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CURSO DE POSTGRADO DE MEDICINA

Técnicas de Biología Celular y Molecular Utilizadas
en Investigación Científica Básica y Aplicada

PROTOCOLOS

ACTIVIDAD PRÁCTICA Nº 1

♦ Pre-inclusión La parafina penetra en los vasos. a 1 h Alcohol 100% (2) 30 min. ♦ Hacer bolsitas de gasa. a 1 h Alcohol 90% 30 min. colocar los tejidos con sus identificaciones y atarlas con hilo de algodón.05 M (PBS) durante 6 horas.Clarificar las muestras en dos pasajes sucesivos por Xilol o Benzol durante 30 minutos a 1 hora en cada uno de ellos. ♦ Confección del bloque .Recoger los cortes con pincel de pelo de marta en una cápsula de Petri que contenga agua destilada a temperatura ambiente. ♦ Corte . . ♦ Deshidratación La finalidad de este paso es eliminar el agua de los tejidos. . a 1 h Alcohol 95% 30 min.Colocar la pieza en un molde rectangular que contiene parafina fundida.Colocar las muestras en una serie de alcoholes de graduación creciente de la siguiente manera: Alcohol 70% 30 min.Sumergir las bolsitas en parafina fundida y se dejan 2 horas dentro de la estufa a 60º. con su correspondiente identificación.Enfriar el bloque y la cuchilla . respetando la proporción recomendada de fijador/muestra (20/1). . .Echar agua caliente por los bordes de la placa de Petri para “planchar” los cortes.INCLUSIÓN EN PARAFINA ♦ Cortar el material en trozos pequeños ♦ Fijación Este paso permite conservar la morfología y la composición de los tejidos. .Colocar en micrótomo y cortar de aproximadamente 4 o 5 µm. COLORACIÓN CON HEMATOXILINA/EOSINA ♦ Desparafinización e hidratación Sumergir los portaobjetos en distintos frascos de siguiente forma: . los espacios intercelulares e intracelulares haciendo más fácil la obtención de cortes en el micrótomo.Dejar secar en estufa a 50º C. . a 1 h Alcohol 100% (1) 30 min. Se sumergen los tejidos en solución de formol al 4 % con buffer fosfato 0.Colocar en otra parafina fundida y dejar allí aproximadamente 2 horas más. a 1 h (el tiempo dependerá del tamaño del material) ♦ Aclaración Consiste en embeber la pieza con una sustancia miscible con la parafina . ♦ Inclusión .Montar en portaobjetos. ♦ Lavar el material fijado con PBS.

♦ Lavar el osmio con agua destilada.3 68 ml. . 90%.Xilol (1) Xilol (2) Etanol Absoluto (1) Etanol Absoluto (2) Etanol 95% Etanol 70% Agua destilada 5 5 5 3 3 3 3 minutos minutos minutos minutos minutos minutos minutos ♦ Coloración . Agua destilada 60 ml. ♦ Fijar con solución de Karnovsky modificada (Formol al 4% y Glutaraldehído al 2%) por lo menos 4 hs.Hacer dos cambios en alcohol 100% .Montar con bálsamo de canadá o entellán. ♦ Lavar el fijador con agua destilada. Solución A: Formol al 8% Formol 25 % 32 ml. ♦ Postfijación con Osmio Embeber el material con Tetróxido de Osmio al 1 % diluido en cacodilato 2 horas a temperatura ambiente en rotor. estos rótulos deben ser deshidratados juntos con la muestra. Solución B: Glutaraldehído al 4% Glutaraldehído 10% 40 ml. . ♦ Deshidratación .Hacer dos cambios en Xilol.Colocar los materiales en frascos pequeños y sobre ellos se van haciendo cambios de acetona de graduación creciente Acetona 50% 5 minutos Acetona 75% 5 minutos Acetona 90% 10 minutos Acetona 100% 15 minutos Acetona 100% 15 minutos . Este paso debe hacerse bajo campana pues el Osmio es muy tóxico. Buffer Cacodilato pH 7. 95%) . .Sumergir en la eosina 30 segundos. ♦ Deshidratación y montaje . dos o tres lavados.Virar en agua corriente durante 5 minutos.Colocar los portaobjetos en el frasco con hematoxilina resguardado de la luz aproximadamente un 1minuto y medio. ♦ Hacer rótulos para cada taco con el nombre del material.Deshidratar en serie de alcoholes de graduación creciente (70%. Mezclar en partes iguales solución A y B en el momento de usar.Retirar el exceso con agua destilada . INCLUSIÓN EN RESINAS EPOXI ARALDITA ♦ Cortar el material en trozos pequeños.

