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Caso Clnico
Mujer de 41 aos
Enfermera de profesin
Derrame pleural
Toracentesis (12/7/15)
Caso Clnico
Biopsia Pleural (16/7/205)
Caso Clnico
BAAR Esputo Negativos
Dx: TBC Pleural BAAR(-) PCR en Tejido Positivo y con mutaciones de
resistencia a RIFAMPICINA
MDR?????
Caso Clnico
Nueva Biopsia Pleural para SEEGENE y Genexpert
SEEGENE
: NEGATIVO
GENEXPERT: NEGATIVO
NO ES TBC PLEURAL????
FALSO POSITIVO DEL PRIMERO????
Caso Clnico
Cultivo de colonia crece a los 40 das, se realizan pruebas de
sensibilidad y se confirma TBC
Pleural MDR
Mtodos Directos
Cultivo convencional-PPP
MGIT
Mtodos Moleculares
Mtodos Directos
Cultivo convencional
MGIT
Sistema Genexpert
Sistema Genotype
Sistema TOCE
Mtodos Moleculares
Que se necesita?
Mtodo rpido
Sencillo
Sensible
Reproducible
Sin Falsos Positivos/negativos
Costo-Rentable
Que aporte en las decisiones mdicas.
1 Cromosoma
4 084 genes
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db
=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSea
rch=21081&window=12310&begin=3811097
87 Mutaciones
27 Aminoacidos
Abebe G; Tuberculosis drug resistance testing by molecular methods: Opportunities and challenges in resource limited settings; Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 155160
516(11.5%)+526(22%)+531(59%)=92,5%
68,8%
Zhenhua
Yanga,T, Riza
Durmazb, Dong
Yanga, Selami
Gunalb, Lixin
Zhanga,
Betsy Foxmana,
Ahmet Sanicc,
Carl F. Marrsa,
Article in press
41,2%
87,5%
PERU 29 CEPAS
Escalante, Ramaswamy, Sanabria et al. Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru Tubercle and Lung Disease (1998) 79(2), 111118
Kits Comerciales
Roche COBAS Amplicor MTB test
GenProbe Amplified M. tuberculosis Direct test (AMTD)
BD ProbeTec-ET
Hain GenoType
Mycobacteria Direct assay (GTMD)
Roche COBAS TaqMan MTB (CTM) test
Cepheid Xpert MTB test
SEEGENE
Stephen D Lawn; Advances in tuberculosis diagnostics: the Xpert MTB/RIF assay and future prospects for a point-of-care test; Lancet Infect Dis 2013; 13: 34961
PCR
Karan K. Sra, MD,a Gisela Torres, MD, Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology, Journal of American Academy of Dermatology NOVEMBER 2005-749:765
GeneXpert MTB/RIF:
-Sistema completamente automatizado basado en cartuchos
Montaje de la prueba: 15 minutos
-Extraccin, Amplificacin y Deteccin del gen de inters
Duracin mxima: 1.30 horas
Interpretacin de resultados
-Un cartucho = una prueba/paciente
-Sistema modular de 1 a 16 posiciones: hasta 16 pruebas
distintas simultneas
PAGE | 18
A
53-
D
-3
-5
rpoB gene
5 Sondas para M TB
Las sondas no hibridizan con secuencias
mutantes
Molecular
Beacon
gen
Hybrid
PAGE | 20
Versiones Genexpert
G1: Umbral Delta Ciclo <3.5
G2: Umbral Delta Ciclo >3.5
G3 : Umbral Delta Ciclo >3.5
G4: Cambio de Probe B
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
Revision of Automated real-time nucleic acid amplification technology for rapid and simultaneous detection of tuberculosis and rifampicin resistance: Xpert MTB/RIF system. Policy statement.
Geneva, World Health Organization, 2011
Caso Clnico
85 year old woman with severe, necrotizing acute pneumonia, with suspected
TBC with 2 Acid-Alcohol resistant bacilus in 100 fields at microscopy. They
request a MTB/RIF GeneXpert in my laboratory and we saw an amplification of
one of the probes.
