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PREPARACION DE DISOLUCIONES PARAS LA EXTRACCION DEL DNA

1.
OBJETIVOS
a) Objetivo general.Realizara clculos para las precauciones de disoluciones, adecuadas y exactas de las disoluciones en el
laboratorio. Con la finalidad de tener una buena extraccin del DNA.
b) Objetivos especficos. Preparar las disoluciones utilizados en medios de cultivos para la regulacin del PH de otras
disoluciones preparadas.
Identifique y maneje el equipo necesario en las prcticas correspondiente en laboratorio.
Determinar los clculos de las diferentes disoluciones, con respecto a los reactivos con que se
cuenta en laboratorio de la U.A.G.R.M. de la facultad de ciencias Farmacuticas y Bioqumicas
Realizar en laboratorio los clculos usando las frmulas matemticas y fsicas.
2.

MARCO TEORICO

Todas las clulas, a excepcin de las clulas anucleadas de los eritrocitos maduros en humanos,
contienen ADN en sus ncleos celulares. Tambin podemos encontrar ADN dentro de otros
compartimentos celulares diferentes al ncleo, como las mitocondrias y los cloroplastos. La
cantidad
de
ADN
presente
en
algunos
tejidos
es
muy
pequeo;
por e s t e m o t i v o n o r e p r e s e n t a u n a f u e n t e c o n v e n i e n t e d e e x t r a c c i n , a i s l a m i e
n t o y purificacin, para ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico.
Muchos tejidos contienen alta actividad de desoxirribonucleasa (DNAasa) que rompe la
macromolcula en pequeos fragmentos. Para seleccionar un tejido como fuente de ADN debe
reunir dos condiciones: contener gran cantidad de material gentico poseer baja actividad de DNAasa.
Este procedimiento permite obtener cidos nucleicos, con un bajo grado de pureza. Que sern almacenados en
congelacin para usos posteriores.
Contempla la descripcin de las distintas fases de la tcnica, el material necesario. La preparacin de
disoluciones.
Tambin incluye notas de seguridad y medioambiente de los reactivos utilizados.
Solucin stock: es una solucin que posee una concentracin alta de una o varios compuestos y reactivos
qumicos conocidos.

Clasificacin de disolucin
Segn el tamao del soluto o fase dispersada en el disolvente las disoluciones se clasifican en:
Las disoluciones groseras: Tambin se llaman dispersiones Ya que las partculas dispersadas al tener un tamao
superior a 0.1 u se observan a simple vista. Por ejemplo:
Los medios de cultivo liquido de bacterias.
Las disoluciones verdaderas: Son lasms utilizadas en el laboratorio, las partculas dispersadas no se pueden
observar, ya que tiene un tamao de partcula inferior a las 0.001 u.

Las unidades fsicas que expresan la concentracin de las disoluciones se basan en magnitudes fsicas como la
masa y el volumen. Son las unidades clsicas para expresarla.
Formulas importantes para preparacin de disoluciones:
C1*V1=C2*V2
C1 Concentracin inicial
C2 concentracin final
V1= Volumen inicial
V2 volumen final
2.g=M(PM).V
(g =gramos, M=Molaridad. PM= peso molecular y V= volumen en litros)
Forma expresado de las disoluciones
Entre las disoluciones de concentracin expresada en unidades qumicas Molaridad, molalidad, normalidad.
Milimolar, micromolar.
Solucin de Acetato de sodio:
A 60ml de una disolucin de acetato de sodio 5 M, Aadir 11.5 ml de cido actico glacial, y 28.5 ml de agua
destilada, estabilizar el ph=3.
Prepare un volumen de 5 ml.
SOLUCIONES SIMPLES
a) Prepare 5ml de etanol 72% a partir del 96 %
DATOS

