INTRODUCCIN AL DESARROLLO DE PROCESOS DE VALIDACIN Y

ESTIMACIN DE INCERTIDUMBRE
Septiembre 2005
Proceso de validacin
Etapas :

Definicin clara del problema analtico a resolver

Seleccin del mtodo adecuado
Planificacin del proceso
o Asignacin del responsable
o Caractersticas y requisitos del mtodo
En funcin del uso previsto
Tiene en cuenta requisitos : Legales
Econmicos
Normativos
Propios
o Documentacin del procedimiento
Caracterizacin analtica del mtodo
o Redaccin del mtodo
o Verificacin de que todos los equipos , materiales
relacionados y reactivos cumplen con la norma de
referencia .
o Realizacin de los experimentos
o Obtencin de los resultados
o Verificacin de procedimiento de calibracin
o Obtencin de parmetros de desempeo
Confirmacin de la identidad y selectividad /
especificidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Intervalo de trabajo e intervalo lineal
Exactitud
Veracidad
Precisin
Incertidumbre
Sensibilidad
Robustez
Recuperacin
o
o

Demostracin de que el mtodo est bajo control

estadstico
Demostracin de trazabilidad

Cumple los objetivos iniciales

No ------ volver al inicio
Si ------continuar el proceso
Establecimiento de controles peridicos mediante programa

Declaracin final
Conservacin de documentacin y registros
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 . Validacin
Demostracin y confirmacin mediante los correspondientes exmenes y obtencin de
evidencias que los requisitos particulares de un sistema para un uso especfico son
satisfechos ( ISO 8402 1994).
2 . Validacin de mtodos analticos
2.1 Proceso en el cual se establece mediante el desarrollo de estudios
sistemticos :
- que las caractersticas de un mtodo analtico ( en cuanto a desempeo y
limitaciones ) cumplen las especificaciones relativas al uso previsto de los
resultados analticos obtenidos
- la identificacin de influencias que pueden modificar las caractersticas del
mtodo y a que grado. (1)
2.2 Proceso de definicin de las necesidades analticas y la confirmacin de que
el mtodo ha considerado capacidades consistentes con las que la aplicacin
requiere. (1)
3 . Por qu es necesaria la validacin de un mtodo? (1)
3.1 Por la importancia de la mediciones analticas, prcticamente cada aspecto de
la sociedad est apoyada de algn modo por las mediciones analticas.
o comercio
o salud.
o Calidad del agua
o Caracterizacin de materiales... etc
Es importante determinar el resultado correcto y ser capaz de demostrar que lo es.
3.2 Por la confiabilidad del resultado obtenido de una prueba. El laboratorio y el
personal tienen una clara responsabilidad para justificar la confianza del solicitante
proporcionando la respuesta correcta en toda etapa analtica. Esto implica que las
pruebas deben ser las adecuadas para el tipo de muestra y el propsito con que
ser usados los resultados.
La validacin del mtodo permite demostrar que el mtodo es adecuado para su
propsito.
3.3 Asimismo para que un resultado analtico concuerde con el propsito
requerido debe ser lo suficientemente confiable para que cualquier decisin
basada en l pueda tomarse con confianza. As, el desempeo del mtodo debe
ser validado y la incertidumbre del resultado , a un nivel de confianza dado,
estimada.

4 . Cmo debe ser validados los mtodos? (1)

4.1 Quien desarrolla la validacin del mtodo?
El laboratorio es responsable de que el mtodo analtico se encuentre
debidamente validado. La validacin puede ser realizada de dos maneras :
4.1.1 Mediante estudios de colaboracin empleando protocolos adecuados
4.1.2 Trabajando en forma aislada , situacin que implica :
o
o
o

Menor cantidad de datos

Uso de materiales de referencia certificados o comparacin
de mtodos
Demostracin que el mtodo ha sido completamente
documentado y probado con la referencia recomendada por
el mtodo de referencia demostrando que se han establecido
o Tolerancias
o Efectos de interferencias
o Fuentes de desviacin y medios identificados para
controlarlas.

