeados mecnicamente fuera del aparato. Este proceso se
repite en la segunda etapa del bombeo. Finalmente, un estrecho flujo de
partculas enriquecido en las molculas de inters, de lenta difusin, es
enviado hacia el espectrmetro de masas sin perturbar el vaco. En las
fuentes de ionizacin (EI) o (CI) las partculas inyectadas se vaporizan
rpidamente antes de la ionizacin. En la fuente FAB, el flujo de partculas se
dirige sobre una boquilla FAB cubierta por una matriz. As, las partculas
chocan con la superficie de la matriz y son atrapadas en ella (Corral, 2006).

5.7.1. Sistemas de acople nano-ESI Chip-HPLC-MS/MS.

Consiste en un cromatgrafo lquido acoplado a un espectrmetro de masas con


una fuente de ionizacin de electrospray (ESI) y un analizador de masas de trampa
inica. Los pptidos trpticos son separados por cromatografa lquida de fase
inversa e introducidos secuencialmente on-line de forma automtica en el
espectrmetro de masas para su anlisis"(Alicante, 2015).

El sistema HPLC -Chip / MS permite una amplia gama de aplicaciones incluyendo


pptidos y molculas pequeas, esta nano columna cuenta con un micro inyector
automtico con termostato. El chip elaborado en poliimida. La espectrometra de
masas nanospray ha demostrado amplio potencial, tcnica sensible y reproducible
para la identificacin de pptidos a niveles femtomol a atomol (Agilent, 2012).

Aplicaciones:

1. identificacin de pptidos y muestras biolgicas en mezclas complejas.

2. Secuenciacin Novo. Bsqueda de espectros MS/MS identificacin de protenas y


pptidos por MS/MS.

31

6. MATERIALES Y MTODOS

6.1. Obtencin del material biolgico.

6.1.1. Caracterizacin de la zona de colecta.

La zona en la cual se realiz la colecta de especmenes se encuentra ubicada


sobre cuenca Alta del ro Sumpaz, localizada en la vertiente Occidental de la
Cordillera Oriental a 137 km va Bogot cabrera, en la vereda Aposentos del
municipio de Venecia Cundinamarca. Posee un clima templado de
aproximadamente 19C, es una zona montaosa medianamente disturbada,
conserva abundante vegetacin nativa; lo que permite la alta abundancia de
arcnidos y por ende avispas cazadoras de araas. Se escogi esta zona por el
alto nmero de lugares de anidacin tanto de Pepsis sp. como de Teraphosidos
que constituyen su principal alimento (Copperi et al., 2011).

6.1.2. Identificacin de los individuos.

Previo a la colecta de los individuos para el anlisis de su veneno se realiz una


captura inicial de un espcimen por el mtodo de jameo.(Mrquez, 2005) Con el fin
de determinar los rasgos generales que la diferenciaban de las otras especies
presentes en la zona. Se corroboro que perteneca a el gnero Pepsis sp. por las
caractersticas de venacin marginal, (Ver Figura 3) y conformacin de su placa
subgenital (Ver Figura 4) de acuerdo a las claves taxonmicas (Vardy, 2002). La
colaboracin del Mg. en ciencias Agrarias Alexander Garca, se determinaron los
rasgos de diferenciacin sexual ya que nuestro estudio se centra en el veneno, por
tanto solo era til la colecta de hembras ya que ellas con las nicas que producen
dichas toxinas (de la Fuente, 1994).

Figura 3: Venacin Sub marginales y marginales de las Alas de


Avispa Pepsis sp. A. B. Ala de Pesis sp. Tomado de vardy, 2002.

32

Figura 4: Pepsis Sp, Posicin placas Subgenitales.

6.1.3. Captura de especmenes.

Se escogieron dos sitios de captura de acuerdo a la mayor presencia individuos y


presas. Se denominaron sitio A y B. El sitio A comprenda una zona de cultivo de
frijol de aproximadamente una hectrea en el cual la presencia de araas era alta
debido a que la remocin del suelo por el arado les facilita la bsqueda de alimento.
En consecuencia era una zona de alta probabilidad de captura de hembras de
Pepsis sp, (Ver Figura 5).

El sitio B se caracterizaba por ser un camino de aproximadamente 1 km a lo largo


de una zona descarpada con un suelo rido en el cual se observaron galeras
construidas por tarntulas y presencia de hembras en busca de presa. Durante tres
das se realizaron los recorridos de colecta en el sitio A por el mtodo jameo,
haciendo el barrido lineal de cada surco del cultivo y en la zona B por recorrido libre.
La captura se realiz de manera manual con ayuda de recipientes aprovechando los
lapsos de tiempo en los que las avispas abandonan sus vuelos cortos y reptan
sobre la tierra, esto debido a que el mtodo de jameo se dificultaba por la topografa
del sitio; cada individuo observado en pleno vuelo era seguido hasta que iniciaba a
caminar sobre la tierra y all eran cubiertos con los pies e ingresados a recipientes
de vidrio.

33

Figura 5: Zona de observacin A. Zona de observacin B.

Figura 6: Hembra Pepsis sp, Vista Dorsal, cuerpo


completo

34

Se colectaron 10 especmenes hembras las cuales se sacrificaron in situ y sus


abdmenes fueron conservados en congelacin para posteriormente realizar la
extraccin de la bolsa de veneno (Picolo et al., 2010), esta tcnica de manejo de
los ejemplares no fue exitosa, al tratar de hacer la diseccin de las bolsas de
veneno las glndulas de la misma se encontraban totalmente degradadas. Por lo
que se decidi programar una nueva colecta que se ejecut durante cuatro das,
en las mismas zonas y bajo los mismos parmetros. Finalmente se colectaron 11
hembras (Ver Figura 6) las cuales fueron conservadas vivas y llevadas al laboratorio
para la extraccin de sus sacos de veneno.

6.1.4. Extraccin y conservacin de los sacos de veneno.

Las 11 hembras fueron sacrificadas en frascos.(Mrquez, 2005). La diseccin se


realiz mediante un corte en la parte ventral del abdomen el complejo glandular
de cada individuo, posteriormente se separ la bolsa de veneno del resto de
rganos.(Schoeters, Billen, & Schmidt, 1997) Cada saco de veneno fue colectado
en recipientes de 2ml con septa; fueron colectadas un total de 11 complejos
glandulares los cuales fueron transportados a una temperatura de -20C hasta el
laboratorio de qumica general de la universidad Javeriana en donde fueron
sometidos a proceso de liofilizacin que duro 24 horas, luego de ser liofilizadas las
muestras se mantuvieron a temperatura de -70C hasta su uso.

6.2. Preparacin de las muestras.

La preparacin de cada una de las muestras para el anlisis cromatogrfico se


realiz mediante la preparacin de una solucin 1:1 mg/ml del liofilizado de los
sacos con una mezcla que contena 50% de Acetonitrilo y 50% de H20 con TFA
0.1 % (Konno et al., 2001; Rangel et al., 2011) esta mezcla era sometida a
ultrasonido por espacio de 1 hora, la totalidad de la solucin fue puesta en tubos
eppendof se llevaron a centrifugacin por 5 minutos a 14.000 rpm; a su trmino el
sobrendate fue depositado en viales de anlisis con septa y almacenado a -20C
hasta el anlisis de HPLC RP.