V1*C1=V2*C2

V1= 5ml

V2=V1*C1C2

C2 = 72%

V2= 5ml*72%/96%

C1 = 96%

V2= 3.75ml

PM =46g/mol
B).-Prepare 5ml de hidrxido de sodio 0,2M. a partir de ---30%---------DATOS
V1*C1=V2*C2
V1= 5ml
C2 = 69%

20g------ 100ml
x-------1000ml

V2=V1*C1C2
V2= 5ml*0.2mol/5mol

C1 = 96%
PM =46g/mol
200g-----x

x=200g
40g------1mol

V2= 0,2ml---200ml

X= 5mol
C)
Prepare 5ml de hidrxido de sodio 2M. a partir de ---25%------DATOS
V1*C1=V2*C2
V1= 5ml

30g------ 100ml

C2 = 2mol

x-------1000ml

Na0H=30%

x=250g

PM =40g/mol

V2=V1*C1C2
V2= 5ml*0,2mol/7,5mol
V2= 0,13ml

40g------1mol

300g-----x
X= 6,25 mol.
C1= 2mol/1000ml*40gNa0H/1mol*100ml =8%Na0H
30g Na0H*x/5mlx8g Na0H
X= 8g Na0H (5ml)/30gNa0H
X= 1,6 ml
d) Prepare 5ml de lauril sulfato sdico (SDS)AL -----20%---DATOS
V1= 5ml
C2 = 20%

20g SDS ----100ml


x------- 5ml
x=1 gms
PM =288,38g/mol SDS
e)

Prepare 10ml acido clorhdrico----1%------

--- DATOS
V1*C1=V2*C2
V1= 10ml M=d x Pza x 10/PM
C2 = 2,5%HCL V1= 10ml*2.5%/37%
d= 1.198
C1= 37%HCL

M= 1.198*37%*10/36.5

V1= 0,226ml------226,89

M= 0,1 gms

M=1.198*2.5%*10/36.5
M=0,27

V1= 10ml*0,8205mol/12,144mol
V1= 0,226ml------226,89

f) prepare solucin de fenol, cloroformo. Alcohol isoamilico, la relacin por partes es.
80: 40: 2, esto es 80 partes de fenol, 40 partes de cloroformo y 2 partes de alcohol
isoamilico. volumen de 20 ml

DATOS
FENOL---------------

80 80ml de fenol-------122ml

CLOROFORMO ----

40 x

------

ALCOHOL ISOAMILICO---- 2

VT= V1+V2+V4

20ml

VT= 19.98mlx1000ml

x= 13.11ml de fenol

VT= 19987.86

T0TAL
122
40ml de cloroformo------122ml
x
------ 20ml
x= 6.55ml de cloroformo
2ml alcohol isoamilico-----122ml
x
-------- 20ml
x= 0.32ml alcohol iso.

G):-prepare 5ml de solucin de acetato de sodio --2.8 M--DATOS


C = 2.8M
V = 5ml
82g acetato de sodio---------1mol
x

------ 2.5 mol

x=

1,904 g acetato de sodio

PM= 136g/ mol205g acetato de Na--------1000ml


x -------- 5ml
x=

1,923 g de acetato de Na----

1923mg CH3C00Na3h20

h ) tampn fosfato monosodico y disodico PH 8 un volumen de 10 ml de concentracin


DATOS

disodico ACNaCH2P042H20

C= 0.6M

PM= 156,01g/mol

V= 10mlmonosidico Base Na2HP04


Ph= 8

PM= 141,96G/mol

Pka=-log ka
Pka=-log1,3x10-8

Acido

0.284mol ------1000ml

Pka=7.88

Ph=pk+logcB/Ca

10ml

x= 0,00284mol

8 -7.88+logCb/Ca------------logCB/Ca=8-7.88156,01g

-------1mol

0.12=logCB/Ca----------- antilog(0.12)= CB/Ca


1.32= CB/Ca-----

-------

1.32Ca=CB

CT= CA+CB------0.66=1CB+(1.32Ca)-------0.66=2.32Ca
Ca=0.66/2.320.374mol----------1000ml