4.2 Al decidir el grado de validacin requerido

El laboratorio debe definir que parmetros de desempeo del mtodo deben ser
caracterizados
La caracterizacin del desempeo del mtodo involucra :
o
o

Consideraciones de costos y tiempo

Requerimientos del mtodo en base a :
o Alcance ( relacin entre requerimientos del solicitante y
caractersticas del mtodo)
o Experiencia del laboratorio
o Necesidad de compatibilidad con otros mtodos similares.

Algunos parmetros podrn ser determinados durante el desarrollo del mtodo

Los requisitos de validacin deben ser especificados y concordar con referencias
dentro del mismo sector de medidas en cuanto a :
o
o
o

Estrategias de validacin
Terminologa
Estadstica aplicada y su interpretacin

deben ser consistentes dentro del sector relevante

4.3 Ante requisitos analticos

Ante el requerimiento de ciertas caractersticas analticas se definen los requisitos
de desempeo que un mtodo debe tener para resolver el problema analtico
planteado.
Se debe evaluar si los mtodos existentes son adecuados y si es necesario
desarrollar un nuevo mtodo , el proceso iterativo de desarrollo y evaluacin de los
criterios de desempeo contina hasta que el mtodo es capaz de cumplir con el
requisito analtico planteado y se confirma que es adecuado.
4.4 Al desarrollar un mtodo
El desarrollo de nueva metodologa puede tomar dos formas:
4.4.1
4.4.2

Adaptar a un requerimiento un mtodo ya existente realizando

cambios menores de manera que sea adecuado a su nueva
aplicacin
Disear un mtodo analtico en base a investigacin, experiencia,
pericia analtica y el conocimiento de propiedades del analito.
Requerir un amplio volumen de pruebas experimentales y de
verificacin dentro de especificacin planteadas.

4.5 Parmetros de desempeo de un mtodo

El estudio para determinar los parmetros de desempeo se realiza usando
equipos dentro de especificaciones , trabajando correctamente y que se encuentre
adecuadamente calibrado. El operador debe ser tcnicamente competente en el
campo de trabajo en estudio y debe poseer suficiente conocimiento sobre el
trabajo a realizar con el fin de que sea capaz de tomar decisiones apropiadas de
las observaciones hechas mientras progresa el estudio.
Muchos de los parmetros de desempeo del mtodo que estn asociados a su
validacin y por lo general son evaluados por lo menos aproximadamente como
parte del desarrollo del mtodo.
4.5.1 Confirmacin de la identidad y selectividad / especificidad
4.5.2 Lmite de deteccin (LDM)
4.5.3 Lmite de cuantificacin (LOQ)
4.5.4 Intervalo de trabajo e intervalo lineal
4.5.5 Exactitud
4.5.6 Veracidad
4.5.7 Precisin
4.5.8 Incertidumbre de la medicin
4.5.9 Sensibilidad
4.5.10 Robustez
4.5.11 Recuperacin

4.5.1 Confirmacin de la identidad y selectividad / especificidad

4.5.1.1 Confirmacin de la identidad : establecer que la seal producida en
la etapa de medicin u otra propiedad medida que ha sido atribuida al
analito es debida nicamente a l.
Las posibles interferencias dependern de la efectividad en etapas previas
de separacin de compuestos en el mtodo analtico y de la selectividad /
especificidad en la etapa de medicin
4.5.1.2 Selectividad
o

Selectividad cualitativa : indicacin de la presencia de sustancias

que interfieren en la determinacin del analito en estudio de acuerdo
a un procedimiento (IUPAC Compendium of Chemical Terminology,
1987)

Selectividad cuantitativa : Caracterizacin cuantitativa de la

presencia de interferencias en la determinacin de un analito
mediante un procedimiento determinado (IUPAC Compendium of
Chemical Terminology, 1987)

4.5.1.3 Especificidad : Capacidad de un mtodo para determinar el

contenido de un analito inequvocamente en presencia de otros
componentes ( impurezas, matriz, etc) ( ICH Q2a, CPMP/ICH/381/95)
Se considera que la especificidad es el 100% de la selectividad.
Si las interferencias estn presentes y no pueden ser separadas del analito
o no son conocidas tendrn varios efectos en el anlisis:
o
o
o

distorsionar la seal
contribuir a la seal del analito produciendo un aparente incremento
en su concentracin.
suprimir la seal del analito.

