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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA


CURSO DE FARMCIA E BIOQUMICA
PROFESSOR CARLOS ROBERTO MERLIN

APOSTILA DE AULAS PRTICAS


DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA II

FLORIANPOLIS
SEMESTRE 2009.2

Sumrio
Normas de trabalho no laboratrio de microbiologia............................................ 03
Aula 1 Meios de cultura..................................................................................... 04
Aula 2 Tcnicas de cultivo................................................................................. 06
Aula 3 Gram Gram positiva e Gram negativa................................................. 07
Aula 4 Esterilizao e Desinfeco....................................................................09
Aula 5 Microscopia a fresco.............................................................................. 11
Aula 6 Antibiograma.......................................................................................... 12
Aula 7 Cocos Gram positivos............................................................................ 13
Aula 8 Anlise do ndice colimtrico da gua.................................................... 16
Aula 9 Enterobactrias.......................................................................................19

Normas de trabalho no laboratrio de microbiologia


1. Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos na estante, na
entrada do laboratrio, e nunca sobre as bancadas de trabalho;
2. Usar guarda-p adequado e limpo;
3. Lavar as mos com detergente antes e depois da aula prtica. Se for portador
de algum ferimento nas mos, no participar das atividades prticas;
4. Antes de iniciar os procedimentos, identificar os materiais que sero utilizados
nas anlises;
5. NUNCA pipetar nada com a boca;
6. No comer, beber ou fumar no laboratrio;
7. Evitar colocar a mo na boca, olhos e ouvidos durante a aula;
8. Prender cabelos longos para evitar exposio ao fogo da chama do bico de
Bunsen;
9. Nunca aplicar maquiagem e cosmticos ou retirar lentes de contato no
laboratrio;
10. Avisar o professor em caso de contaminao acidental, ferimentos ou cortes
ocorridos durante a aula;
11. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os
deixando sobre a bancada;
12. Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.
13. Limpar a bancada aps finalizar as anlises.

Aula 1
Meios de Cultura

Meios de Cultura: so substratos adequados ao crescimento, multiplicao e


desenvolvimento dos microrganismos fora de seu hbitat natural.

O cultivo dos microrganismos exige que determinadas condies sejam


atendidas. As exigncias nutritivas e ambientais so variveis com o tipo de
microrganismo, tornando impossvel a produo de um nico tipo de meio que
satisfaa todas as condies de todos os tipos de microrganismos. Por outro
lado, difcil e impraticvel a formulao de um meio de cultura ideal para
cada tipo de microrganismo.

No preparo de um meio de cultura necessrio conhecer as exigncias


nutricionais dos microrganismos. So considerados meios essenciais do meio
de cultura:
- Fonte de energia
- Fonte de Carbono
- Fonte de Nitrognio
- Fatores de crescimento
- Fonte de minerais
- gua

Ainda, alm dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condies
ambientais:
- pH
- Atmosfera
- Presso osmtica

Classificao dos meios:

1. Quanto origem:
a) Naturais
b) Artificiais
2. Quanto composio:
a) Complexos
b) Sintticos
3. Quanto ao estado fsico:
a) Lquido
4

b) Semi-slido
c) Slido
4. Quanto finalidade:
a) Meios Bsicos
b) Meios Seletivos
c) Meios Diferenciais
d) Meios de enriquecimento
e) Meios enriquecidos
f) Meios de manuteno
g) Meios de transporte

Aula 2
Tcnicas de Cultivo

A inoculao de microrganismos pode ser em:


- Meio lquido
- Meio slido
- Meio semi-slido
- Na placa de Petry

Procedimentos

1. Para repique da placa para meio lquido


Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que
evitem a contaminao;
Esterilizar a ala de platina na chama do bico de Bunsen e esfri-la em tubo
com gua destilada ou prximo chama (ou no prprio meio de cultura lquido);
Flambar os bordos da placa na chama do Bico de Bunsen;
Abrir a placa de forma que a tampa fique perpendicular ao fundo;
Introduzir a ala de platina na placa, tocando a colnia escolhida;
Fechar a placa;
Retirar a tampa do tubo com meio de cultura lquido, segurando-o com o dedo
mnimo;
Flambar a boca do tubo e mant-la prxima ao bico de Bunsen;
Introduzir a ala de platina carregada no meio de cultura;
Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa;
Esterilizar a ala de platina e recoloc-la no suporte;
Identificar o material e colocar seu nome e turma;
Incubar a 37 C;
Realizar a leitura.
2. Para repique do meio lquido para o meio inclinado
Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen adotando procedimentos que
evitem a contaminao;
Esterilizar a ala de platina na chama do bico de Bunsen e esfri-la em tubo
com gua destilada ou prximo chama (ou no prprio meio de cultura lquido);
Retirar a tampa do tubo contendo a cultura;
Flambar a boca do tubo da cultura e recolocar a tampa;
Retirar a tampa do tubo com meio de cultura inclinado;
Flambar a boca do tubo e mant-lo prximo do Bico de Bunsen;
Introduzir a ala de platina carregada no meio inclinado;
Inocular fazendo estrias na superfcie do meio, comeando do fundo at 2/3
do comprimento da superfcie;
Flambar a boca do tubo e recolocar a tampa;
Esterilizar a ala de platina e recoloc-la no suporte;
Identificar o material e colocar seu nome e turma;
Incubar a 37 C e fazer a leitura.
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Aula 3
Gram Gram positiva e Gram negativa
As bactrias coradas pela tcnica de Gram pertencem a duas categorias
distintas: Gram-positivas e Gram-negativas. As diferenas entre os dois grupos
resultado da estrutura de suas paredes celulares, visto que as paredes das clulas
Gram-negativas possuem um contedo lipdico mais elevado que das Gram
positivas.
Preparao do esfregao
1. Material: Bico de Bunsen
Meio de Cultura (Meio lquido ou slido)
Lmina LSD
Ala de platina
2. Tcnica:
a) Esterilizar a ala no Bico de Bunsen
b) Esfriar a ala
c) Meio lquido: pegar 2 aladas e colocar sobre a lmina.
Meio slido: encostar levemente a ala sobre a colnia retirando parte da mesma
e colocar sobre a lmina fazendo movimentos circulares.
d) Reesterilizar a ala no Bico de Bunsen.
e) Fixar o esfregao aproximando a lmina na chama do Bico de Bunsen fazendo
movimentos lentos, at secagem do mesmo.
Tcnica de colorao
1. Colocar a lmina sobre o suporte que est na pia.
2. Pingar sobre o esfregao a soluo cristal violeta cobrindo-o
completamente, deixando durante 1 minuto. Retirar o excesso com um filete
de gua corrente. Os microrganismos adquirem tonalidade azul escura ou
prpura.
3. Recolocar a lmina sobre o suporte. Cobrir o esfregao com soluo iodoiodetada por 1 minuto. Esta soluo mordente fixa o cristal violeta produzindo
um complexo violeta-iodo.
4. Descolorao: soluo de lcool etlico a 95% juntamente com acetona
(700 mL de lcool + 300 mL de acetona) aplicada por gotejamento at que
no aja mais desprendimento do corante. As bactrias gram(+) sofrem
desidratao dos carboidratos das paredes celulares promovendo a reteno
dos corantes. As gram(-) pela dissoluo dos lipdeos, tem a porosidade ou a
permeabilidade da parede celular aumentada no retendo o corante.
5. Contraste: soluo de fucsina (ou safranina) corante secundrio. Aplicar
sobre o esfregao por um perodo de 30s. Se as clulas permitem o
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descoramento pelo lcool, elas fixam a fucsina nesta etapa e parecem


vermelhas (gram-negativas), caso contrrio, permanecem com a cor azul
escura, sendo chamadas Gram-positivas.
6. Lavar, secar e observar ao MO com a objetiva de imerso.
Gram + coram de violeta
Gram - coram de vermelho