6.3. Anlisis por HPCL-RP.

El anlisis cromatogrfico se realiz en las instalaciones del laboratorio de Qumica


de Postgrados de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot D.C. donde se
utiliz el equipo Agilent 1200 y una columna RP-18 Chromolith de 10 a 100ml de
Mecrk corporation. Con el fin de determinar el perfil cromatogrfico para Pepsis sp,
realizando varios ensayos basndonos en estudios de cromatogrficos en otras
especies de avispa.(J. H. Baek & Lee, 2010; Baptista-Saidemberg et al., 2012; M. A.
d. S. Mendes, Bibiana Monson Palma, Mario Sergio, 2005)

35

6.4. Anlisis LC/MS-MS.

El anlisis de cromatografa liquida acoplado a masas se realiz en las instalaciones


del laboratorio de Cromatografa y espectrometra de masas del sistema
universitario de investigacin (SIU) de la Universidad de Antioquia. El mtodo de
anlisis usado fue: HPLC- Chip- NANO-ESI /MS-MS para lo cual se utiliz el quipo
HPLC marca Agilent serie 1200 en modo nanoflow acoplado a un espectrmetro de
masas tipo Trampa de Iones Agilent modelo SL serie 6300 con fuente de ionizacin
NANOESI y un detector de trampa iones como se observa en las figuras a
continuacin. (Ver Figura 7 y Figura 8).

Figura 8: Hplc Agilent 1200


equipada por bomba de nanoflujo.

Figura 7: Espectrmetro de masas


Agilent SL 6300 con fuente de
ionizacin nano Hplc chip- cube.

Para sistema de nano flujo nano HPLC se utiliz el chip de larga capacidad
150mm 300 A C18 chip w/ 160 nl de Agilent Tecnologies. (Ver Figura 9)

Figura 9: Nano Chip 150mm Agilent


Tecnologies

36

6.5. Obtencin de Datos.

Los datos del anlisis LC/MS-MS se obtuvieron por el software DataAnalysis de


Bunker Daltonics programa preinstalado en el equipo; los anlisis complementarios
para la determinacin de masas moleculares se realizaron en el software
DataAnalysis in house versin 5.3 cuya licencia fue cordialmente compartida por el
PhD Ciencias Biomdicas Cesar Segura director del laboratorio de cromatografa
liquida y espectrometra de masas del SIU.

6.5.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas.

Se conform una listado con las masas moleculares de los pptidos reportados
para Avispas en las bases de datos online Uniprot.org y Erop- Moskow.
Posteriormente se realiz comparacin masa/masa entre los datos obtenidos y los
registrados en la base de datos.

6.5.2. Relacin masas Obtenidas Masas no reportadas.

Se determinaron los compuestos que tenan pesos moleculares entre 1000 y 3000
Dalton, los cuales posean una gran abundancia dentro del espectro, pero su masa
molecular no se relacionaba con ninguno de los pesos moleculares reportados en
avispas.

6.6. Masas obtenidas relacionadas con los pptidos reportados para la familia
Pompilidae.

Se identificaron las masas moleculares que tenan una alta concordancia con los
pesos moleculares de los pptidos reportados para la familia Pompilidae, con el fin
de establecer una relacin entre la composicin de sus venenos.

37

7. RESULTADOS

7.1. Anlisis HPLC en Fase reversa.

En base a las investigaciones de (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010) se utiliz
el mismo gradiente lineal (Ver tabla 2), el rango de absorbancia utilizado fue el de
215 nanmetros el cual es el ideal para este tipo de anlisis (Andreu & Rivas,
1997b). Se realizaron varios ensayos y se pudo identificar un perfil cromatogrfico
(Ver figura 10) el cual se repeta en las diferentes corridas, este anlisis preliminar
del veneno de esta avispa en trminos generales muestra relacin con los datos
obtenidos en los estudios realizados para la identificacin de Decoralina y Anoplina.
Puesto que se puede observar que los picos de separacin importantes se
encuentran al iniciar cada corrida y al final de la misma, lo que indicara que la
separacin ocurre en un primer momento en el cual las condiciones de la fase mvil
son 95% de agua y 5% de acetonitrilo. El segundo grupo de picos aparece cuando
las condiciones de la fase mvil se acercan al final de gradiente es decir que su
separacin se da cuando hay una concentracin de acetonitrilo cercana al 65% y
35% de agua.

Este aspecto es muy importante puesto que los pptidos que se han aislado y
sintetizado tienen estas caractersticas y se han descrito sus tiempos de elucin
bajo estas condiciones (K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010).

Tiempo

H20+TFA

ACN

O min

95%

5%

5 min

95%

5%

15min

65%

35%

30min

35%

65%

Tabla 2: Gradiente empleado en el anlisis de HPLC en fase reversa


Tecnologies
La separacin de los diferentes picos mostro una mejor resolucin al reducir la
concentracin de TFA en el solvente pues esto permiti que algunos picos que se
mostraban superpuestos se pudieran identificar claramente (Ver figura 10) (Andreu
& Rivas, 1997b).

38

Figura 10: Perfil cromatogrfico obtenido en el anlisis


La concentracin de TFA que tenamos como base era 0,1% (Ver figura 11) pero
bajo esta concentracin no se apreciaba una buena separacin entre los picos. Se
disminuy la concentracin del mismo a 0,01 como se seala en la Figura 10
siendo este ltimo el ideal.

Figura 11: Perfil obtenido con concentracin de TFA de 0.1%


7.2. Anlisis LC/MS-MS.

Para este anlisis se estableci un mtodo para la separacin partiendo del mismo
gradiente que se us en el anlisis por cromatografa liquida en fase reversa, pero la
corrida se realiz de 120 minutos con el fin de permitir una mayor separacin y la
identificacin de masas.

Tiempo

H20+TFA

ACN

0
20
45

95%
95%
65%

5%
5%
35%

85
120

35%
5%

65%
95%

Tabla 3: Gradiente empleado en el anlisis de LC/MS-MS


39

Los datos fueron analizados bajo los parmetros generales para pptidos que
establece el programa DataAnalysis y se analizaron masas de 200 a 2200 Dalton de
acuerdo al tipo de molcula y al marco de referencia de los pptidos reportados para
este tipo de organismos.

Figura 12: Cromatograma de masas completo y total tiempo corrida.


Los datos obtenidos por anlisis de espectrometra en trampa de iones permitieron
identificar 13086 iones moleculares, Gracias al registro de iones precursores con
carga +2 y +3 los cuales se organizaron a travs del software del equipo.
Se obtuvo un cromatograma (Ver Figura 12 y 13) que arrojo datos para 250
compuestos que tienen masas moleculares de entre 825 Da y 2175 Da. Ver anexo
2.

Figura 13: Cromatograma obtenido en el anlisis anlisis de LC/MS-MS

40

El perfil de masas que logramos obtener describa 2 sitios de concentracin de los


picos al igual que los ensayos que se realizaron por la HPLC se percibe una
semejanza.

Dentro de la ensayo el cromatograma nos permiti identificar una serie de picos


altos al iniciar la corrida y otros justo cuando la concentracin de acetonitrilo en la
fase mvil estaba entre 50% y 65% tal como suceda en los ensayos de
cromatografa en fase reversa que realizamos.

7.3. Anlisis de Datos.

7.3.1. Relacin masas obtenidas vs masas reportadas.

Al realizar la comparacin de las base de datos de las masas de los pptidos


reportados en veneno de avispas (Ver Anexo 1) con los datos obtenidos en el
anlisis realizado para Pepsis sp. se encontraron 6 masas que tienen una relacin
peso a peso de +/- 0.4 Da. (Ver Tabla 4).