La selectividad se investiga mediante el estudio de la capacidad del mtodo

para medir al analito en muestras de prueba en las cuales se han
introducido sustancias interferentes especficas. Estudiando la capacidad
al medir el analito comparando con otros mtodos o tcnicas
independientes ( tcnicas confirmatorias). La confirmacin aumenta la
confianza en la tcnica bajo estudio y es especialmente til cuando las
tcnicas de confirmacin operan con principios diferentes.
4.5.2

Lmite de deteccin (LDM)

Confusiones surgen debido a que no existe un acuerdo universal de la
terminologa aplicada.
ISO ....concentracin mnima neta detectable
IUPAC ..... valor (verdadero) mnimo detectable

Lmite de deteccin : el menor contenido que puede ser medido con

certeza estadstica razonable (AOAC PVMC)
La menor concentracin del analito en una muestra que puede detectarse
pero no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas se
la prueba (NATA Tech Note # 13)
El lmite de deteccin expresado como concentracin cL , o como cantidad
qL, se deriva de la medicin ms pequea xL , que puede ser detectada con
certeza razonable para un procedimiento analtico dado. El valor de xL est
dado por la ecuacin
XL = xbl + ksbl
Donde xbl es la media de las mediciones del blanco y sbl la desviacin
estndar de las mediciones del blanco , y k es un factor numrico elegido
de acuerdo al nivel de confianza deseado. (IUPAC Compendium of
Chemical Technology, 1985 )
La concentracin neta verdadera o la cantidad del analito en el material a
analizarse la cual llevar con una probabilidad de (1-) , a la conclusin de
que sobre la concentracin del analito en el material analizado es mayor
que la del blanco matriz (ISO/DIS 11843-1)
El menor contenido de analito , si est presente, que ser detectado y que
puede ser identificado (AOAC PVMC)
La mnima concentracin de un analito que puede ser identificada, medida
y reportada con 99% de confianza que la concentracin del analito es
mayor que cero. (EPA Method 200.7 , rev 4.4 1994)
Para los propsitos de validacin se debe indicar el nivel al cual la
deteccin resulta problemtica.
Dos planteamientos para su determinacin:
Segn IUPAC
o

Se analizan por separado 10 soluciones blanco independientes o 10

soluciones blanco independientes fortificados a la menor concentracin
aceptable.

Obtencin : a partir de la seal del blanco ms tres veces la desviacin

estndar de la serie de 10 mediciones
Segn EPA
o

Se analizan por separado 10 soluciones blanco independientes , la

concentracin equivalente a tres veces la desviacin estndar de esta

serie de medidas es definida como el lmite de deteccin instrumental

(LDI).
Se realiza el anlisis de la solucin blanco reactivo fortificada con el
analito a la concentracin equivalente a 2 a 3 veces el lmite de
deteccin instrumental estimado , dicho anlisis se efecta siete veces
siguiendo el proceso total del mtodo. El lmite de deteccin del mtodo
(LDM) se establece multiplicado la desviacin estndar de esta serie de
medidas por el factor estadstico de t de student para un nivel de
confianza de 99% y seis grados de libertad, (t = 3,14)
Para mayor confiabilidad reanalizar la serie de siete rplicas durante
dos o ms dias no consecutivos y calcular el lmite de deteccin del
mtodo por cada da. Calcular el promedio de los LDM obtenidos, si la
desviacin estndar relativa del anlisis de las siete alcuotas es menor
a 10% la concentracin usada para determinar el LDM puede haber
sido inapropiadamente grande para la determinacin. Si es as esto
podra resultar en el clculo de irrealmente bajo LDM.
4.5.3 Lmite de Cuantificacin (LOQ)
Estrictamente es la concentracin ms baja del analito que puede ser
determinada con un nivel aceptable de precisin de repetibilidad y de
veracidad.
El contenido igual o mayor que el menor punto de concentracin en la
curva de calibracin (AOAC PVMC)
La menor concentracin de un analito que puede ser determinada con una
precisin aceptable (repetibilidad) y exactitud bajo las condiciones
establecidas de la prueba (NATA Tech Note # 13)
Los lmites de cuantificacin son caractersticas del desempeo que
marcan la capacidad de un proceso de medicin para cuantificar
adecuadamente un analito, se expresa en trminos de la seal o valor
verdadero del analito que producir estimados teniendo desviacin
estndar relativa (RSD) especificada comnmente del 10%
As:
LOQ = kQQ
Donde
LOQ : es el lmite de cuantificacin
Q : desviacin estndar en ese punto
kQ : multiplicador , aproximadamente 10 (IUPAC Orange Book)
Concentracin mnima del analito que puede determinarse con seguridad
estadstica ( en trminos de exactitud y precisin aceptables.
Obtencin