Aula 4
Esterilizao e Desinfeco
Esterilizao: o ato ou processo de destruir ou eliminar todas as formas vivas de
um material, ambiente ou objeto. Este processo inclui os endsporos, que so
formas de resistncia ao meio. Esta pode ser feita atravs de diferentes processos,
empregando-se agentes fsicos (calor, radiao, filtrao, gases) e agentes
qumicos. Os mtodos mais utilizados so:

Calor mido
- Autoclavao: desnaturao de protena
- Vapor fluente: desnaturao de protenas
- Tindalizao: desnaturao de protenas

Calor seco
- Fornos (forno de Pasteur): oxidao
- Flambagem: oxidao
- Incinerao: oxidao

Radiao ionizante
- Radiao gama: destruio de DNA forma radicais superativos.

Radiao no-ionizante
- Lmpada UV: altera DNA, atravs da formao de dmeros.

Filtrao

Gases: xido de etileno Alquilao direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e


sulfidrilas, inativando enzimas.

Glutaraldedo

Desinfeco: definida como a eliminao dos microrganismos presentes, capaz


de transmitir infeco, patgenos, portanto, em um determinado meio e/ou ambiente,
atravs de um agente desinfetante, reduzindo ou inibindo o crescimento, sendo que,
estes podem ser divididos em 3 grupos: agentes qumicos, fsicos ou
quimioterpicos. Para que possamos atingir uma desinfeco correta, deve ser
observado a concentrao do produto, as condies do ambiente e o tempo de
exposio do mesmo.

Grupamentos qumicos: lcool, aldedos e derivados, fenis e derivados,


halognios e derivados, cidos inorgnicos e orgnicos, agentes de
superfcie, biguanidas e agentes oxidantes.
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Anti-sepsia: Diminuio ou inibio do crescimento de agentes patgenos e outros


microrganismos que esto presentes nos tecidos vivos.
Assepsia: Ausncia de microrganismos em um determinado meio e/ou ambiente
com utilizao de tcnicas asspticas apropriadas.
Bacteriostase: Inibio do crescimento bacteriano.
Degermao: remoo do microrganismo da pele atravs de tcnica mecnica ou
uso de antispticos.
Baixas Temperaturas: efeito microbiosttico, onde ocorre a interrupo do
metabolismo. Ex. geladeira, congelador, nitrognio lquido.

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Aula 5
Microscopia a fresco
Duas tcnicas em geral so empregadas em preparaes microscpicas:
preparaes a fresco e preparaes fixadas e coradas. A preparao a fresco
permite o exame de organismos nas condies normais de vida e so
preferencialmente utilizadas:
Quando a morfologia da clula pode estar danificada em preparaes fixadas
e coradas;
Durante a verificao da mobilidade;
Observaes de processos fisiolgicos;
Observao de corpsculos (vacolos e material graxo).
Ainda, as preparaes a fresco podem ser realizadas com ou sem colorao e
podem ser realizadas de acordo com as seguintes tcnicas:
1. Entre lmina e lamnula:
1.1 Bactrias cultivadas em meio lquido podem ser avaliadas, colocando-se,
com uma ala de platina esterilizada, uma gotcula da cultura no centro da
lmina, recobrindo-a com lamnula.
1.2 Para culturas filamentosas, o procedimento denomina-se entre lmina e
lamnula comprimida. retirado um pequeno fragmento da cultura em meio
slido, que comprimido entre lmina e lamnula.
2. Tcnica da Gota Pendente: mtodo mais seguro que o anterior leva
diminuio no tempo de observao e a concluses errneas, particularmente
em relao mobilidade bacteriana.
2.1 Procedimento: Untar a borda de uma lmina escavada com vaselina.
Transferir uma gotcula da cultura lquida para o centro de uma lamnula, e
em seguida unir a lmina e a lamnula. Examinar ao MO no aumento de 40x
para observar o movimento prprio ou direcional, alm do movimento
brawniano dos microrganismos, sem esquecer de diminuir a intensidade de
luz.

