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TIPOS DE CROMATOGRAFA

Existen diferentes criterios de clasificacin de la cromatografa:


Por la naturaleza de sus fases:

Cromatografa lquido - lquido


Cromatografa gas - lquido
Cromatografa lquido -. slido
Cromatografa gas - slido

Atendiendo al proceso qumico-fsico que va a protagonizar el proceso de separacin: siendo este el


criterio ms coherente de clasificacin:

Cromatografa de Adsorcin (lquido - slido o cromatografa de fases normales).

Cromatografa de Reparto (o lquido - lquido), se basa en las caractersticas de solubilidad


relativa de los solutos entre la fase mvil y una fase estacionaria de un lquido no polar. La fase
lquida se impregna a un soporte inerte de slice o, en el caso de cromatografa de fase
invertida, se une qumicamente.

Cromatografa de Intercambio inico.

Cromatografa de Exclusin.

Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:

Cromatografa plana:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina (TLC)

Cromatografa en columna:
Cromatografa de gases (GC)
Cromatografa lquida (LC)
-

cromatografa lquido - lquido


cromatografa slido lquido

CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Todas las cromatografas denominadas en columna se caracterizan por tener una fase estacionaria que se
encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de dimetro por la que se hace pasar una fase mvil
lquida o gaseosa que estar en permanente movimiento. Segn la afinidad de las molculas por la fase mvil
o la estacionaria, stas se separaran.
Despus de cada cromatografa se puede obtener informacin del cromatograma tanto cualitativa (para
identificar los distintos compuestos de la mezcla) como cuantitativa (para poder obtener la cantidad y
composicin de las sustancias separadas).
Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de dextranos (sefadex),
derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, slice, etc.
Existen distintos tipos de cromatografa en columna:
Cromatografa de intercambio inico: se basa en la afinidad de los iones en solucin por los sitios de
polaridad opuesta que se encuentran en la fase estacionaria.
Cromatografa de exclusin: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los
componentes de una mezcla de acuerdo al tamao y forma de las molculas.
Cromatografa de afinidad: se fundamenta en la especificidad de algunas macromolculas biolgicas. stas se
unen especficamente a la fase estacionaria y para separar dicha macromolcula, bastar con variar el pH una
vez que la columna este limpia y slo se encuentre de inters.
Cromatografa de adsorcin: se basa principalmente en las diferencias en la afinidad relativa de los
compuestos por el slido utilizado como fase estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi
exclusivamente por interacciones polares, siendo la fase estacionaria ms polar que la fase mvil.
Cromatografa de particin: la fase estacionaria es un lquido soportado en un slido inerte. Otra vez, la fase
mvil puede ser un lquido (cromatografa de particin lquido-lquido) o un gas (cromatografa de particin
gas-lquido, GLC). La cromatografa en papel es un tipo de cromatografa de particin en la cual la fase
estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografa de gases (GC) y de alta
resolucin (HPLC) son tcnicas de particin ampliamente empleadas.
Cromatografa de fase reversa: el mecanismo de separacin depende de interacciones hidrofbicas entre las
molculas de soluto en la fase mvil y el ligando hidrofbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza
actual de las interacciones de unin hidrofbica asume que la interaccin de unin es el resultado de un
efecto entrpico favorable. Las condiciones iniciales de unin de la fase mvil usadas en la cromatografa de
fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las
molculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se une al ligando hidrofbico
inmovilizado disminuye el rea hidrofbica expuesta hacia el disolvente. As, el grado de organizacin de la
estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropa en el sistema

CROMATOGRAFA PLANA
La mayora de los principios que se aplican para la cromatografa en columna se aplican tambin a la
cromatografa en superficie plana.
Cromatografa en capa fina (TLC)
Para la cromatografa en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de partculas de unos milmetros de
espesor, fijadas sobre un soporte slido generalmente de aluminio, plstico o vidrio. Despus de aplicar el
analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la separacin.
La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultneamente la muestra y el patrn, mientras que en la
cromatografa en columna las muestras se analizan individualmente. Adems, las muestras que son difciles de
separar, se pueden resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en direcciones
perpendiculares.
Otra ventaja es que, si los componentes no se pierden en los vapores que rodean la placa, todos estarn en
algn lugar de la misma, mientras que en la cromatografa en columna algunos componentes no eluyen y se
pierden. Y a esto se suma que la placa de TLC se usa una sola vez, por lo que se pueden utilizar condiciones
severas de separacin.
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con relacin a la distancia recorrida
por la fase mvil. El grado de retencin en cromatografa plana de superficie se expresa como el factor de
retardacin, o ndice de retencin Rf:
=