.Cortar los tacos con un espesor entre 90 a 120 nm. .Acelerador dimetilaminobenceno (BDMA)(2. 0. El material debe ir en la parte distal de cada taco.Embeber en una mezcla de partes iguales del medio de inclusión y acetona 100% y dejar en rotor 3 horas como mínimo.Secar el excedente sin lavar.Araldita 506 (48. ♦ Pre-inclusión plástico puro .Desecar en una platina térmica para lograr la adhesión del corte al vidrio.5%) .Realizar en mezcla completa de Araldita a temperatura ambiente durante 6-8 horas. . . .Diobutilftalato (DBP) (0. (color oro pálido). colocando el rotulo de cada material en la parte central. 0.Incluir en un molde plástico con Araldita.Colocar una gota de H2O2 al 3% en metanol por 5 min.Tratar los cortes con suero normal de cabra al 5% en PBS leche al 1. . ♦ Inclusión .Recoger los cortes con un pelo y colocarlos sobre una gota de agua destilada en un portaobjeto. ♦ Corte fino . ♦ Preparación de la Araldita La mezcla está compuesta de: .Dejar el molde en estufa de 60º por 48 horas por lo menos. . TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA PARA DETECCIÓN DE PROSTATIC BINDING PROTEIN (PBP) ♦ Desparafinización e hidratación.Realizar 2 lavados con en PBS durante 5 minutos ♦ Bloqueo de uniones no específicas .5%) 5 ml. ♦ Incubación con anticuerpo primario . .Montar los cortes con una grilla sostenida con una pinza. ♦ Corte semifino .Tallar el extremo del taco en forma de pirámide bajo lupa del ultramicrótomo. 5 ml. .5%) .Colorear los cortes montados con Azul de toluidina al 1% sobre una platina a 70º C. .Guardar las grillas con los cortes finos en un porta-grillas. incubando durante 30 minutos a temperatura ambiente.Contrastar con Acetato de Uranilo y Citrato de Plomo. ♦ Bloqueo de la actividad de la peroxidasa endógena .Acetona 100% 15 minutos Las Acetonas 100% deben ser destiladas y deshidratadas sobre tamiz molecular Nº 3 (Merk). ♦ Infiltración con plástico-acetona .Realizar cortes semifinos de aproximadamente entre 240 a 280 nm. . de espesor.Anhídrido dodecenilsuccínico(DDSA)(48.5%.Colocar en el porta espécimen del ultramicrótomo y ajustarlo.5%) .125 ml. 25 ml.

Colocar 50 µl sobre el corte y cubrir con film.Poner los vidrios en agua corriente . .Buffer Tris-HCl pH: 6.) en oscuridad y hasta que aparezca la marca.Incubar con DAB. Composición del buffer muestra: .Lavar bien con PBS ♦ Sistema de revelado Antisuero secundario .Lavar con agua destilada .ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol .En este caso se utilizará anticuerpo anti PBP.azul de bromofenol .2 M pH 7.Lavar con agua destilada. .8 (4x) Preparación de los geles de poliacrilamida .Colocar sobre el corte e incubar 30 minutos a temperatura ambiente.Lavar bien con PBS.Deshidratar los cortes en alcoholes de graduación creciente .6 al que se le agrega 50 µl de H2O2 al 3% diluido en agua destilada. .SDS . Calentar en baño de agua a 95 ºC durante 5 minutos.Agregar solución de montaje y montar con cobre-objetos. .Tratar los portaobjetos con hematoxilina durante 30 segundos.6. Para ello se realiza una dilución 1/6000 en PBS-BSA al 1%. ♦ Contracoloración . de TRIS-HCl 0.Incubar 1 hora a temperatura ambiente . Sistema amplificador de señal ABC . .H2O2 (2..Se utiliza un anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado en una dilución de 1:150 en PBS .5 mg.Frenar la reacción lavando con agua destilada.2 M pH 7. Tratamiento de la muestra Colocar 100 µl de muestra con 20 µl de buffer muestra en un tubo eppendorff. Revelado . TÉCNICA DE WESTERN BLOT Dosaje de proteínas Dosar la cantidad de proteínas presentes en la muestra mediante el método de Bradford.Realizar una dilución de 1/100 en PBS .Sumergir luego en 2 Xiloles . .Lavar con PBS y luego con TRIS-HCl 0. de DAB en 4 ml. ♦ Deshidratación y montaje .Incubar 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda y luego toda la noche a 4º C.