Results reported as negative by the software for not meeting criteria, but
we perform real time with light cycler for atypical mycobacterium and we
detect genome of atypical mycobacterium
CT: 36
Sistema GeneXpert
Infecciosas
Mycobacterium tuberculosis +
Resistencia a Rifampicina
Clostridium difficile
MRSA
Influenza A, H1N1,B
Streptococco Grupo B
No Infecciosas
Factor V-Factor II
BCR/ABL
Curva de Amplificacin
D
-3
-5
53PAGE | 30
PAGE | 31
Caso Clnico
D
-3
-5
53B
http://www.who.int/tb/laboratory/en/-15/3/16
2014
Xpert MTB/RIF implementation manual; Technical and operational how-to: practical considerations; WHO 2014
Situacin Clnica
Nro. de
Pacientes(Nro de
Estudios)
Sensibilidad
Especificidad
Gold Std.
Cultivo
Ref
Boehme C et al;
NEJM:2010
Sospecha de TBCTBC-MDR
1730
Sospecha de TBC
6673
99%: ZN(+)
80%: ZN(-)
91%:(1) C(+)
98.4% (RDR)
Boehme C et al.
Lancet;2011
Diagnostico Inicial
9008 (22)
88%(IC:84-92)
99%(IC:98-99)
Expert Group
Meeting report
ZN(-)
7151(23)
68% (IC:61-74%),
99% (IC:98-99%)
ZN(+)
1952 (23)
98% (IC:97-99%)
HIV(+)
1789(7)
79% (CI:70-86%)
79% (IC:70-86%)
RIF Resist
555/2624(17)
2414 (24)
95% (IC:90-97%)
98% (IC:97-99%)
TBC vs NTM
2626 (14)(180)
Situacin Clnica
TBC Extrapulmonar
en Adultos y Nios
Nro. de Pacientes
Sensibilidad
Especificidad
5922 (22)
Gold Std.
Ref
Cultivo
Expert Group
Meeting report
98.7%
Cultivo
Expert Group
Meeting report
98.7%
Cultivo
Expert Group
Meeting report
81.2% (IC67.7-89.9%)
98.7%
Cultivo
Expert Group
Meeting report
98.7%
Cultivo
Expert Group
Meeting report
98.7%
Cultivo
Expert Group
Meeting report
98%
Cultivo
Expert Group
Meeting report
TBC Infantil
(esputo inducido
Lavado Gastrico
2603(13)
2009-2011
Pulmonar
45%
Extrapulmonar
55%
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
7%
17%
93%
83%
NEGATIVO
POSITIVO
Sangre
6%
jugo gastrico
1%
mama
2%
cerebro
biopsia
0%
3%
ojo
2%
liquido pericardico
1%
liquido seminal
1%
Mdula Osea
0%
ganglio
LCR
absceso
ganglio
1%
liquido Ascitico
orina
Sangre
orina
13%
absceso
abseso
absceso paravertebral
mama
absceso
1%
liquido Ascitico
3%
jugo gastrico
abseso
0%
biopsia
Extrapulmonar
LCR
854
64%
Extrapulmonar
cerebro
ojo
liquido pericardico
liquido seminal
Mdula Osea
TIPO DE MUESTRA
TOTAL GENERAL
JUGO GASTRICO
GANGLIO
ABSCESO PARAVERTEBRAL
ESPUTO
ABSCESO
BIOPSIA
BAL
ASPIRADO BRONQUIAL
(EN BLANCO)
DESCONOCIDO
LIQUIDO PERICARDICO
LQUIDO PLEURAL
LCR
LIQUIDO ASCITICO
ORINA
NEGATIVO
POSITIVO
Total general
% Positivos
2272
6
8
4
318
8
33
296
108
102
21
11
111
800
42
170
289
4
5
2
87
2
8
71
20
10
2
1
10
53
2
8
2561
10
13
6
405
10
41
367
128
112
23
12
121
853
44
178
11%
40%
38%
33%
21%
20%
20%
19%
16%
9%
9%
8%
8%
6%
5%
4%
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
Genexpert
Pulmonares(n=232)
Cultivo
Positivo
Negativo
Positivo
36
6
Negativo
1
189
Total
37
195
Total
42
190
232
Sensibilidad
Especificidad
VPP
VPN
97%
97%
86%
99%
Sensibilidad
Especificidad
VPP
VPN
100%
96%
75%
100%
* 01 Mycobacterium no tuberculoso
Extra Pulmonares(n=78)
Genexpert