Los pptidos que tienen relacin con los datos obtenidos para el veneno son:
Anoplina, Eumenitina Fulvonina Bradiquinina Polistesquinina y pptido Polibia Cp. la
masa experimental registrada en cada una de estas sustancias tiene una alta
proximidad a nuestros datos; sin embargo, debido a que esta investigacin
constituye un anlisis preliminar al veneno de Pepsis sp. surge la imposibilidad de
purificar y secuenciar cada una de estas sustancias. Por tanto no podemos asegurar
que se trata directamente de estas sustancias hasta no realizar un anlisis ms
detallado de los compuestos que se presentan en el extracto del veneno.

41

Masa Observada +E8A1:E7A1:F7+A1:F7


Masa Reportada Equipo Utilzado Pptido reportado
1153,9
1153,8 MALDI-TOF
Pptido Antimicrobiano, Anoplina

Especie de Avispa
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )

1240,2

1239,7 ESI

Polybia-CP pptido

Avispa Social Neotropical (Polybia paulista )

1243,7

1243,8 MALDI-TOF

Fulvonina

Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus )

1359,3

1359,3 MALDI-TOF

Bradiquinina

Avispa Social Neotropical (Polistes major )

1386,1

1385,7 MALDI-TOF

Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8]

Avispa de papel (Polistes jadwigae )

1623,2

1623 MALDI-TOF

Eumenitina-R

Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus )

Publicacion/Autor.
Anoplin, a novel antimicrobial peptide from the venom of the
solitary wasp Anoplis samariensis. Konno K.
Structural and functional characterization of two novel peptide
toxins isolated from the venom of the social wasp Polybia paulista.
Souza BM.
Bradykinin-related peptides in the venom of the solitary wasp
Cyphononyx fulvognathus. Picolo G.
Identification of three novel peptides isolated from the venom
of the neotropical social wasp Polistes major major. Cerovsk V.
Waspkinins of some Japanese wasps (Vespidae, Hymenoptera).
Nakajima T.
Chemical and biological characterization of four new linear
cationic alpha-helical peptides from the venoms of two solitary
eumenine wasps. Rangel M.

Tabla 4. Masa Observada Vs Masa Reportada (Compuestos Obtenidos de BD Uniprot y EROP-Moscow

42

7.4. Anlisis Espectros de masas.


A continuacin relacionamos los espectros de masa de cada uno de los compuestos
que conforman el grupo de datos que tiene relacin con los pptidos reportados en
las bases Uniprot y Ewrop-Moscow
1.
M/z= 1153.9 Da.
Masa experimental reportada = 1153.8 Da
Diferencia= 0.1 Da

Figura 14. Espectro de masas 1153.9 Da. Masa Observada. Compuesto 103 Tiempo
de retencin 67.8 min.
2.
M/z= 1240.2 Da.
Masa experimental reportada = 1139.7 Da
Diferencia= 0.4 Da

Figura 15. Espectro de masas 1240.2 Da. Masa Observada. Compuesto 142
Tiempo de retencin 86.7 min.
43

3.
M/z= 1243.7 Da.
Masa experimental reportada = 1243.8 Da
Diferencia= 0.1 Da

Figura 16. Espectro de masas 1243.7 Da. Masa Observada. Compuesto 144
Tiempo de retencin 88.0 min.
4.
M/z= 1359.3 Da.
Masa experimental reportada = 1359.3 Da
Diferencia= 0.0Da

Figura 17. Espectro de masas 1359.3 Da. Masa Observada. Compuesto 175
Tiempo de retencin 99.5 min.
44

5.
M/z= 1386.1 Da.
Masa experimental reportada = 1385.7 Da
Diferencia= 0.4Da

Figura 18. Espectro de masas 1386.1 Da. Masa Observada. Compuesto 181
Tiempo de retencin 102.4 min.
6.
M/z= 1623.2Da.
Masa experimental reportada = 1623.0 Da
Diferencia= 0.2 Da

Figura 19. Espectro de masas 1623.2Da. Masa Observada. Compuesto 216


Tiempo de retencin 109.5 min.
45

7.5. Masas encontradas no registradas en Bases de Datos.


Un total de 244 masas que registramos en nuestro anlisis no presento relacin con los
datos experimentales reportados en las bases de datos Dentro del anlisis estos
compuestos comprenden el 97.6 % de los datos obtenidos en el complejo del veneno
de Pepsis sp. este grupo de masas moleculares que estn dentro del rango de estudio
no las podemos catalogar como pptidos puesto que no realizamos purificacin de un
pico cromatogrfico en especfico, ni secuenciacin pero nos parece importante
incluirlas puesto que su tiempo de elucin, su peso molecular y abundancia dentro del
anlisis LC/MS-MS. Debe considerarse para futuros estudios que busquen pptidos con
actividad biolgica buscar los compuestos cuyo pico de elucin se encuentre entre los
45 min y los 85 min. (Ver Anexo 3) pues las condiciones de concentracin de la lnea b
son ideales para la obtencin de pptidos como los que se han encontrado en este
grupo de organismos (K. Konno et al., 2007).
En el cromatograma de masas los compuestos mayoritarios es decir los que mostraban
mayor intensidad curiosamente estn al inicio de la corrida por lo que difcilmente se
llegue a concluir que son pptidos con caractersticas similares a los pptidos
antimicrobianos o quininas que se han reportado en este tipo de avispas ya que la
concentracin de la lnea b es mnima. Instante en el que hay una alta polaridad y los
pptidos que se han reportado eluyen en condiciones donde la polaridad se ha
disminuido notablemente, lo que nos lleva a inferir que son sustancias medianamente
apolares (Palma, 2006).

7.6. Relacin pesos moleculares y pptidos reportados para Familia Pompilidae.

En las bases de datos que tomamos el estudio se encuentran reportados 7 pptidos


con actividad biolgica (Ver Tabla 5) han estudiado tan solo tres especies: Anoplius
samariensis, Cyphononyx dorsalis y Cyphononyx fulvognathus individuos
pertenecientes a la familia Pompilidae (Palma, 2006). Dentro de los 6 compuestos
relacionados en el estudio, (Ver Tabla 4). Tan solo dos de los pesos moleculares. Se
encuentra relacionado con los pptidos que han sido purificados del veneno de las
avispas de la familia pompilidae
Entrada
P84896
P83661

E03806
P0DL32
P83660

E02618
E02619

Pptidos Reportados para Pompilidos


Organismo

Peptido

[Thr6]-Bradiquinina
Pptido Cd-125
Anoplina
Fulvonina
Pptido Cd-146
Alfa-Pompilidotxina
Beta-Pompilidotxina

Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus )


Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis )
Avispa Solitaria (Anoplius samariensis )
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis )
Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus )
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ).
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis ).

Tabla 5: Pptidos Reportados para Pompilidos.

46

Peso Mol.

1074
1026
1153,5
1244
1693
1529,9
1557,9

La masa experimental reportada para el pptido Anoplina es de 1153.9 mientras que la


masa que relacionamos con este pptido difiere en tan solo 0.1 Da. En el caso de
Fulvonina que es el otro pptido que se ha descrito para la familia Pompilidae tambien la
diferencia es minima 0,1 Da. Sin embargo con el anlisis realizado no es posible dar
certeza que este dato corresponda al pptido. Se establece entonces un punto
departida para el anlisis en cuanto a la identificacin y la posible relacin de la
composicin peptdica del veneno de Pepsis sp y otras estas especies de avispas.