33 ml .TEMED: 15 µl Antes de preparar el gel colocar los peines con la cantidad de calles a sembrar (en general 10). Gel de corrida (15 %) - H2O bidestilada: 6.persulfato de amonio 1 % (preparado en el momento de usar): 75 µl . Para verificar una correcta transferencia colorear las proteínas utilizando una solución de rojo ponceau (0.5 ml Tris-HCl pH:6.2 cm x 10 mm (vidrio externo) y 7.5 ml Tris-HCl pH:6. Cerrar el panel de transferencia y aplicar una corriente constante de 300 mA durante 60 minutos.5 µl TEMED: 11.75 ml SDS 10 %: 150 µl acrilamida (29. Stacking gel (4 %) .8 %): 1. Transferencia Eliminar el stacking gel y colocar los geles de corrida en el panel de transferencia entre dos papeles de filtro con la membrana de nitrocelulosa (o PVDF) de manera que quede orientada hacia el polo positivo.2 cm x 10 cm (vidrio externo).1 ml .H2O bidestilada: 6.3 % en acético al 1 %).5 mm de espesor empleando vidrios de 8.025 ml 2. Secar y preparar el stacking gel. Sembrar el volumen de muestra correspondiente a la cantidad de proteínas calculada.8: 2.SDS 10 %: 100 µl .2%)-bis/acrilamida (0.Las cantidades expresadas son suficientes para preparar 2 geles de 1. Una vez transcurrido el lapso de tiempo programado quitar la membrana de nitrocelulosa y realizar un lavado con buffer fosfato salino (PBS).8: 3. Esperar 20 minutos hasta observar la aparición de la fase gel y proceder al lavado del alcohol.acrilamida (29.8 %): 5 ml persulfato de amonio 1 % (preparado en el momento de usar): 112. sembrar marcador de peso molecular y aplicar una corriente constante (30 mA). Remover el colorante con lavados sucesivos empleando PBS. Controlar el frente de corrida y detener la electroforesis antes de llegar al borde inferior del gel. Inmunodetección de la proteína en estudio . Electroforesis Colocar los geles en la cuba electroforética y agregar buffer de corrida en cantidad necesaria.25 µl Una vez preparado el gel se coloca entre los vidrios (hasta aprox. 5 cm de altura) y se agrega isopropanol (200 µl por gel) para una correcta polimerización.2.5 ml .2%)-bis/acrilamida (0.