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Aula 6
Antibiograma

A descoberta dos antibiticos foi acompanhada pelo desenvolvimento de


tcnicas de laboratrio que permitiam verificar in vitro seu espectro antimicrobiano.
Esses mtodos demonstraram que bactrias da mesma espcie, mas de diferentes
linhagens, podiam se comportar de modo distinto ante a um mesmo antibitico.
Antibiograma a determinao in vitro da resistncia ou sensibilidade de
uma bactria a um ou vrios antibiticos, a qual pode ser realizada, tambm, para
determinar o espectro antimicrobiano de um novo antibitico. Ressalta-se, que com
este teste apenas possvel ver qual o melhor antimicrobiano para ser usado na
teraputica, e no qual a sua dose ideal.
A susceptibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como
sensvel, intermedirio ou resistente, ou quantitativamente em termos de MIC
(minimun inhibitory cincentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration).
1. Teste quantitativo de sensibilidade aos antimicrobianos: Mtodo da
diluio Consiste em preparar sucessivas diluies dos antibiticos em
meio slido ou lquido e em seguida semear a bactria em estudo. Aps
incubao determina-se o MIC ou MBC.
2. Mtodo de difuso de Bawer e Kirby modificado neste teste discos de
papel impregnados com o antibitico so colocados na superfcie do gar
uniformemente e antecipadamente semeado com o microrganismo. A droga
se difunde no gar. Caso ocorra inibio no crescimento do agente sensvel,
formar um halo em torno do disco de antibitico, que deve ser medido pelo
seu dimetro em mm, e comparado com tabelas padronizadas.
Meio de cultura utilizado: geralmente utiliza-se o meio Mller-Hinton, um meio
enriquecedor e com ausncia de substncias antagnicas.
Inoculao: saturar um swab de algodo com a suspenso bacteriana, remover o
excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo. Semear a suspenso
sobre a superfcie estril do gar, em 3 direes para obter um inoculo uniforme,
evitando que qualquer superfcie do gar fique isenta do incuo. Em seguida colocar
os discos de antibiticos na superfcie do Agar inoculado. Incubar as placas por 24 h
a 35 37 C.
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Aula 7
Cocos Gram positivos

A identificao bacteriana d-se pela observao das espcies. Para essa


identificao, devem ser observadas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas,
bioqumicas, sorolgicas, genticas e de patogenicidade das bactrias. Para
obteno de algumas dessas informaes usam-se recursos como testes
bioqumicos, alm da observao de colnias e de preparaes microscpicas
realizadas a partir desses.
Em um esfregao corado pelo mtodo de Gram, as clulas bacterianas
apresentam-se coradas em roxo (ou azul), sendo que Staphylococcus ficam
agrupados em cachos ou arranjos irregulares e os Streptococcus em cadeias ou aos
pares.
Meios: Caldo
Caldo simples nutriente
gar sangue
Teste de diferenciao entre gneros: as informaes obtidas pela bacterioscopia
pelo mtodo de Gram e das caractersticas de crescimento em meio gar sangue,
normalmente so suficientes para distinguir os gneros. Em caso de dvida,
possvel diferenciar os gneros Streptococcus e Staphylococcus atravs do teste da
catalase. Staphylococcus, ao contrrio de Streptococcus, produzem esta essa
enzima.
Procedimento: em um tubo de ensaio com soluo fisiolgica colocar uma pequena
quantidade da colnia formando uma suspenso bacteriana que ser utilizada no
teste, e, em seguida adicionar Perxido de Hidrognio (H2O2).
Resultado: Se houver o aparecimento de bolhas gasosas ou efervescncia
contnua indicam resultado positivo para o gnero Staphylococcus.