Positivo
Negativo
Total
Cultivo
Positivo
Negativo
9
3
0
66
9
69
Total
12
66
78
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
Pulmonares(n=229)
GeneXpert
Positivo
BAAR
Negativo
Total
Sensibilidad
56%
Especificidad
100%
Positivo
20
20
VPP
100%
Negativo
Total
16
36
193
193
209
229
VPN
92%
Sensibilidad
50%
Especificidad
100%
Extra Pulmonares(n=45)
GeneXpert
Positivo Negativo
BAAR
Total
Positivo
VPP
100%
Negativo
Total
3
6
39
39
42
45
VPN
93%
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
RIF RESISTENTE
Ao
TOTAL
% POSITIVIDAD
% DEL TOTAL
% DE LOS
POSITIVOS
2012
193
12%
2%
13%
2013
754
10%
1%
15%
2014
655
9%
2%
18%
2015
785
9%
2%
16%
2016
175
14%
4%
29%
TOTAL
2562
10%
2%
17%
2012
2013
2014
2015
0%
2016
LIMA
33%
2% LIBRE
PUEBLO
2% DE MIRAFLORES
SAN JUAN
2%
ATE
2%
SAN MIGUEL
2%
SAN ISIDRO
2%
JESUS MARIA
3%
SAN JUAN DE LURIGANCHO
3%
SAN BORJA
4%
SANTIAGO DE SURCO
7%
CALLAO
4%
LA MOLINA
4%
SAN MARTIN DE PORRES
MIRAFLORES
4%
4%
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
LIMA
VILLA EL SALVADOR
LA VICTORIA
CARABAYLLO
SANTA ANITA
COMAS
MIRAFLORES
JESUS MARIA
SANTIAGO DE SURCO
CALLAO
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
LIMA
INDEPENDENCIA
CAYMA
ANCON
SAN MIGUEL
SANTIAGO DE SURCO
PUEBLO LIBRE
LOS OLIVOS
ATE
LA MOLINA
BREA
EL AGUSTINO
CALLAO
COMAS
CARABAYLLO
Gmez de la Torre JC, Anlisis descriptivo y valor diagnstico de GeneXpert MTB7RIF en muestras procesadas en Laboratorios ROE-Lima 2012-2016;(Artculo en prensa)
Friedrich; Assessment of the sensitivity and specifi city of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment; Lancet Respir Med 2013; 1: 46270
GenoType MTBDRplus
GenoType MTBDRsl
GenoType MTBC
GenoType
Mycobacteria Direct
GenoType LepraeDR
GenotypeMTBDRplus en el Per
LUIS ASENCIOS; PRUEBA MOLECULAR GENOTYPE MTBDRplus, UNA ALTERNATIVA PARA LA DETECCIN RPIDA DE TUBERCULOSIS MULTIDROGORRESISTENTE; REV PERU MED EXP SALUD PUBLICA. 2012;29(1):92-98
Olga L. Sarmiento, Assessment by Meta-Analysis of PCR for Diagnosis of Smear-Negative Pulmonary TuberculosisJOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2003, p. 32333240 Vol. 41, No. 7
GENOTYPE MTBDR
RIFAMPICINA
Bwanga ; Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: a meta-analysis.; BMC Infect Dis. 2009 May 20;9:67
ISONIACIDA
GENOTYPE MTBDRplus
RIFAMPICINA
Bwanga ; Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: a meta-analysis.; BMC Infect Dis. 2009 May 20;9:67
ISONIACIDA
Yunting Gu; Xpert MTB/RIF and GenoType MTBDRplus assays for the rapid diagnosis of bone and joint tuberculosis; International Journal of Infectious Diseases 36 (2015) 2730
Sputum
Tracheal secretion
bronchoalveolar
lavage fluid (n=66)
pleural fluid (n=4),
Lymph node (n= 12), gastric
lavage fluid (n=11),
cerebrospinal/synovial
fluid/urine (n= 6), and
tissue biopsy samples
(n=7).
Bang D; Rapid genotypic detection of rifampin- and isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis directly in clinical specimens. J Clin Microbiol. 2006 Jul;44(7):2605-8.