Colocar la membrana entre dos films transparentes dentro de la caseta de revelado.Quitar la placa de revelado con cuidado y colocarla en el reactivo revelador. 5. 2.Incubación con anticuerpo primario: Incubar las membranas durante 2h en una dilución adecuada de anticuerpo primario en buffer de bloqueo a temperatura ambiente. ácido acético al 5-8 % y fijador) en recipientes adecuados.Preparar reactivo quimioluminiscente (ECL o SuperSignal) de acuerdo a lo indicado por el fabricante. Finalmente.Colocar reactivos de revelado fotográfico (revelador.Bloqueo: Incubar las membranas en un recipiente adecuado durante 1h en solución de PBS-Tween 0.1 %-Leche descremada 5 % (buffer de bloqueo) a temperatura ambiente. Revelado con quimioluminiscencia El revelado con quimioluminiscencia se lleva a cabo en un laboratorio fotográfico en oscuridad siguiendo los siguientes pasos: 1.1 % durante 30 minutos (aproximadamente 5 cambios de solución de lavado). Los pasos 5-6 con ilumincación de lámpara roja.Escurrir la membrana a revelar e incubar con reactivo quimioluminiscente durante 1 minuto a temperatura ambiente..Incubación con anticuerpo secundario: Incubar con una dilución adecuada de anticuerpo secundario acoplado a enzima (generalmente peroxidasa) diluido en buffer de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. . .Lavado: Lavar las membranas con PBS-Tween 0. 7. dejar en la misma el tiempo necesario (dependiendo del antígeno a analizar) 6. Densitometría Sobre las bandas obtenidas (por triplicado para cada experimento) se hace un análisis densitométrico aplicando el software Scion Image. .1 % durante 30 minutos (aproximadamente 5 cambios de solución de lavado). al observar la aparición de bandas detener la reacción con solución de ácido acético y colocar en fijador de 2 a 5 minutos. . proporcional a la intensidad de la banda (y por lo tanto a la concentración de proteína en la muestra). . NOTA: Los pasos 1 a 4 se llevan a cabo con luz natural.Lavado: Lavar las membranas con PBS-Tween 0.Colocar placa fotosensible sobre la membrana (que se halla bajo el film transparente) y cerrar la caseta. El valor obtenido corresponde a un área debajo de la curva.Lavar la placa de revelado con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente. 3. 4. con los datos obtenidos aplicamos un método estadístico acorde al diseño experimental ejecutado y expresamos los resultados gráficamente empleando un software apropiado (Sigma Plot o Infostat).

250 uL Trypan Blue..TECNICA DE CULTIVO DE CÉLULAS ADENOHIPOFISARIAS -Decapitar los animales... varias veces...... -Agregar la tripsina con pipeta pasteur e incubar en dubnoff a 37º C durante 20 min.. ..... -Preparar un tubo de Khan para analizar el rendimiento y la viabilidad celular: Suspensión celular............. -Agregar el inhibidor de tripsina e incubar en dubnoff 3 min...50 uL SMEM. -Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.... Centrifugar a 1000 rpm durante 3 min. con agitación.. Transferir con la última pasteur al tubo de centrífuga con medio Dulbecco. -Suspender las células con medio SMEM para tener una concentración final de 106 células/ml.. de SMEM (sin resuspender) -Centrifugar a 1000 r. extraer las hipófisis y colocarlas enteras en una cápsula de petri con medio de cultivo............. -Pasar con pinza estéril a una cápsula de petri plástica y cortar el conjunto de glándulas en varios sentidos......p.... de medio SMEM... -Transferir a uno de los tubos de centrífuga con pasteur el material incubado con tripsina del vial. SMEM..... Transferir al vial.. -Decantar y agregar 5 ml.000 y por los mililitros de la suspensión obteniendo el Nº total de células.. -Trasvasar las hipófisis con pinza estéril a un vial siliconado con 5 ml...............200 uL -Cargar en una cámara de Neubauer una gota de la suspensión.m... aspirar y expeler nuevamente con pipetas pasteur.... -Dispersión mecánica con pipetas Pasteur: Aspirar y expeler con pasteur flameadas de calibre cada vez menor cinco a seis veces con cada pipeta.... (el sobrenadante queda turbio por lípidos) -Decantar y resuspender en SMEM....... durante 3 min.... Este número se lo multiplica por 100.. Hasta 30 hipófisis por cápsula... Se cuentan los 4 campos grandes y se saca un promedio. -Transferir a un tubo de centrífuga con pipeta pasteur -Centrifugar a 1000 rpm durante 1 min......

de Dulbecco a cada well. -Agregar 2 ml. de suspensión de células en cada well de 35 mm.4% 20` 37º C Hipófisis anterior Dispersión enzimática Dispersión mecánica Siembra 5 x 10 5 células 2 ml Dulbecco Dispersión celular .5 ml. tripsina 0. -Cambiar el medio de cultivo a las 72 horas y luego cada 24 horas hasta finalizar los experimentos.-Sembrar 0.