47

8. DISCUSION

Las investigaciones realizadas en el veneno de avispas de la familia Pompilidae y otras


avispas solitarias se caracterizan por demostrar la existencia de uno o un pequeo
grupo de pptidos con actividad biolgica aprovechable principalmente desde el punto
de vista farmacolgico; sin embargo, en estos trabajos no se ha descrito a ciencia cierta
la complejidad de estos venenos; por tanto, al iniciar la investigacin pensbamos que
la composicin peptdica podra resultar bastante sencilla. Los anlisis realizados
establecieron que este tipo de venenos presentan una alta complejidad en cuanto a su
composicin peptdica y realmente se desconoce a profundidad cual es la composicin
total del veneno (Kastin, 2006).

Se afirma que estos venenos de avispas contienen quininas, pptidos citotxicos,


pptidos alrgenos entre otros, pero esta aseveracin parte de una visin muy general
de todo el grupo, ya que dicha composicin se ha planteado desde la evidencia
experimental enfocada ms en el veneno de los individuos de hbitos sociales que
emplean su veneno para la defensa (Palma, 2006). Las avispas solitarias por su
comportamiento y por sus caractersticas reproductivas han mostrado contener pptidos
de accin mucho ms especfica, por ejemplo: la manipulacin y cambio del
comportamiento vital de la presa para llevar a buen trmino su reproduccin (Ji Hyeong
Baek et al., 2011; Libersat, 2003).

Gracias a los mtodos de separacin especficos para pptidos utilizados y los anlisis
de LC/MS-MS se lograron identificar 6 pesos moleculares presentes en el veneno de
Pepsis sp., las cuales tienen una alta similitud con masas reportadas para pptidos
con actividad biolgica demostrada. Los datos obtenidos permitieron comparar las
masas observadas vs los pesos moleculares que se encuentran publicados en artculos
cientficos y bases de datos, se encontr en el anlisis una diferencia mnima de 0,1 Da.
entre pesos moleculares observados y pesos moleculares descritos en bases de datos,
nos lleva a inferir que puede llegar a tratarse del mismo compuesto. Teniendo en
cuenta que nos referimos a pptidos la variacin en la secuencia de aminocidos
mostrara una diferencia considerable en las masas moleculares (Andreu & Rivas,
1997a).

En trminos generales al realizar el anlisis de los pptidos que componen el veneno


de una avispa solitaria, se esperara encontrar los mismos pptidos para un grupo de
individuos que comparten hbitos de alimentacin, comportamiento y cercana
taxonmica (Kastin, 2006; Tllez & Castao, 2010; Uma, 2010). Sin embargo, nuestros
resultados muestran que de los pptidos reportados para la familia Pompilidae tiene
relacin entre la masa experimental reportada: 1,153,8 Da. y la masa observada:
1153,9 Da. de ser confirmada nuestra inferencia este sera un pptido antimicrobiano
que desempeara un papel importante en la proteccin del individuo y tambin tendra
funcin especfica en su reproduccin (K. Konno et al., 2006; Palma,
48

2006; Picolo et al., 2010; Santos LD, 2011). Adicional a esto, existe relacin de las
masas halladas con dos pptidos de funcin anloga en el pptido quimiotactico de
polybia y eumenitinina-R, estos pptidos presentan una funcin anloga a la Anoplina
siendo Eumenitina-R mucho ms parecido a la Anoplina, tanto en su estructura como
en su mecanismo de accin (Santos LD, 2011); mientras que el pptido CP- polybia
acta como antimicrobiano, pero tambin desempea funciones de regulador de
hemotaxis.

De acuerdo a su comportamiento reproductivo todos los Pompilidos poseen un pptido


antimicrobiano en su veneno; por tanto, en el veneno de Pepsis sp. debe existir por lo
menos un pptido antimicrobiano, curiosamente relacionamos nuestros datos con tres
molculas de este tipo, lo que no ocurre en las investigaciones realizadas con otros
pomplidos pues en estas solo se ha descrito un pptido con dicha funcin (Nakajima
T, 1984; Palma, 2006). Los estudios realizados en bsqueda de pptidos anlogos se
ha demostrado que una especie puede poseer diferentes pptidos que se asemejen
ampliamente en cuanto a estructura y por tanto presenten un mecanismo de accin o
funcin biolgica anloga o similar, presentando uno o ms anlogos en su veneno
(Baptista-Saidemberg et al., 2012; Istvan Toth & William Anthony Gibbons, 1999; M. A.
Mendes et al., 2005; Murata et al., 2009).

Solo la secuenciacin de estas molculas que hemos encontrado en nuestro anlisis


permitirn saber si existe ms de un pptido antimicrobiano con las caractersticas alfa
helicoidales dentro del extracto del veneno de Pepsis sp. Nuestros datos nos llevan a
pensar que la Eumenitina y la Anoplina pueden estar presente en venenos de
Pompilidos; si partimos de la base que una especie puede poseer diferentes pptidos
que se asemejen ampliamente al mecanismo de accin o funcin biolgica anloga
(Costa Neto et al., 2006), Pepsis sp. podra presentar dos anlogos con funcin
antimicrobiana, hecho que no se ha reportado para ninguna especie de avispa (Palma,
2006). Por otro lado Las masas observadas 1359,3 Da y 1386,1 Da corresponderan
Bradiquinina y un anlogo Poliesquinina los cuales al igual que los Mastoparn son
muy frecuentes en el veneno de Avispas sociales pero esencialmente los anlogos
como el THr6-Bk, se han reportado en Avispas solitarias de las familias Pompilidae,
Specidae, Eumenidae y Socoliidae (Palma, 2006). De la Bradiquinina y la Poliesquinia
no se tienen reportes en estos individuos. La funcin de las quininas sera la de
bloquear el receptor nicotnico de acetilcolina de la presa inmovilizando el sistema
nervioso central del insecto o araa; de igual manera se ha reportado un efecto
hipotensor y vasodilatador; que influyen en la presin sangunea, principalmente como
hipotensoras, actuando en el msculo liso, provocando lesin rpidamente (Pea,
Pineda, Hernndez, & Rodrguez-Acosta, 2006). La masa 1243,7 Da. que podra
tratarse de Fluvonin pptido que se relaciona con las quininas coadyudando a la
contraccin del musculo liso puede que este pptido est estrechamente ligado a los
receptores involucrados en la transmisin y accin de estos neuropptidos y otras
quininas, por lo tanto es posible que est presente en el extracto o un anlogo a su
actividad, debido a que la avispa solitaria al cazar su presa genera despus de la
picadura el mismo efecto en la araa (Copperi et al., 2011).
49

Si bien, no podemos dar total certeza de las relaciones que hemos establecido entre
nuestros datos experimentales y el anlisis de LC-MS/MS. Nuestros resultados aportan
un rango de fiabilidad bastante alto, pero es de aclarar que hasta que no se realice un
estudio donde se incluya una purificacin del pico representativo de cada pptido por
medio de HPLC y un anlisis de secuenciacin peptdica no es imposible afirmar con
certeza que este sea la composicin y por tanto el pptido que aqu en esta discusin
se menciona.
Nuestros anlisis de HPLC-RP permitieron obtener el perfil completo del
fraccionamiento del contenido del saco de veneno de Pepsis sp. cuyo cromatograma es
bastante similar al que se reporta para muchos pptidos como lo es Anoplina,
Decoralina, Eumenitina donde se observan siempre dos grupos de picos similares. El
segundo grupo de picos podra decirse que es donde se reduce la polaridad y aparecen
siempre de forma plausible un pptido con actividad biolgica especfica (K. Konno et
al., 2001; K. Konno et al., 2006; K. Konno et al., 2007). En ese orden de ideas los
tiempos de retencin que mostraron las masas que relacionamos con pptidos
antimicrobianos y quininas tienen un comportamiento similar lo que aporta ms
sustento a nuestros planteamientos.