Tipos de Hemlise :
- Hemlise parcial
- Hemlise total
- No apresenta hemlise
Uma vez identificado o gnero Staphylococcus, a diferenciao entre as 3
espcies feita atravs de 2 testes: a pesquisa da enzima coagulase e a
resistncia a novobiocina. As caractersticas das colnias tambm podem ajudar na
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diferenciao, uma vez que somente a espcie S. aureus pode produzir hemlise
em meio gar sangue, e apresentar colnias de colorao variando do branco ao
amarelo fraco.

Gnero Staphylococcus: S. aureus - hemoltico (Staphylococcus coagulase +)


S. epidermidis (Staphylococcus coagulase -)
S. saprophyticus (Staphylococcus coagulase -)

Teste da coagulase: consiste em verificar a coagulao do plasma, atravs da ao


enzimtica ou da aglutinao de bactrias.
Esta tcnica pode ser feita em lmina ou em Tubo
Teste da Novobiocina: para diferenciar S. epidermidis e S. saprophyticus, j que S.
epidermidis sensvel a nova biocina e S. saprophyticus resistente. Um halo de
inibio inferior a 16 mm caracteriza resistncia.
Procedimento: com um swab embebido em suspenso bacteriana, semeia-se uma
placa contendo meio gar nutriente, em 3 sentidos evitando deixar qualquer
superfcie do meio sem ser semeado. Com a utilizao de uma pina previamente
aquecida pegar o disco de novobiocina e colocar no centro da placa dando um leve
aperto no disco para que se fixe bem na superfcie do meio evitando que ao virar a
placa o mesmo caia na tampa, e, incubar a 37 C por 24h.
Gnero Streptococcus: S. pyogenes - hemoltico
S. pneumoniae - hemoltico
2. Identificao de espcies de Streptococcus
Os Streptococcus provocam hemlise em meio gar-sangue. De acordo com
o tipo de hemlise, podem ser classificados em:
- hemolticos hemlise parcial
- hemolticos hemlise total
- hemolticos no apresentam hemlise

Gnero Streptococcus: S. pyogenes - hemoltico


S. pneumoniae - hemoltico
- hemolticos crescem formando colnias circulares, circundadas por uma zona
marrom-esverdeada.
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- hemolticos provocam aparecimento de uma zona clara ao redor da colnia.


Lancefield dividiu esses microrganismos em grupos sorolgicos de A a V. Os
estreptococos isolados com maior freqncia so do grupo A, B, C e G. Para a
diferenciao dos grupos A e B, 2 testes podem ser realizados:
Teste da sensibilidade bacitracina: o grupo A inibido por baixas concentraes
de bacitracina. Adicionam-se discos de bacitracina sobre a superfcie do gar
previamente semeado com a suspenso bacteriana a ser testada, incubando a 37 C
por 24h a 48h. Qualquer halo de inibio caracteriza sensibilidade ao antibitico.
Prova do fator CAMP: a protena CAMP produzida apenas pelos microrganismos
do grupo B. Em uma placa semeado horizontalmente uma linhagem de
Staphylococcus aureus que sabidamente produz - hemolisina. Perpendicularmente
a esta linha de semeadura, semeiam-se amostras de Streptococcus a serem
testadas. As duas estrias devem ficar prximas, no entanto sem se tocarem. Incubase por 18/24 h a 37 C. A protena CAMP liberada pelo grupo B ira lisar as hemcias
sensibilizadas pela - lisina estafiloccica. A ao sinrgica entre a protena CAMP e
a - lisina formar uma rea de hemlise em forma de seta que indica teste positivo.