El frente del disolvente es el lmite alcanzado por la fase mvil, en ste se mide la distancia en que se ha
desplazado ste. El valor de Rf depende de las mismas condiciones experimentales que el valor de K de la
cromatografa en columna: la composicin de la fase mvil, el tipo de fase estacionaria, la temperatura y el
tipo de compuestos separados.
Tambin se puede definir el coeficiente de distribucin, K, en trminos de la concentracin del soluto en la
fase mvil, Cm, y en la fase estacionaria, Cs:

La deteccin y localizacin de las manchas en la placa de TLC se hace observando los cambios en la
fluorescencia, o absorcin en el U.V., de un indicador que se incorpor a la fase estacionaria. Toda la placa
fluoresce bajo luz UV cuando no hay solutos presentes. Los lugares en los que reside el soluto aparecen como
manchas oscuras. Tambin podemos observar el color de los compuestos despus de reaccionar con reactivos
especficos para grupos o metales, rociados sobre la placa, como la fluorescamina para aminas.
Existen instrumentos para determinar directamente la fluorescencia y/o color de las manchas en la placa. Los
instrumentos deben ser capaces de cuantificar la medida sobre el rea total de la mancha.

Cromatografa en papel
En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se utiliza es de celulosa. La
celulosa es muy polar en el agua y se vuelve electronegativa. El papel tiene propiedades de intercambio inico
dbiles, as como de adsorcin.
La mayora de las propiedades varan de papel a papel, lo que provoca variaciones en el Rf. Actualmente
existen papeles modificados con resinas cambiadores de iones, almina, etc. El aparato que se usa consta de
un soporte para el papel, un recipiente para el disolvente y una cmara hermtica para desarrollar el
cromatograma. La cmara hermtica es necesaria para evitar la evaporacin de los disolventes voltiles
debido a la gran superficie del papel expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de elucin se aplica
la muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un pequeo volumen.
El papel debe estar en equilibrio con los vapores del disolvente antes de empezar el desarrollo. La
cromatografa en papel se ha aplicado con buen xito a problemas de qumica orgnica e inorgnica y de
bioqumica.
CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
La separacin en la cromatografa de intercambio inico depende la adsorcin reversible de molculas de
soluto cargadas, a una resina con grupos inicos de carga opuesta. El mecanismo de separacin se basa en un
equilibrio de intercambio inico. Muchos de los experimento de intercambio inico se llevan a cabo en cinco
etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador inico se encuentra en las condiciones
apropiadas de pH y fuerza inica, lo que permitir la unin de las molculas de soluto. En este estado inicial,
los grupos que se intercambiarn estn asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o
cationes simples, como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicacin de la muestra y su adsorcin, en la cual las molculas del
soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen reversiblemente al
gel. Las substancias que no se unen son eludas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorcin de la muestra cambiando las condiciones de elusin, al
desfavorecer la formacin del enlace inico de las molculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto
normalmente se logra aumentando la fuerza inica del buffer de elusin o cambiando su pH.
En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remocin de sustancia no eludas bajo las condiciones
experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificacin.
La separacin de diferentes sustancias se lleva a cabo porque stas tienen diferentes grados interaccin con el
intercambiador inico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su
superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza inica y el pH. Las
diferencias en propiedades de carga de compuestos biolgicos son a menudo considerables, y tomando en
cuenta que la cromatografa de intercambio inico es capaz de separar especies con propiedades poco
diferentes.
Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio inico en una columna, mediante un procedimiento en
lote o por adsorcin en cama extendida.

La matriz. Un intercambiador inico consiste de una matriz slida insoluble a la cual se unen de forma
covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones mviles. Estos contra-iones pueden
intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.
La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones tambin. Los intercambiadores cargados
positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por
lo que son llamados intercambiadores aninicos. Intercambiadores cargados negativamente tienen contraiones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores catinicos.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgnicos, resinas sintticas o polisacridos. Las caractersticas
de la matriz determinan sus propiedades cromatogrficas tales como su eficiencia, capacidad y recuperacin,
as como su estabilidad qumica, fuerza mecnica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectar su
comportamiento hacia sustancias biolgicas y el mantenimiento de la actividad biolgica
Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un intercambiador
inico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador inico; su nmero total y
disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para usarse en
intercambiadores inicos; algunos de estos se muestran a continuacin.