Dentro de las 250 masas observas en el espectro de masas posiblemente se


encuentren fragmentos de protenas complejas como la pompiltoxina alfa o beta las
cuales sin duda debe estar presentes en el veneno de avispas solitarias en este caso
Pepsis sp. tambin deben ser analizados los compuestos del cromatograma de masas
que responden a una separacin cromatografica altamente polar puesto que se
presentan como compuestos mayoritarios, tanto en el espectro de masas como en
todos los anlisis por HPLC-RP que se le realiz al extracto de veneno de Pepsis sp.
Es importante aclarar que el segundo grupo de picos que se mencion tienen unas
caractersticas medianamente apolares, teniendo en cuenta el gradiente utilizado y sus
tiempos de elucin y siendo estos uno de los que se le debe prestar una importancia
significativa al momento de futuros anlisis, as como lo demuestran investigaciones
realizadas en Japn y Brasil, donde este tema con los peptidos de propiedad
antimicrobiana es de gran inters. (Costa et al., 2004; Costa Neto et al., 2006; Monteiro
et al., 2009).
Los nicos de los posibles pptidos que podemos relacionar con los individuos de la
familia Pompilidae es Anoplinina y Fulvonina donde existe la alta relacin masa-masa.
Mientras que las bradiquininas que hemos relacionado con las masas estudiadas
fueron reportados en otras familias de avispas independientemente si tienen
comportamientos sociales o solitarios (Kinoshita et al., 2001; K. Konno et al., 2001;
Picolo et al., 2010). De confirmarse la existencia de estos dos pptidos para el veneno
de Pepsis sp. la investigacin establecera un punto de partida para futuras
investigaciones las cuales deben centrarse en la purificacin de los picos que se
obtienen entre los 10 a los 30 minutos, ya que la concentracin de la lnea B es ideal
50

para la elucin de pptidos con caractersticas similares a los que se han descrito para
las diferentes especies de avispas solitarias. Los datos preliminares que hemos
obtenido por medio de esta investigacin se ofrece un perfil general del comportamiento
del veneno pero en el anlisis de cromatografa liquida acoplada a masas con base a la
complejidad que mostr el contenido de la bolsa de veneno, consideramos pertinente
indicar que se deberan repetir corridas bajo los mismos parmetros que hemos usado
en la cromatografa liquida en fase reversa. Recoger los extractos y una vez obtenidos
realizarle el anlisis LC-MS/MS puesto que esto brindara confirmacin ms certera de
la presencia de pptidos con actividad biolgica especfica dentro del extracto del
veneno. Consideramos que las futuras investigaciones deben profundizar en el campo
de la identificacin de las secuencias de los espectros de masas hallados.

Realizando una investigacin ms minuciosa de los datos arrojados por el


espectrmetro de masas y anlisis con diferentes bases de datos, la coincidencia de
pesos moleculares es bastante alto con relacin a pptidos reportados mencionados
anteriormente. Es muy complicado dar certeza sobre la comparacin de los espectros
entre nuestro anlisis y otros ubicados en bases de datos profesionales como NIST y
Mascot; pues NIST hasta el 2008 no tiene bases claras sobre pptidos antimicrobianos
en artrpodos o una base de datos de pptidos antimicrobianos registrando espectros
de masas para ellos en estos software. El anlisis de ESI o MALDI-TOF seran una
solucin a este problema aislando los picos de inters y haciendo una secuenciacin por
degradacin de Edman o con el mtodo de secuenciacin de Novo tratar de identificarla,
pero surge un problema pues la confiabilidad con este mtodo es baja. Una
secuenciacin sera un anlisis ms confiable o con equipos de mayor confiabilidad
como UPLC acoplada a masas y buscar en sus bases de datos o utilizar el mismo
mtodo de anlisis que se mencion en este estudio pero purificando o separando el
pico de inters y as realizar el estudio con ESI y confirmarlo secuenciando sintetizando
y probando su actividad biolgica.
Debido a que la Anoplina, Fulvonina, Bradiquinina, Polistesquinina J, Eumenitina-R
fueron determinados por MALDI-TOF, es difcil ratificar que la semejanza entre las
masas experimentales y nuestros datos caso contrario el determinado por ESI PolybiaCP, pptido que tiene un peso molecular con un alto porcentaje de coincidencia, pero a
su vez no se puede afirmar que sea el pptido debido a que puede ser un fragmento o
parte de un compuesto ms grande que en el anlisis MS/MS puede que lo excluya del
sector faltante (Andreu & Rivas, 1997a). Recordemos que la trampa de iones nebuliza
el extracto y analiza por medio del detector, por lo tanto no podemos tener un
porcentaje muy alto de confianza ya que se analiz todo el extracto y no solo un pico
aislado del veneno. Lo que si podemos discutir aqu es que el veneno tuvo un
tratamiento para pptidos, con esto nos referimos a que se extrajo, se manipul y corri
en mtodos ideales para pptidos y no con esto queremos decir que cualquier
sustancia que se trate de esta manera se obtendrn pptidos; si no que tambin se
tena una bibliografa y documentacin previa de la posible composicin del extracto de
veneno, lo que queremos decir es que con estos mtodos de tratamiento de muestra se
eliminan grandes cantidades de compuesto que no queremos que aparezcan en el
anlisis de masas como protenas y otros compuestos. Pero no se descarta que
51

fragmentos de protenas ms grandes u otros compuestos se analicen con este mtodo


pues existe la probabilidad de que esto suceda. Debido a esto y a la utilizacin de
membranas con filtros especficos para el tratamiento de pptidos en el trabajo se
descartaron bastantes materiales no peptdicos en el extracto, lo que nos da una
confianza adicional para asegurar tambin las afirmaciones en este estudio preliminar.
Finalmente, a pesar de tratarse de un anlisis preliminar desde el punto de vista
experimental exaltamos los hallazgos producto de esta investigacin, se pud
establecer un protocolo para la purificacin y caracterizacin individual de los
compuestos peptdicos presentes en el veneno de Pepsis sp., logrando establecer el
perfil cromatogrfico que permite la separacin de los compuestos de inters biolgico.
Corroborando los datos de investigaciones de la ltima dcada (Dos Santos Cabrera et
al., 2008; K. Konno et al., 2001; Picolo et al., 2010; Ribeiro et al., 2004). De igual
manera presentamos una muestra global de los pesos moleculares presentes en el
veneno de esta especie, lo que puede utilizarse como punto de partida la creacin de
una biblioteca de pptidos y dems especies de Avispa solitaria para conducir a nuevas
perspectivas y nuevos conocimientos para el estudio del veneno en individuos de la
familia Pompilidae o quiz empezar a cultivar una biblioteca de pptidos de todas las
especies de Avispas sociales y solitarias en Colombia que esperamos sea una realidad
en el futuro.