Grupo

Hemlise

Bacitracina

CAMP

Negativo

B
C
D
Enterococo
Pneumococo

Positivo

Negativo

Negativo

Negativo

Negativo

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Aula 8
Anlise do ndice colimtrico da gua

A avaliao da qualidade microbiolgica da gua, seja ela para qualquer fim,


de extrema importncia. No caso do Brasil, as anlises so feitas adotando os
procedimentos do Standard methods for examination of water and wastewater, da
American Public Health Association (APHA), podendo estas serem qualitativas ou
quantitativas.
1. Contagem de bactrias
gua com altas populaes de microrganismos tem maiores possibilidades de
conter organismos patognicos, podendo indicar tambm, um alto contedo
orgnico. gua de boa qualidade para consumo deve ter populaes de bactrias
inferiores a 100 UFC/mL.
Procedimento

Preparar diluio seriada.

Inocular 3 placas com 1 mL, das diluies escolhidas;

Verter nas placas 20 mL do meio gar triptona glicose extrato de levedura


fundido e resfriado a +/- 50C;

Misturar e deixar solidificar, identificando as placas com as respectivas


diluies;

Inverter a placa e incubar a 35C por 48h;

Escolher para a contagem placas que tenham entre 30 e 300 colnias.

Fazer o clculo
N de UFC/mL = mdias das contagens das placas x diluio.
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2. Pesquisa de coliformes
No que diz respeito potabilidade, o aspecto mais importante o carter
qualitativo da populao. A maioria das doenas veiculadas pelas guas tem sua
origem na contaminao fecal, como o caso da shigelose, hepatite A, rotavrus,
giardase, entre outras. Como a liberao dos microrganismos algumas vezes pode
ser em pequenas quantidades ou de forma descontnua, seria impossvel avaliar a
presena de todos eles em uma amostra de gua. Por isso, escolheu-se um
microrganismo que indicasse a contaminao patognica, a Escherichia coli. Ela
constante no intestino humano e no dos animais de sangue quente, abundante nas
fezes, cresce facilmente em meios de cultura e vive bastante tempo na gua. No
entanto, apresenta baixa resistncia clorao e menor viabilidade na gua do mar.
A Escherichia coli faz parte do grupo de microrganismos denominados coliformes,
constituindo 95% dos coliformes nas fezes.
Alm da potabilidade, a qualidade microbiolgica da gua que vai decidir
sobre seus possveis usos.
2.1 Pesquisa de Coliformes totais: baseada nas caractersticas do grupo
bastonete Gram-negativo, que produz cido e gs atravs da lactose.

2.1.1 Teste Presuntivo: neste teste, presume-se que os microrganismos que


crescem produzem gs a partir de lactose sejam coliformes.

Procedimento para anlises diversas

Inocular com 10 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl


triptose concentrado e tubinhos de Durham invertidos;

Inocular com 1 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl


triptose e tubinhos de Durham invertidos;

Inocular com 0,1 mL da amostra 5 tubos contendo 10 mL de caldo lauryl


triptose e tubinhos de Durham invertidos;

Incubar a 37 C por 24 h;

Fazer a leitura, anotando a centena encontrada. NO misturar os tubos.

Reincubar os tubos negativos;

Fazer nova leitura.

Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel de coliformes por 100 mL.

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2.1.2 Teste confirmativo: inocular uma alquota de cada tubo positivo do teste
anterior em caldo lactosado bile e verde brilhante. Os sais de bile inibem o
crescimento de bactrias no-entricas e o verde brilhante de bactrias Grampositivos, selecionando, assim, os coliformes.
Procedimento

Aps o teste presuntivo, transferir com uma ala de platina uma alquota de
cada tubo positivo para tubos contendo caldo lactosado bile verde brilhante e
tubinhos de Durham invertidos;

Incubar a 37 C por at 48 h;

Fazer a leitura, obedecendo a centena. Os positivos apresentam gs;

Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel de coliformes por 100 mL.

2.2 Pesquisa de Coliformes Fecais: como os coliformes fecais tm em seu


ambiente natural temperaturas mais elevadas, podem assim ser diferenciados dos
coliformes totais.
Procedimento

Aps a leitura do teste presuntivo, transferir com a ala de platina uma poro
de cada tubo positivo para tubos contendo Caldo EC (Escherichia coli) e
tubinhos de Durham;

Incubar a 44C por 24 h;

Fazer a leitura. Os tubos com presena de gs so positivos.