Se usan los grupos sulfnico y amino cuaternario para formar intercambiadores inicos fuertes, los otros
grupos formar intercambiadores inicos dbiles. Los trminos fuertes y dbiles se refieren a la extensin de
variacin de ionizacin con pH y no a la fuerza del enlace. Los intercambiadores inicos fuertes estn
completamente ionizados en un amplio rango de pH mientras que con los intercambiadores inicos dbiles, el
grado de disociacin y la capacidad de intercambio varia ms marcadamente con el pH.
CROMATOGRAFA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC)
Fundamentos y principios bsicos
El proceso cromatogrfico puede ser considerado como: un conjunto de fuerzas que compiten de manera
selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte, fijarlo al relleno de la columna o fase
estacionaria, o llevarlo disuelto en los lquidos que fluyen a travs de la columna o fase mvil. Los distintos
tipos de fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografa.

En la cromatografa de reparto se utilizan fases estacionarias polares (slice, almina, hidroxiapatito) y fases
mviles apolares (ciclohexano, isooctano, tetracloruro de carbono, etc.), aplicndose a la separacin de
solutos apolares. El origen de la retencin es, por tanto, la interaccin de los grupos polares de los analitos con
los grupos polares de la superficie del relleno.
En la de particin la fase estacionaria es lquida, es necesario ligarla o embeberla sobre partculas inertes
(generalmente de slice) para que permanezca fija en la columna. Hoy en da los grupos funcionales se fijan
mediante enlace qumico a las partculas de relleno, lo que permite a la fase estacionaria resistir las altas
presiones aplicadas en HPLC.
Hay dos posibilidades en la cromatografa de particin: cromatografa en fase normal (cuando la fase
estacionaria es polar, por ejemplo si contiene grupos ciano, diol, amino o dimetilamino) y cromatografa en
fase inversa (cuando la fase estacionaria es apolar, por ejemplo con grupos C8 C18). La cromatografa de
particin en fase inversa es la ms utilizada de todas las tcnicas HPLC, pues las fases mviles polares
permiten separar una amplia variedad de compuestos de inters bioqumico, farmacolgico o qumico. En fase
inversa la retencin esta basada en una atraccin primaria entre la fase estacionaria y la regin no polar del
analito. El orden de elucin es de hidroflico a hidrofbico, de polar a no polar. Para aumentar la retencin de
un compuesto, es necesario aumentar la polaridad de la fase mvil. La fase estacionaria ms comn es C18.
Las fases mviles ms comunes son; acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano, etc. con agua como componente
de la fase mvil.
En cromatografa de intercambio inico la fase mvil compite con la estacionaria por los solutos mediante
fuerzas inicas. La limitacin es que el soluto sea inico (un anin o un catin). Se trata de una tcnica muy til
para separar iones inorgnicos, protenas, etc. Mediante supresin inica se separan compuestos inicos,
suprimiendo (o reduciendo) su estado inico en solucin a travs del control del pH, de manera que quedan
ms retenidos en rellenos de fase reversa. Se trata, por tanto, de adaptar la cromatografa de particin en fase
reversa a la separacin de mezclas que contienen uno o varios compuestos ionizables. Funciona bien para
cidos dbiles y bases dbiles. Otro tipo es la cromatografa de pares inicos que se forma al pasar una fase
mvil polar que contiene un contrain de carga contraria a la de los solutos, se suele aadir a la fase mvil un
catin o un anin hidrofbico, que interacciona con el analito formando el par inico.