52

9. CONCLUSIONES
Se pudo establecer un perfil cromatogrfico completo del veneno de la avispa solitaria
Pepsis sp., se identificaron 250 posibles compuestos peptdicos de los cuales solo el
2.4 % evidenci alta similitud con pptidos ya descritos para avispas y tan solo dos de
las masas moleculares identificadas mostraron estrecha relacin con pptidos descritos
para la familia Pompilidae. Como posibles pptidos presentes en esta avispa se
relacionan tres pptidos de accin antimicrobiana Anoplina, Eumenitina-R y el pptido
chemotactico de Polibya sp. El resto de compuestos que mostraron semejanza
correspondera a neuropptidos de tipo quininas denominadas Bradiquinina,
Polistequinina y un coadyudante de estos Fluvonin. Ya que la gran mayora de masas
identificadas no se pudo asociar con ningn pptido reportado, se asume que la
complejidad de la composicin peptdica del veneno de esta avispa exige anlisis ms
puntuales entre los cuales el ms recomendable seria el estudio de las masas de los
compuestos previamente purificados y aislados. Los pptidos antimicrobianos de
origen animal que se encuentran en los venenos de las Avispas establecen criterios
para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria Pepsis sp., posee pptidos
con actividad biolgica importante y se demuestra claramente en este estudio preliminar
la posible presencia de estas sustancias partiendo que es muy difcil en este tipo de
estudios que los pesos comparados varen uno del otro teniendo una diferencia tan
escasa en su masa y el anlisis cromatogrfico a 215 nm muestre un cromatograma tan
bueno en la separacin de estas sustancias y picos de inters como se muestran en los
dems estudios que sustentan estos planteamientos.

Los pptidos antimicrobianos de origen animal que se encuentran en los venenos de las
Avispas establecen criterios para inferir que el extracto de veneno de la avispa solitaria
Pepsis sp., posee pptidos con actividad biolgica importante y se demuestra
claramente en este estudio preliminar la posible presencia de estas sustancias
partiendo que es muy difcil en este tipo de estudios que los pesos comparados varen
uno del otro teniendo una diferencia tan escasa en su masa y el anlisis cromatogrfico
a 215 nm muestre un cromatograma tan bueno en la separacin de estas sustancias y
picos de inters como se muestran en los dems estudios que ostentan esta temtica.

53

10. SUGERENCIAS
Teniendo en cuenta que los estudios de la composicin del veneno de himenopteros y
especialmente en individuos de la familia Pompilidae son muy escasos en Colombia; en
un buen nmero de instituciones existe el equipamiento tecnolgico necesario para el
desarrollo de este tipo de investigaciones; por tanto, establecemos nuestra investigacin
como un punto de partida para esta lnea de investigacin de alto inters biolgico,
farmacolgico y biomdico.

Con el fin de completar los datos de nuestra investigacin proponemos complementar


nuestras apreciaciones con la purificacin y anlisis de espectrometra individual de los
picos. Pues suponemos que pueden confirmar la presencia de pptidos lineales
catinicos con actividad antimicrobiana.

54

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ANEXO 1. Compuestos del anlisis LC/MS-MS, Software DataAnalysis in house versin 5.3. Avispa - Pesis sp.
Compuesto m/z
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
Compuesto m/z
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
154
155
156
157
158
159
160

Tiempo Ret. Compuesto m/z


Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
1010,5 27.8
21
922,3 36.6
41
959,3 43.0
61
882,4 51.2
81
1282,6 58.1
101
1137,3 66.4
121
1111,7 29.8
22
907,5 36.9
42
966,8 43.4
62
905,4 51.7
82
919,1 58.4
102
1056,8 67.2
122
929,3 32.1
23
1146,3 37.0
43
1144,5 43.9
63
1106,3 52.1
83
944,1 59.4
103
1399,9 67.8
123
875,3 33.1
24
957,5 37.2
44
1260 44.2
64
962,1 52.7
84
1116,4 59.7
104
1114,8 68.5
124
2013,7 33.6
25
908,6 37.5
45
1019,3 45.3
65
906,4 52.8
85
921,3 59.9
105
1291 69.0
125
1037,4 33.8
26
921,9 37.6
46
1019,3 45.4
66
906,4 53.2
86
1137,6 60.6
106
1242,4 69.1
126
1106,4 34.1
27
907,4 37.6
47
2095 46.5
67
953,2 53.4
87
1139,5 60.9
107
1101,8 69.6
127
997,3 34.3
28
921,9 38.0
48
2095 46.6
68
858,2 53.5
88
1025,8 61.8
108
1286,5 70.4
128
894 34.4
29
1676,1 38.0
49
1236 47.0
69
1228,3 54.6
89
941,1 62.3
109
1175,9 70.9
129
894 34.4
30
1067,5 38.9
50
1080,1 47.0
70
1100,6 54.9
90
1865,7 62.6
110
1083,4 71.1
130
943,9 34.8
31
1129,6 38.9
51
1168,6 48.2
71
1797,5 55.3
91
1139,2 63.1
111
1023,3 71.5
131
938,5 35.0
32
1085,3 39.4
52
963,3 48.7
72
1277,9 56.0
92
1094,9 63.2
112
1112,3 71.6
132
938,5 35.0
33
905,5 40.0
53
1870,6 48.8
73
1522,5 56.5
93
1000 63.5
113
1354,3 72.7
133
862,5 35.7
34
1016,7 40.2
54
1041,1 49.4
74
1139,7 56.6
94
1048,6 64.0
114
1354,3 73.0
134
820,3 35.9
35
1027,9 40.4
55
1041,1 49.7
75
1139,7 57.0
95
1048,6 64.0
115
1106,6 73.9
135
867,5 36.1
36
883,4 40.6
56
1061,5 50.1
76
1419,6 57.1
96
1330,8 64.8
116
1052,4 74.1
136
885,9 36.1
37
1119,4 41.8
57
1203,7 50.5
77
1419,6 57.2
97
1173,9 65.2
117
1130,4 74.6
137
814,5 36.1
38
1185,1 41.9
58
1112,9 50.7
78
918,3 57.6
98
2116,4 65.3
118
1167,8 75.2
138
816,5 36.3
39
967,2 42.3
59
1047,8 50.9
79
1034,4 58.1
99
1309,1 65.7
119
1167,8 75.3
139
814,5 36.5
40
922,9 42.8
60
1047,8 51.0
80
1034,4 58.1
100
1130,5 65.8
120
1392,1 76.6
140
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret. Compuesto m/z
Tiempo Ret.
1192,2 86.6
161
1182,1 96.5
181
1201,6 102.4
201
1790,5 107.1
221
1394,9 111.1
241
1362,6 117.0
1240,2 86.7
162
1045,2 96.7
182
1319,4 102.6
202
1577,5 107.4
222
1422,1 111.3
242
1215,6 117.4
1199,4 87.3
163
1197,3 97.0
183
1260,7 102.7
203
1577,5 107.5
223
1196,8 111.4
243
1283,6 117.4
1152,9 88.0
164
1623,2 97.1
184
1260,7 102.7
204
1577,5 107.5
224
1998,5 111.4
244
1492,5 117.6
1655,4 88.5
165
1346,5 97.8
185
1548,9 103.1
205
1666,7 108.1
225
1387,3 111.9
245
1299,6 118.1
1655,4 88.6
166
1583,8 97.8
186
2139,9 103.1
206
1373,7 108.1
226
1393,7 112.3
246
1325,7 118.4
1153,9 89.1
167
1073,2 97.8
187
1687,8 103.6
207
1573,6 108.4
227
1863,7 112.5
247
1325,7 118.5
1082,9 89.7
168
1296 98.1
188
1616,1 104.3
208
1398,4 108.5
228
1393,7 112.5
248
1492,6 118.7
1473,3 90.8
169
1198,9 98.6
189
1616,1 104.4
209
1573,6 108.5
229
1221,6 113.1
249
1528,9 119.8
1172,3 92.2
170
1169,4 98.9
190
1604,1 104.9
210
1573,6 108.6
230
1312,6 113.2
250
1706,6 120.7
1154 92.3
171
1258,6 99.0
191
2111,3 105.0
211
2139,4 108.9
231
1375,5 113.9
1230,6 93.5
172
1169,4 99.0
192
2111,3 105.1
212
1376,4 108.9
232
1724,9 114.0
1152,3 94.2
173
1699,9 99.4
193
2111,3 105.2
213
2139,4 109.0
233
1230,6 114.2
975,2 94.2
174
1699,9 99.4
194
1877,8 105.5
214
1695,5 109.1
234
1207,7 115.6
1310,3 95.3
175
1187,1 99.5
195
2039,3 105.7
215
1797,5 109.5
235
1440,2 115.6
1189,2 95.4
176
1318,8 100.9
196
2138,5 105.7
216
1797,5 109.5
236
1276,4 116.2
1101,7 95.8
177
1318,8 101.0
197
2039,3 106.0
217
1373,5 109.7
237
1293,5 116.3
1078,5 96.1
178
1386,1 101.4
198
2175 106.5
218
1321,6 110.2
238
1185,1 116.4
1161,1 96.1
179
1549,4 101.9
199
2175 106.5
219
1549,6 110.7
239
1185,1 116.5
1161,1 96.3
180
1549,4 102.0
200
1475,4 107.0
220
1394,9 110.8
240
1359,3 116.7