Usar a tabela para verificar o nmero mais provvel de coliformes por 100 mL.

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Aula 9
Enterobactrias

Esta famlia compreende cerca de 80% de todos os bacilos gram-negativos


isolados no laboratrio clnico, sendo que os demais bacilos Gram-negativos
isolados constituem o grupo das chamadas bactrias no-fermentadoras.
Enterobactrias so bacilos Gram-negativos, aerbios ou anaerbios
facultativos, no esporulados, de crescimento rpido que formam colnias distintas
em meio seletivo indicador, dependendo da sua capacidade metablica e dos
componentes do meio. Tem como hbitat o intestino grosso, mas tambm so
encontradas fazendo infeco no trato urinrio, pulmes, ouvidos, etc. Todas
fermentam glicose, reduzem o nitrato a nitrito e so citocromo oxidase
negativas. Alguns gneros so sempre patognicos, outros fazem parte da flora
normal intestinal, porm se inoculadas em outros locais tais como lquor, peritnio e
pulmes de imunodeprimidos podem causar doenas.
Semeadura nos meios SS, MC e Teague.
1. Meio Salmonella-Shigella (SS): meio diferencial empregado para isolar Salmonella
e Shigella a partir de fezes, urina e alimentos frescos ou enlatados.
- As bactrias Gram + so inibidas por uma mistura de sais biliares.
- Shigella e a maioria das enterobactrias formam colnias claras e incolores ou
transparentes.
- E. coli formam colnias pequenas, que vo de rosa a vermelho.
- Algumas Salmonellas formam colnias incolores, transparentes com centro negro
(H2S).
2. Meio Conkey (MC): meio amplamente utilizado para isolar e identificar
seletivamente enterobactrias em amostras biolgicas, gua, esgoto e alimentos.
- A mistura de sais biliares inibe Gram +.
- E. coli - colnias vermelhas ou rosadas, devido a fermentao da lactose a
diminuio do pH pode fazer com que os meios fiquem rodeados por um precipitado
de sais biliares.
- Salmonella colnias incolores, do transparente ao mbar.
- Shigella colnias incolores, transparentes ou levemente rosadas.

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3. Meio Teague (EAM): eosina azul de metileno: meio utilizado para isolamento e
diferenciao de enterobactrias. Promove uma distinta diferenciao entre as
colnias de microrganismos fermentadores de lactose e os que no fermentam
lactose.
- O meio ligeiramente inibidor para Gram +.
- E. coli colnias elevadas de 2 a 3 mm de dimetro. Apresentam um centro azulnegro com borda estreita e clara, e brilho azul metlico azul esverdeado luz
refletida (algumas linhagens podem no ter brilho).
- Salmonella e Shigella colnias ligeiramente elevadas de 1 a 2 mm de dimetro,
transparentes, desde incolor at mbar.
A partir de colnias caractersticas e isoladas deste meio, inocular no meio
TSI (Trplice Sugar Iron) com agulha de nquel cromo, por estria de esgotamento e
em profundidade.

Meio TSI (gar ferro trplice acar glicose, sacarose e lactose): um meio
diferencial, recomendado para identificao de bacilos entricos, baseado na
fermentao da glicose, lactose e sacarose e na produo de sulfeto hidrognio
(H2S).
Leitura do TSI
Local

pice e/ou base

Cor
Vermelho forte
Vermelho claro
Amarelo
Amarelo e bolhas
Preta

Significado
Reao alcalina
Reao neutra
Reao cida
Formao de gs
Produo H2S

Interpretao
pice e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (+).
pice vermelho e base amarela = glicose (+); lactose e/ou sacarose (-).
pice e base vermelho = glicose, sacarose e lactose (-).