IUPAC
A partir de la seal del blanco ms diez veces su desviacin estndar
EPA
A partir de la determinacin de LDM , establecer una relacin entre el LDM
y LOQ de 3 a 10 .
4.5.4 Intervalo de trabajo e intervalo lineal
Intervalo de trabajo : Conjunto de valores del mensurando para los cuales el
error de una instrumento de medicin esta supuestamente comprendido dentro de
ciertos lmites (IUPAC Orange Book)
Intervalo de las concentraciones analticas sobre los cuales el mtodo va a ser
aplicado.
o
o

La menor concentracin del intervalo estara dada por los valores de

lmite de deteccin o lmite de cuantificacin.
La mayor concentracin estara establecida por efectos que
dependern de la tcnica analtica y del sistema de respuesta del
instrumento.

Intervalo lineal : dentro del intervalo de trabajo puede existir un intervalo donde la
seal de respuesta tendr una relacin lineal con la concentracin del analito.
Se establece durante la evaluacin del intervalo de trabajo mediante clculos de
regresin lineal , inspeccin visual adems de su confirmacin mediante revisiones
de linealidad empleando al menos 10 diferentes concentraciones.
Obtencin
Graficar la respuesta de la medida ( eje y) contra la concentracin del mensurando
( eje x) examinar e identificar el intervalo lineal aproximado y los lmites inferior y
superior. Calcular el coeficiente de regresin apropiado. Calcular y graficar valores
residuales ( diferencia entre el valor actual de y y el valor predicho por la lnea
recta para cada valor de x. La distribucin aleatoria confirma la linealidad,
tendencias sistemticas indican no-linealidad.
La relacin entre la respuesta del instrumento a la concentracin del analito no
tiene que ser perfectamente lineal para que un mtodo sea efectivo pero la curva
debe ser repetitiva. El intervalo de trabajo y el lineal puede no ser el mismo para
diferentes tipos de matrices de acuerdo con el efecto de las interferencias que
aparezcan de la matriz de la muestra.
4.5.5 Exactitud
Grado de concordancia entre el resultado de la medicin y el valor de referencia
aceptado. ( Gua para la expresin de la Incertidumbre de la medicin 1999
)(3)

Cuando se aplica a un conjunto de resultados de mediciones implica la

combinacin de los componentes aleatorios y errores sistemticos o componentes
del sesgo.
La cantidad referida a las diferencias entre la media de un grupo de resultados o
un resultado individual y el valor el cual se acepta como el valor verdadero o
correcto para la cantidad medida ( IUPAC Compendium of Chemical Techmology,
1985)
Se busca cuantificar la exactitud de los resultados estableciendo los efectos
sistemticos y aleatorios.
Se estudia en base a :
o

Veracidad : se expresa en trminos de sesgo

Precisin : se expresa en base a la desviacin estndar que caracteriza

la dispersin de los resultados

Y se encuentra muy relacionada a otro parmetro : la incertidumbre

4.5.6

Veracidad

Es la proximidad de concordancia entre el valor promedio obtenido de una serie

de resultados de prueba y un valor de referencia aceptado
La medida de la veracidad se expresa por lo general en trminos de sesgo (ISO
3534-1)
Obtencin
Dos procedimientos para determinarla
o

mediante la revisin empleando el mtodo analtico con respecto a valores

de referencia de un material certificado(MRC), trazable a estndares
internacionales
verificar la veracidad empleando un material de referencia determinar la
media de los valores obtenidos y la desviacin estndar de la serie de
repeticiones , comparar con el valor caracterizado del material de
referencia, similar a las muestras.

mediante la revisin empleando un mtodo alternativo caracterizado

comparar los resultados de los dos mtodos empleados
las muestras deben ser materiales de referencia certificados o muestras
tpicas.

