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Modulo Aplicaciones de la Biología Molecular – Especialización Hematología en el Laboratorio Clínico y

Manejo del Banco de Sangre

Taller II
Técnicas diagnosticas basadas en la detección de proteínas
1. Revise y brevemente mencione el fundamento de las técnicas de ELISA, Western blot e IFI. Haga un
paralelo entre las tres resaltando sus principales diferencias.
La técnica de ELISA se fundamenta en el empleo de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de
forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los
componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple
vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
El western blot también llamado “inmunoblotting” es un método en biología molecular, bioquímica,
inmunogenética utilizado para identificar y localizar proteínas basadas en la capacidad de unión a anticuerpos
específicos. Implementa gel de electroforesis para separar proteínas desnaturalizadas de la masa. Las
proteínas son trasferidas desde el gel hacia la membrana (originalmente de nitrocelulosa), donde son
examinadas utilizando anticuerpos específicos para la proteína. La especificidad de unión antígeno – anticuerpo
permite la detección de una única proteína dentro de una mezcla compleja de otras proteínas. En la actualidad
se utiliza como criterio de identificación positivo de una proteína especifica en una mezcla compleja y para
obtener datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.
La inmunofluorescencia se utiliza esencialmente en la detección de autoanticuerpos y anticuerpos contra
antígenos de superficie de células y tejidos. Para ello se emplean anticuerpos preparados frente a la proteína
que se desea detectar marcados con moléculas fluorescentes. La IFI (inmunofluorescencia indirecta) hace uso
de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se une a la molécula diana, mientras que el
secundario que es el que se encuentra marcado con fluorocromo, reconoce al primario y se une a él.
Paralelo entre las 3 técnicas.
ELISA

Western blot

IFI

La identificación de Ag o
Ac se hace mediante una
enzima. Técnica con más
sensibilidad
que
especificidad, además es
una prueba de tamizaje.

Se basa en la separación electroforética de
proteínas
que
son
posteriormente
inmovilizadas en una membrana adsorbente
con el objetivo de determinar la presencia de
Ac específicos contra cada una de esas
proteínas. Es una prueba confirmatoria ya que
es altamente específica.

Se trata de una técnica
microscópica cuya base es una
reacción
inmunológica
con
marcador fluorescente. Es una
técnica con una alta sensibilidad
y es una prueba de tamizaje.

2. Usted realiza un ensayo de western blot en el laboratorio para el diagnostico de HIV a tres individuos. Los
resultados los observa a continuación:

a) Basado en lo anterior dé el diagnostico para los pacientes A. p24 y bandas débiles en de gp120 y gp41. Para ser reportado como positivo. el ensayo de Western Blot requiere de reactividad cerca de las bandas codificadas por el gen env4 (gp 160.123 y corresponde al último pozo con un color verde más claro que el pozo del control negativo.689. Corresponde al segundo pozo verde de color claro e) ¿Cuál es el control del ensayo? El control del ensayo es de 0. El ELISA HIV. algunas veces llamado EIA (HIV enzyme immunoassay) es la prueba más básica para determinar si un individuo es positivo para HIV. Paciente A: Negativo. ya que no hay bandas presentes. p55. Corresponde al primer pozo verde intenso (izquierda a derecha) d) ¿Cuál es el control negativo? El control negativo es el que tiene un punto de corte de 0. pero los otros pasos de la técnica no y además se hacen de manera correcta? El anticuerpo humano Ig-conjugado no se une a la placa de ELISA y puede ser lavado y los valores de densidad óptica son cercanos al control del ensayo. Ana Liliana Coral. glicoproteína envuelta) o cercano a esta banda ENV mas la banda p24. a) ¿Qué pasaría si el suero del paciente fuese omitido del ELISA. b) Para los datos de la ELISA ¿Cuál de los pacientes se considera seropositivo? El paciente C ya que tiene un punto de corte de 1.999 y el punto de corte me indica que un resultado por encima de 0. B y C y justifique su resultado.153. Paciente C: Positivo. en general se encuentra une a: Anticuerpos primarios 3. ya que hay un pico en la banda gp160. En este caso este paciente solo presenta un pico en la banda p24 y bandas débiles en p55 y p41. Andrea Johana Valenzuela.500 se considera positivo. c) ¿Cuál es el control positivo? El control positivo es el que tiene un punto de corte de 1. Paciente B: Indeterminado ya que el perfil de bandas no se acerca al criterio de resultado positivo. . b) ¿Qué mide este ensayo? Solo anticuerpos contra el VIH c) En la línea 1 los anticuerpos primarios están unidos a: Las proteínas del HIV d) El segundo anticuerpo o conjugado.