TSI
Lactose
Sacarose
Glicose
Gs
H2S

Salmonella

Shigella

E.coli

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Provas de Identificao Testes Bioqumicos


Indol: verificar se a bactria tem ou no a enzima triptofanase.
triptofanase
Caldo triptofano -----------------------------------> indol + amnia c. Pirvico
Interpretao: reativo de Erlich (na parede do tubo) em presena do indol forma um
complexo de vermelha
vermelho (+)
sem alterao na cor (-)

Nitrato: verificar a presena da enzima nitrito redutase


Nirtato redutor
Nitrato (NO3) -------------------------------------------> Nitrito (NO2)
Reativo de Gries Ilosvay Reativo A: c. Sulfanlico
Reativo B: c. Naftilamina
Interpretao: teste positivo precipitado vermelho-tijolo
teste negativo sem alterao de cor
Citrato: verificar se o citrato utilizado como nica fonte de carbono
Interpretao: teste positivo azul
teste negativo verde
Malonato: verificar se o malonato utilizado como nica fonte de carbono
Interpretao: teste positivo azul
teste negativo verde
Uria: verificar a presena da enzima urase
urease
uria -----------------------------> amnia
Interpretao: teste positivo vermelho ou rosa
teste negativo amarelo

Fermentao de Carboidratos: determina a capacidade de um microrganismo de


fermentar a glicose incorporada a um meio base, produzindo cido ou cido com
gs.

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Glicose
Lactose
Sacarose Maltose

cidos ou
cidos com gs

Manitol

formiase
Glicose -----> c. Pirvico ----> c. Frmico ------------------------> H2 + CO2

Glicose

Glicose 6P

Frutose 6P

Frutose 1,6 PP

Ac, propinico

Gliceraldedo 3P

Ac. Succnico

Ac. Pirvico

Ac. Ltico

Acetaldedo

lcool etlico

Lisina: verificar a presena da enzima lisina carboxilase


enzimas
Glicose --------------------> cidos (baixa do pH colorao amarela (-))
enzimas
Lisina ---------------------> cadaverina (diamina) + CO2 (aumenta pH colorao
roxa(+))

Vermelho de Metila: testa a capacidade de um microrganismo em produzir cidos


orgnicos relativamente estveis, a partir da fermentao da glicose.

22

cido lctico
enzimas

cido actico

Glicose ----------------------------> cido frmico

pH 4,5

cido succnico
cido etlico

Reagente: soluo hidroalcolica de vermelho de metila (5 gotas)


Interpretao: teste positivo vermelho
teste negativo amarelo

Vogues Proskauer: determina a capacidade de um microrganismo em produzir um


composto nitrogenado neutro, o acetilmetilcarbinol (acetona), a partir da
fermentao da glicose.

Glicose

2 c. pirvico

Acetilmetilcarbinol (acetona)
0,6 mL de alfa-naftol + 0,2 mL de KOH
40%
Diacetila + nclea guanidina

Composto vermelho
Interpretao: teste positivo rosa a vermelho
teste negativo cobre

23

Provas
Indol
Nitrati
Citrato
Malonato
Uria
Glicose
Lactose
Sacarose
Maltose
Manitol
Lisina
VM
VP

Salmonella

Shigella

E. coli

+
+
+
+
+
+
+
-

+
+
V
+
+
-

+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

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Referncias Bibliogrficas

MURRAY, P.R. et al. Microbiologia mdica. 5 ed. Guanabara Koogan, Rio de


Janeiro, 2006.
PELCZAR, M. J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicaes. V. 1 e 2. 2 ed.
Pearson, 2005.
SILVA FILHO, Germano Nunes; OLIVEIRA, Veturia Lopes de. Microbiologia:
manual de aulas prticas. 2. ed. rev. Florianpolis: Ed. da UFSC, 2007. 157p.
TRABULSI, L. R. Microbiologia 5 ed. Ateneu, 2008

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