La cromatografa de exclusin molecular separa los solutos en funcin de su tamao molecular. El principal
inconveniente es que se trata de un mtodo de baja resolucin. No obstante, es muy til para la separacin de
protenas y otras molculas de alto peso molecular. Es importante que no haya interaccin entre la fase
estacionaria y la muestra.
Las reglas bsicas en HPLC son cuatro:
1. Fase mvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta.
2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase mvil (es decir, polaridad similar).
3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagacin).
4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migracin diferencial).
La elucin de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la
fase mvil a travs de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porcin de
muestra se introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se distribuyen por s
mismos entre las dos fases segn la naturaleza qumica de stos con respecto a las fases mvil y estacionaria.
Adiciones posteriores del disolvente llevan a las molculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que
salen de ella en una tiempo determinado (tx).
La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fraccin de tiempo que ha necesitado para salir de la
columna, tiempo que es detectado por un detector. Esta velocidad ser pequea para solutos fuertemente
retenidos por la fase estacionaria, y ser grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase mvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la seal se transforma en una grfica en funcin del
tiempo denominada cromatograma. El cromatograma discurre horizontalmente paralelo a la escala de
tiempos (lnea de base), zona que informa de las condiciones generales del sistema en ausencia de solutos.
Luego se observa un brusco incremento sobre la lnea base, seguido de un descenso ms o menos simtrico
que enlaza con la continuacin de la misma (pico cromatogrfico).
Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho, casi una lnea vertical. Pero muchas veces presenta una
anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de una gaussiana. Tambin se presenta una primera banda
peculiar ascendente-descendente (frente del disolvente o frente de inyeccin), no siempre observable, y que
suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del sistema o tiempo necesario para que un fluido sin retencin
atraviese fsicamente la columna, tubos, etc. del sistema.
Las molculas de un mismo soluto, pese a hallarse sometido a las mismas fuerzas, no eluyen todas al mismo
tiempo, sino obedeciendo a un modelo gaussiano.
Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posicin en el eje) como
cuantitativamente (rea bajo los picos) los componentes de la muestra.
La cromatografa cuantitativa se basa en una comparacin de la altura o del rea del pico de un analito con el
de uno o ms estndares. Ambos parmetros varan linealmente con la concentracin. La cromatografa
cualitativa se basa en la comparacin de la posicin de los picos (tiempos determinados de retencin) con
cromatogramas estndares.

La efectividad de la columna cromatogrfica para la separacin de solutos depende de las velocidades


relativas a las cuales las especies son eludas. La eficiencia mxima para la cromatografa lquida ocurre a muy
bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamao de la
partcula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase mvil o se incrementa la temperatura.
En una primera etapa, la cromatografa de lquidos se llevaba a cabo en columnas de vidrio con dimetros de
1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partculas de la fase estacionaria no superaban las 150-200 m de
dimetro a fin de asegurar unos caudales razonables. Incluso as, los tiempos de separacin eran largos,
podan llevar varias horas.
La cromatografa lquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid Chromatography) es el mtodo ms
sofisticado y moderno de la cromatografa lquida, que utiliza partculas de fase estacionaria para el interior de
la columna con dimetros muy pequeos para aumentar la eficiencia, en torno a 3-10 m. As, se ha
conseguido reducir el tamao de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10 mm de dimetro en la HPLC, y el
tiempo necesario para la separacin.
Aplicaciones
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un
tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condicin, es imprescindible que la muestra
sea soluble en un disolvente, al ser la fase mvil un lquido.
Es especialmente adecuada para compuestos poco voltiles , termolbiles e inicos. Algunas aplicaciones
incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas, cidos nuclicos, hidrocarburos, carbohidratos,
frmacos, terpenos, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una gran variedad de
sustancias inorgnicas.

Ejemplos de utilizacin de HPLC:


- Deteccin y cuantificacin de cafena y teobromina que son alcaloides muy importantes en el caf, t y el
cacao, especialmente por su accin estimulante. El contenido de estos compuestos se utiliza para evaluar su
calidad. (Deteccin UV)
- Determinacin de azcares. La analtica de carbohidratos no resulta fcil pues presenta acumulacin de
grupos funcionales iguales, los grupos hidroxilo, y adems posee gran nmero de esteroismeros. Tras una
dilucin los azcares se separan cromatogrficamente por medio de HPLC en una fase amnica. (Deteccin IR)
- Determinacin cuantitativa de polisacridos como el almidn, las dextrinas, los dextranos, el glucgeno, la
inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas, as como sustancias mucilaginosas de algas marinas y las
gomas vegetales.
- Deteccin de ciclomato en jugos de fruta.
- Separacin de steres de cidos grasos por fase inversa y con argentizacin de columnas (Silicato de Al con
Ag).
- Separacin de Triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de insaturacin por fase inversa y detector
de dispersin luminosa, para el estudio de aceites y grasas adulteradas.
- Determinacin del contenido de Vit A y sus precursores ( y caroteno) en margarina y aceites de hgado por
fase inversa.
- Determinacin del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase normal.