--- --0,00284mol
x=

BASE

0.443g-----443mg

Ca= 0.284molx -------------10ml


CB= 1.32*0.284

x= 0,00374mol

CB= 0.374141,96g ----------1mol


x--------------0,00374mol
x= 0.5309------530,93mg

PROCEDIMIENTO
1. Preparar las siguiente solucin
Solucin de lavado
Tampn fosfato

= 14 mol

Cloruro de Magnesio = 5 mol

5 mol x 1 M
1000 M

= 5 x 10-3

EDTA
Ajustar el PH a 8.0

= 1 mol

Solucin lavado
b) Cloruro de Magnesio
MgCl2 =

5 mM x

1M
1000 mM = 5 x 10 -3 M < 0,3

Datos
C1 = 0,6 m

sol, stock

PM MgCl2 6 H2O = 203,31 / mol

C2 = 5 X 10-3 m

0,6 mol MgCl2 6 H2O 1000 ml

V1 = ?

x 5 ml

V2 = 10 mol

x = 5 x 10-4 mol MgCl2 6 H2O


60 mg MgCl2 6 H2O
203,31g MgCl2 6 H2O 108 g H2O

V 1 = C2 V 2

0,6 g MgCl2 6 H2O x

C1

X = 0,031 g H2O
-3

V1 = 10 ml x 10 M
0,1 M

- 5 ml

4,95 ml H2O

V1 = 0,5ml
b) Glucosa
PH = Glucosa = 180,15 / mol
Datos
C1 = 0,3 M

56 mM x 1 M
1000 mM

0,3 mol 1000 ml

C2 = 0,056

x 5 ml

V1 = ?

x = 3 x 10-3 mol glucosa

V2 = 10 ml

= 0,056 M

1,5 g glucosa 1 mol


x 3 x 10-3 mol Glucosa

V 1 = C2 C2
C1

x = 0,27 g glucosa
270 mg glucosa

V2 = 0,056 M 10 ml = 1,866 ml
0,3 M
1866 NL
b) EDTA

1 mMol
1M
1000 mM

= 1 x 10-3

PM = EDTA 2H2O = 372,24g / mol


Datos
C1 = 0,01 M

0,01 mol EDTA 2 H2O 1000 ml

C2 = 1 x 10-3

x 5 ml

V1 = ?

x = 5 x 10-4 mol

V2 = 30 ml
V 1 = C2 C2

372,24 g EDTA 2H2O 36 g 2H2O

C1

0,18 g EDTA 2H2O

V1 = 1 x 10-3 10 ml = 0,01 ml
0,01 M
100 NL

x = 0,018 g 2H2O
0,018 g 2H2O

- 5 ml
4,98 ml 2H2O 4990 NL 2H2O

Solucin de Lisis

a) Tampn Fosfato 24 mM
Glucosa
56 mM
EDTA
8 mM
Ajustar PH = 8,0
Prepare 10 ml de volumen final de la solucin lisis
a) tampn fosfato
Datos
24mM 1M = 0,024 M
1000 M
C1 = 0,06 M
C2 = 0,024 M
V1 = ?
V2 = 10 ml

V 1 = C2 C2
C1
V1 = 0,025 M 10 ml
0,06 M
V1 = 0,025 M ml 4166 NL

c) EDTA
2H2O
PM = 336,24 g / mol
PM 372,24 g / mol

8 mMol x 1 M
1000 nM

= 8 x 10-3 M

Datos
C1
C2
V1
V2

=
=
=
=

0,1 M
8 x 10-3
?
10 ml

0,06 mol EDTA 2 H2O 1000 ml


x 5 ml
x = 5 x 10-5 EDTA 2 H2O
372,24 g EDTA 2 H2O 3 mol
x 5 x 10-4 EDTA 2 H2O
x = 0,018 g EDTA 2 EDTA
186 mg EDTA 2 H2O
372,24 g EDTA 2 H2O 36 g H2O
0,111 g EDTA 2 H2O
x
x = 0,010 g H2O
V1 = C2 V2
- 5 ml
C1
- 4,98 ml 4980 NL
V2 = 8 x 10-3 M x 10 ml = 8 ml
0,01 M
800 NL