BK(+)
BK(-)
Genotype MDR
GenXpert
Genotype
negativo a MTB
Genotype
Tipificacion de
Mycobacterias
atipicas
Tratamiento de
monoresistencia
Mono
resistente
Genotype MDR
(+)
GenXpert
GenXpert
(-)
(+)
Genotype
XDR
Genotype
I(Resistente)
R(Resitente)
Genotype
XDR
I(Resistente)
R(Sensible)
I(Sensible)
R(Sensible)
I(Sensible)
R(Resistente)
Caso Clinico
Paciente Varon de 23 aos
Inicia Tto Esquema I por TBC pulmonar
2do mes de tto persiste BAAR + con evolucin radiolgica trpida
Se decide hacer mtodos moleculares
TECNOLOGA SEEGENE
Principales Caractersticas de
la Tecnologa de Seegene
1. Ms de 50plex en PCR convencional o de punto final.
DPOTM
TOCETM
mTOCETM
1.
2.
1.
2.
Unin de
Polideoxiinosina
ADN molde
Sitio Target
(Molde artificial)
Beneficios de TOCETM
Porcin marcada
ADN molde
Target
mutante
Catcher
Target
silvestre
Pitcher especfico
para el mutante
Catcher
Sitio de
mutacin
Resumen de
la
Tecnologa
TOCE
ANYPLEX II MTB/MDR/XDR
SEEGENE
Matabane MM; Performance evaluation of three commercial molecular assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis from clinical specimens in a high TB-HIV-burden setting; BMC Infect Dis. 2015 Nov 9;15:508
Matabane MM; Performance evaluation of three commercial molecular assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis from clinical specimens in a high TB-HIV-burden setting; BMC Infect Dis. 2015 Nov 9;15:508
CASO CLINICO-IPBM
DETECCION DE REGIONES IS6110 PARA EL DIAGNOSTICO DE COMPLEJO
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
200 pb
163 pb
Lader
Control -
Paciente BK-
Control +
100 pb
.
Christian Baldeviano V1; Neyda Quispe T1; Csar Bonilla A2; Dauma Gastiaburu3; Jos Pro C3; Luis F. LlanosZavalaga1. Perfiles genticos (RFLP-IS6110) y resistencia a
drogas en aislamientos de M. tuberculosis de pacientes internados en un hospital referencial del Callao, Per, Rev. per. med. exp. salud
publica v.20 n.2 Lima abr./jun. 2003
PCR en Tejidos
Granulomas:
Sarcoidosis
Sifilis
Lepra
Enf. Crohn
Artritis Reumatoidea
LES
Pneumoconiosis
Kiran Chawla,PCR for M. tuberculosis in tissue samples, J Infect Developing Countries 2009; 3(2)83-87.
Factor de Inhibidores
Sabine Hofmann-Thiel, Evaluation of the hyplex TBC PCR test for detection of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples, BMC Microbiology 2010, 10:95
Laboratorio ROE-IPBM
Nro. de pasos
Nro. de Reactivos
Extraccin de DNA
16
10
Amplificacin y deteccin
Electroforesis
17
52
17
TOTAL
Fuente: BM-ME-05 Deteccin Molecular del Complejo Mycobacterium tuberculosis por amplificacin de la secuencia
IS6110 Rev 00
Amplificacin y deteccin
Extraccin de DNA
Electroforesis
Caso Clnico
10 aos de edad
Hermana de Pte de 14 aos con
TBC Pulmonar con mala
evolucin al tto
Bx:Tejido Insuficiente
Caso Clnico
Decisin Clnica
Inicio de Tratamiento TBC MDR
5 Frmacos
1 Inyectable por 6-9 meses
Caso Clnico
Cuestionamiento
Iniciar Tto sin evidencia
Histolgica-bacteriologica ????
Nueva Biopsia: Todo el ganglio
Biologia Molecular
PCR Convencional
-------
Control Interno
-------
Muestra Problema
-------
Control Negativo
-------
Control Positivo
Patologa Quirrgica
BK Positivo
Caso Clinico
Mujer 54 aos
Antec. de Inyeccin de colgeno
por Cirujano plstico hace 3
meses
Recibi Antibioticoterapia
multiple
Caso Clnico
PCR 16SRNA-rv0577
Decisin Teraputica
Caso Clinico
Cultivo
Que Paso????????????