Tiempo Ret
1392,1 76.7
1116,9 77.1
1243,7 77.3
1259,5 78.2
1105,3 78.5
1191,3 78.8
1280,2 79.2
1180,2 79.5
1204 79.8
1080,9 79.8
1115,4 80.3
1099,8 81.0
1099,8 81.0
1182,3 82.2
1182,3 82.4
1154,2 82.9
1345,6 83.7
1687,4 84.2
1214,2 85.8
1319,9 86.2

ANEXO 2. Base de datos pptidos reportados en Avispas (UniProt.org y EROP-Moscow)


Entrada
E10471
P83661
E03789
N/S

E00048
E00343
E03806
P0C005
E05430
P0C1R1
P69437
E06083
P0C1R0
P0DL32
E06091
P85870
E00651
P12797
E00472
P83659
E00713
P42718
E00143
E00469
E08520
P85875
E00191
E00482
E00395
P17237
P85873
E08519
E00483
E00470
P17235
E00471
E07842
E07844
P0CJ38
P0CJ39
E00241
E00411
P01514
E00394
E02084
P0C022
E02618
E06111
P69036
E00242
E02619
P69392
E07822
E05432
E06110
P69436
P69035
P84388
P42717
E05431

Peptido
Pptido Quimiotctico P-10 [1-6]
Pptido Cd-125
Pptide de Veneno, Cd-125
[Thr6]-Bradiquinina
Bradiquinina [G1]
Bradiquinina [A1]
Pptido Antimicrobiano, Anoplina
Anoplina (As-183)
Quimiotctico Pptido P-10
Protonectina
Protonectina (Pptido Quimiotctico)
Pptido Polybia-Quimiotctico
Pptido Polybia-Quimiotctico
Fulvonina
Decoralina
Decoralina
Bradiquinina-lys-ala [T6]
Megascoliaquinina
Bradiquinina Polistesquinina C
Cyphoquinina
Pptido Quimiotctico
Pptido Quimiotctico
Bradiquinina Polistesquinina-R
Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8]
Pptido de Veneno PPM3
Pptido de Veneno PPM3
Bradiquinina Vespaquinina X
Pptido Quimiotctico I-CP
Pptido Quimiotctico T
Pptido Quimiotctico (I-CP)
Quinina PMM1
Bradiquinina
Pptido Quimiotctico X
Bradiquinina Polistesquinina J [R2]
Pptido Quimiotctico L (VESCP-L) (Ves-CP-L)
Bradiquinina Polistesquinina J [R2,T8]
Antimicrobiano Pptido VESP-V1
Mastoparan-V1
Mastoparan-ER (EMP-ER) Eumenine
Mastoparan-EF (EMP-EF) Eumenine
Mastoparan
Mastoparan M
Mastoparan-L
Mastoparan T
Mastoparan-AF
Mastoparan-AF (EMP-AF) (Af-113) Eumenine
Alpha-Pompilotoxina
Protoplybia MP III
Mastoparan-3 (Mastoparan III) (MP-III)
Mastoparan X
Beta-Pompilotoxina
Beta-Pompilotoxina (Beta-PMTX)
Mastoparan PDD-B
Agelaia-MP
Protoplybia MP II
Agelaia-Mastoparan (Agelaia-MP)
Mastoparan-2 (Mastoparan II) (MP-II)
Polybine-1 (Polybine-I)
Waspquinina
Pptido Quimiotctico P-8

Organismo
Avispa Social (Agelaia pallipes pallipes )
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis)
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis )
Avispa (Cyphononyx fulvognathus)
Avispa (Polistes annularis Linnaeus )
Avispa
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
Avispa Solitaria (Anoplius samariensis )
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Brasilera (Protonectarina sylveirae )
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
Avispa Caza Araas (Cyphononyx dorsalis)
Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus)
Avispa Alfarera (Oreumenes decoratus)
Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons)
Avispa Solitaria (Megascolia flavifrons )
Avispa (Polistes chinensis )
Avispa Caza Araas (Cyphononyx fulvognathus)
Avispa (Parapolybia indica )
Avispa del Papel (Parapolybia indica)
Avispa (Polistes rothneyi )
Avispa de Papel (Polistes jadwigae )
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
Avispa Social Neotrpical (Polistes major )
Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera )
Avispa (Icaria sp )
Avispa (Vespa tropica )
Avispa (Icaria sp)
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera )
Avispa del Papel (Polistes jadwigae )
Avispa (Vespula flaviceps lewisii )
Avispa de Papel (Polistes jadwigae)
Avispa Hong Kong (Vespa bivolor )
Avispa Hong Kong (Vespa bivolor )
Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus )
Avispa Solitaria (Eumenes fraterculus)
Avispa Chaqueta Amarilla (Vespula lewisii )
Avispa (Vespa mandarinia )
Avispa Chaqueta Amarilla (Vespula flaviceps lewisii )
Avispa (Vespa tropica )
Avispa (Anterhynchum flavomarginatum )
Avispa Solitaria (Anterhynchium flavomarginatum )
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
AvispaSocial Neotrpical (Protopolybia exigua)
Avispa Japonesa (Vespa xanthoptera )
Avispa Solitaria (Anopilis samariensis )
Avispa Solitaria (Batozonellus maculifrons )
Avispa de Papel (Polistes dorsalis )
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
Avispa Social Neotrpical (Agelaia pallipes pallipes)
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
Avispa de Papel (Parapolybia indica)
Avispa Brazil (Protonectarins sylveira )