TABLA DE RESUMEN DE LA SOLUCIONES PREPARADAS


Solucin de lavadocloruro de magnesio
Nombre
del
estudiante

Concentra
cin de la
sol. Stock

Nelva
Zulema
Anabel
Elfi

0,3M
0,4M
0,06M
0,1M

EDTA
Nombre

Concentra

Peso del
reactivo

30 mg
40 mg
60 mg
100 mg

Volumen
final de la
solucin
Stock
4,838ml
4,78ml
4.969 ml
4,95 ml

Volumen
para
preparar
la dilucin
166 ul
125 ul
833 ul
500 ul

Volumen
final
De la
dilucin
10ml
10ml
10ml
10ml

Peso del

Volumen

Volumen

Volumen

del
estudiante

cin de la
sol. Stock

reactivo

Nelva
Zulema
Anabel
Elfi

0,3M
0,4M
0,06M
0,00M

558,36 mg
744 mg
111 mg
186,2 mg

SOLUCION DE LISIS
G L U CO S A
Nombre
Concentra
Peso del
del
cin de la
reactivo
estudiante sol. Stock
Nelva
Zulema
Anabel
Elfi

0,3 M
0,4 M
0,06 M
0,3 M

EDTA
Nombre
del
estudiante

Concentra
cin de la
sol. Stock

Nelva
Zulema
Anabel
Elfi

0,3M
0,4 M
0,06 M
0,1 M

270,225 mg
360 mg
54 mg
270 mg

Peso del
reactivo

558,36 mg
744,48 mg
1116 mg
18,61 mg

final de la
solucin
Stock
4,946 ml
4, 928 ml
4,99 ml
4,982 ml

para
preparar
la dilucin
33,33 ul
125 ul
160 ul
100 ul

final
De la
dilucin
10ml
10ml
10ml
10ml

Volumen
final de la
solucin
Stock
5ml
5ml
5ml
5ml

Volumen
para
preparar
la dilucin
1866,66 ul
1400 ul
9,330 ul
1866 ul

Volumen
final
De la
dilucin
10ml
10ml
10ml
10ml

Volumen
final de la
solucin
Stock
4,838 ml
4,838 ml
4,893 ml
4,99 ml

Volumen
para
preparar
la dilucin
166 ul
1400 ul
1330 ul
8000 ul

Volumen
final
De la
dilucin
10ml
10ml
10ml
10ml

Volumen
final de la
solucin
Stock
4,946 ml
4,928 ml
4,99 ml
4,98 ml

Volumen
para
preparar
la dilucin
333,33 ul
275 ul
1660 ul
1000 ul

Volumen
final
De la
dilucin
10ml
10ml
10ml
10ml

RESUPENSION E D T A
Nombre
del
estudiante

Concentra
cin de la
sol. Stock

Nelva
Zulema
Anabel
Elfi

0,3 M
0,4 M
0,06 M
0,1 M

Peso del
reactivo

558,36 mg
724 mg
111 mg
186 mg

OBSERVACIONES
Las soluciones preparadas se deben guardar a 4C. Para su conservacin hasta el momento de su uso en la
extraccin del material gentico plsmido de las Bacterias
CONCLUSION
En las prcticas se llev a cabo los clculos dados por el docente a diferentes concentraciones `para cada
grupo, siendo el docente quien escoga la concentracin ms apropiada para la preparacin de los reactivos,
teniendo mucho cuidado con el lauril sulfato de sodio ya que al diluir produca burbujas, con nuestras
preparaciones fue satisfactorio.
BIBLIOGRAFIA
1. 2.- Sanbrook, J and D.Russell2001molecularcloning A Laboratory manual 3raediccion.
2. 1.- Gua de laboratorio de FMC-420