Coinfeccin
Contaminacin del PCR
Contaminacin del
Cultivo
Actinomises israeli
Caso Clnico
Cultivo
Decisin Teraputica
PAGE | 31
Caso Clnico
Paciente Varn
35 aos
Nacido en Trujillo
Procedente de Lima
Profesin: Supervisor de productos odontolgicos
Antecedentes: Espondilitis Anquilosante. Dx Hace 8 aos sin
tratamiento. Osteoporosis Dx. hace 2 aos, sin tratamiento. Atrosis de
cadera bilateral operada hace 6 aos sin complicaciones
Caso Clnico
Tiempo de Enfermedad: 5 meses, Forma de inicio: Insidiosos, Curso:
Progresivo
Sntomas principales: Paciente refiere que observa aparicin de lesin
tumoral en pared torcica izquierda, blanda, no dolorosa, de 2 cm de
dimetro, mvil, de bordes definidos. Un mes despus del hallazgo
observa aumento de volumen de tumoracin, no asociado a otras
molestias. Evaluacin por medico particular y en ecografa indican
sospecha de tumor dependiente de pulmn. Referido a Oncologa
Mdica para estudio de lesin torcica
17/09/2014TAC Trax
Lesin Expansiva con coleccin a nivel pericostal anterolateral con proyeccin intercostal supra yacente a D/C
Neurofibroma necrosado vs Osteosarcoma
Lesin neoformativa pulmonar en segmentos 7 y 10 izquierdos. Ndulos hipodensos hepticos con calcificacin central.
Aparente engrosamiento gstrico.
01/11/2014Ex Torax
Lesin tumoral de 4cm de dimetro sobre pared torxica inferior izquierda, movil, no adherida a planos profundos, no
dolorosa, de consistencia blanda. No visceromegalias
04/11/2014Ingreso al Hospital
07/11/2014Ecografa doppler de hgado
08/11/2014TAC Abdominal
08/11/2014TAC Torax
Consultorio externo
Cuatro formaciones de aspecto metastsico
Imgenes compatibles con Colecciones Hepticas
Infiltrado Basal izquierdo. Ndulos Pulmonares
10/11/2014Biopsia de Piel
Material Nercrtico, Macrfagos, Infiltrado Inflamatorio agudo compatible con contenido de quiste abscedado.
10/11/2014Broncofibroscopa
10/11/2014Biopsia de pulmn
No neoplasia Maligna. Biopsia hepatica que muestra severa distorsion de la arquitectura con extensas areas de fibrosis,
acompaado de inflamacin crnica con formacin de ndulos linfticos, tendencia a formacin granulomatosa y
necrosis con destruccin de hepatocitos y parenquima con caracteristicas de nodulos regenerativos con metamorfosis
grasa a gota grande 40%. No se encuantra neoplasia maligna en las biopsias revisadas.
12/12/2014Transferencia a Neumologa
Proceso inflamatorio crnico granulomatoso severo de tejidos blandos, subcutneo, con numerosas clulas gigantes de
tipo Langhans y cuerpo extrao. La investigacin en luz polarizada no determina presencia de scolex o ganchos. Se
recomienda estudios complmentarios serolgicos para descarte de hidatidosis y cultivo de bacilo tuberculosos. BK:
Negativo
13/01/2015
Negativo para clulas tumorales. Material Necrtico asociado a infiltrado inflamatorio mixto y abundantes macrfagos
compatible con contenido qustico de proceso inflamatorio crnico.
TAC Torax
Cortesa: Dr Pecho-HNERM
TAC Torax
Cortesa: Dr Pecho-HNERM
Tac Abdomen
Cortesa: Dr Pecho-HNERM
Cortesa: Dr Pecho-HNERM
123 pb
Conclusin
Tuberculosis drmica
Tuberculosis Heptica
S/.
S/.
S/.
S/.
S/.
S/.
CSF
279.00
1,320.00
695.00
2,550.00
1,320.00
897.00
S/.
S/.
S/.
S/.
S/.
S/.
ESSALUD
117.00
352.00
144.00
511.00
352.00
70.00
S/.
3,300.00
S/.
442.00
S/.
S/.
897.00
897.00
S/.
S/.
195.00
656.00
S/.
385.00
S/.
207.00
S/. 58,500.00
S/. 54,000.00
S/. 40,500.00
S/. 165,540.00
S/.
S/.
S/.
S/.
21,420.00
2,880.00
40,500.00
67,846.00
S/.
S/.
S/.
S/.
30.10
150.50
30.10
150.50
5,500
1,100
2,254
451