Peso Mol
627,56
1.026
1026,1
1074
1117,2
1131,2
1153,5
1.155
1209,6
1.211
1.211
1239,6
1.241
1.244
1256,8
1.257
1273,4
1.274
1275,4
1.290
1297,6
1.298
1301,4
1317,4
1317,8
1.320
1343,5
1351,7
1352,8
1.353
1.359
1359,3
1366,8
1372,5
1.384
1386,6
1420,6
1456,5
1.476
1.476
1478,9
1478,9
1.480
1512,9
1523
1.524
1529,9
1552,9
1.554
1555,9
1557,9
1.559
1565
1565,3
1567,8
1.568
1.569
1.570
1.573
1581,9

E06109
P0C1Q5
P69034
P85879
E05469
E07095
P84389
E00712
P42716
P0CJ36
E07823
E00328
E03675
P01517
E06656
P0C931
P0CJ37
E06082
P0C1Q4
E05470
E07096
E03790
P83660
P0C1Q9
E07821
P0C1Q8
E00699
P85880
E01412
E09498
P0C1M6
E09499
E07824
P0C1M7
P85874
E05924
P57672
E05922
E05920
E00047
E06658
P0DM71

Protoplybia MP I
Mastoparan (Protonectarina-MP)
Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MP-I)
Pptido-I Tachyquinina (PllTkP-I)
Polybine-I
Pptido Inflamatorio 13a
Polybine-2 (Polybine-II)
Mastoparan
Mastoparan (MP)
Eumenitina-R
Mastoparan MP
Mastoparan
Polistes mastoparan
Mastoparan-J (Polistes mastoparan)
Pptido Antimicrobiano
Eumenitina (Er-12)
Eumenitina-F
Pptido Polybia-MPI
Mastoparan-1 (Mastoparan I) (MPI) (MP-1)
Polybine-II
Pptido Inflamatorio 13b
Pptido Veneno, Cd-146
Pptido Cd-146
Mastoparan-V2
Mastoparan PDD-A
Mastoparan-V1
Mastoparan V
Pptido-II Tachyquinina (PllTkP-II)
Pentadeca Pptido
Dominulina A
Dominulina-A
Dominulina B
Mastoparan PMM2
Dominulina-B
Pptido Mastoparan PMM2
Apidaecina 6
Vespulaquinina-1 [Cleaved into: Vespulaquinina-2]
Apidaecina 4
Apidaecina 2
Bradiquinina Polistesquinina
Pptido Protopolybiaquinina-II Bradiquinina-related
Protopolybiaquinina-2 (Protopolybiaquinina-II)

Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)


1582
Avispa Social Neotrpical (Protonectarina sylveirae )
1.583
Avispa Social Neotrpical (Protopolybia exigua)
1.583
Avispa (Polistes lanio )
1.604
Avispa Social Neotrpical (polistine wasp)
1610,2
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
1613
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista )
1.617
Avispa (Parapolybia indica )
1618
Avispa de papel (Parapolybia indica )
1.619
Avispa Solitaria (Eumenes rubrofemoratus )
1.624
Avispa (Mischocyttarus phthisicus )
1630,9
Avispa (Polistes jadwigae )
1635
Avispa de Papel (Polistes jadwigae )
1635
Avispa de Papel (Polistes jadwigae )
1.636
Avispa Solitaria (Eumenes rubronotatus )
1645
Avispa Solitaria (Eumenes rubronotatus)
1.645
Avispa Solitraia (Eumenes fraterculus)
1.645
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
1654
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
1.655
Avispa Social Neotrpical (polistine wasp)
1658
Avispa Social Neotrpical (Polybia paulista)
1660,1
Avispa Cazadora Araas (Cyphononyx dorsalis )
1692,8
Avispa Cazadora Araa (Cyphononyx dorsalis )
1.693
Avispa (Vespula vulgaris)
1.731
Avispa de Papel (Polistes dorsalis )
1757,1
Avispa (Vespula vulgaris )
1.758
Avispa (Paravespula vulgaris )
1758,2
Avispa (Polistes lanio )
1.770
Avispa (Paravespula vulgaris )
1831,2
Avispa de Papel Europea (Polistes dominula / Vespa dominula) 1854,1
Avispa de Papel Europea (Vespa dominula )
1.856
Avispa de Papel Europea (Polistes dominula )
1909,1
Avispa Social Neotrpical (Polistes major)
1909,2
Avispa de Papel Europea (Vespa dominula )
1.911
Avispa Social Neotropica (Polistes major)
1.911
Avispa Parcita (Coccygomimus disparis )
1945,3
Avispa (Vespula maculifrons )
1.960
Avispa Paracita (Coccygomimus disparis )
1971,3
Avispa Paracita (Coccygomimus disparis )
1999,3
Avispa (Polistes )
2097,4
Avispa Social Neotropica (Protopolybia exigua )
2203,6
Avispa Social Neotropica (Protopolybia exigua)
2.204

ANEXO 3. Tiempos de Retencin de Compuestos entre Ideal 45-85 minutos.


compuesto m/z
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64

Tiempo Retencion min


1016,7
1019,3
1019,3
1023,3
1025,8
1027,9
1034,4
1034,4
1037,4
1041,1
1041,1
1045,2
1047,8
1047,8
1048,6
1048,6
1052,4
1056,8
1061,5
1067,5

45,3
45,4
46,5
46,6
47
47
48,2
48,7
48,8
49,4
49,7
50,1
50,5
50,7
50,9
51
51,2
51,7
52,1
52,7

compuesto m/z
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84

Tiempo Retencion min


1073,2
1078,5
1080,1
1080,9
1082,9
1083,4
1085,3
1094,9
1099,8
1099,8
1100,6
1101,7
1101,8
1105,3
1106,3
1106,4
1106,6
1111,7
1112,3
1112,9

52,8
53,2
53,4
53,5
54,6
54,9
55,3
56
56,5
56,6
57
57,1
57,2
57,6
58,1
58,1
58,1
58,4
59,4
59,7

compuesto m/z
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104

Tiempo Retencion min


1114,8
1115,4
1116,4
1116,9
1119,4
1129,6
1130,4
1130,5
1137,3
1137,6
1139,2
1139,5
1139,7
1139,7
1144,5
1146,3
1152,3
1152,9
1153,9
1154

59,9
60,6
60,9
61,8
62,3
62,6
63,1
63,2
63,5
64
64
64,8
65,2
65,3
65,7
65,8
66,4
67,2
67,8
68,5

compuesto m/z
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124

Tiempo Retencion min


1154,2
1161,1
1161,1
1167,8
1167,8
1168,6
1169,4
1169,4
1172,3
1173,9
1175,9
1180,2
1182,1
1182,3
1182,3
1185,1
1185,1
1185,1
1187,1
1189,2

69
69,1
69,6
70,4
70,9
71,1
71,5
71,6
72,7
73
73,9
74,1
74,6
75,2
75,3
76,6
76,7
77,1
77,3
78,2

compuesto m/z
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144

Tiempo Retencion min


1191,3
1192,2
1196,8
1197,3
1198,9
1199,4
1201,6
1203,7
1204
1207,7
1214,2
1215,6
1221,6
1228,3
1230,6
1230,6
1236
1240,2
1242,4
1243,7

78,5
78,8
79,2
79,5
79,8
79,8
80,3
81
81
82,2
82,4
82,9
83,7
84,2
85,8
86,2
86,6
86,7
87,3
88