Se definen dos componentes del sesgo :

o

sesgo del mtodo : errores sistemticos inherentes al mtodo

sesgo de laboratorio : errores sistemticos caractersticos del laboratorio y

de la interpretacin del mtodo.

Se estima el sesgo combinado ( sesgo del mtodo y sesgo de laboratorio) y

debe ser comparado con cualquier sesgo proveniente del mtodo de
referencia. Debe ser medido contra los materiales o mtodos de referencia
apropiados tomando en cuenta la precisin del mtodo , la incertidumbre en la
medicin y la exactitud requerida. Son tiles las pruebas estadsticas de
significacin.
( Gua para la expresin de la Incertidumbre de la medicin 1999
)(3)
4.5.7 Precisin
Grado de concordancia entre los resultados obtenidos al aplicar el procedimiento
experimental repetidas veces bajo las condiciones establecidas

o Repetibilidad : Grado de concordancia entre resultados de sucesivas

mediciones efectuadas con aplicacin de la totalidad de las mismas
condiciones de medicin (Gua para la expresin de la incertidumbre de la
medicin 1999)(3).

Variabilidad cuando un mtodo se desarrolla por un solo analista, un

instrumento, perodo corto de tiempo , por ejemplo en muestras por
duplicado.
o

Reproducibilidad : Grado de concordancia entre resultados de las

mediciones efectuadas bajo diferentes condiciones de medicin. (Gua
para la expresin de la incertidumbre de la medicin 1999) (3).
Es necesario especificar que condiciones varan , por ejemplo es la
variabilidad obtenida en anlisis realizados por varios analistas, o varios
laboratorios.

Se obtienen en trminos de desviacin estndar o desviacin estndar relativa.

Dependen de la concentracin del analito y deben determinarse a diferentes
concentraciones y es til establecer la relacin entre precisin y nivel de
concentracin del analito, siendo entonces importante la determinacin de la
desviacin estndar relativa.
4.5.8 Incertidumbre de la medicin
Parmetro asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la dispersin
de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mensurando. (VIM
1993)
Dicho parmetro puede ser una desviacin estndar ( o un mltiplo de ella) o la
mitad de un intervalo de confianza determinado.
La incertidumbre de la medicin comprende , en general, muchos componentes.

Es una forma de expresar el hecho de que, para un mensurando y un resultado

de medicin dados, no hay un nico valor sino un nmero infinito de valores
dispersos alrededor del resultado que son consistentes con todas las
observaciones, datos y conocimientos que se tengan del mundo fsico, y que con
diversos grados de credibilidad pueden atribuirse al mensurando
(Gua para la expresin de la Incertidumbre de la medicin 1999)(3).

En una medicin el objetivo es determinar el valor del mensurando y del nivel de

variabilidad (incertidumbre)
Existen diferentes procesos para la estimacin de la incertidumbre , todos
metrolgicamente vlidos y coherentes
El Procedimiento General planteado por ISO (3) establece las siguientes etapas:
4.5.8.1 Definir el mensurando
Mensurando : Magnitud particular sujeta a medicin (especificacin puede
requerir indicaciones relativas a magnitudes como tiempo temperatura y
presin)
La definicin de mensurando es de vital importancia para obtener buenos
resultados de la medicin y en la estimacin de la incertidumbre.
Una definicin incompleta del mensurando puede dar lugar a una
componente de incertidumbre muy grande.
4.5.8.2 Establecer el modelo matemtico a partir del modelo fsico
Modelo fsico : conjunto de suposiciones sobre el propio mensurando y las
variables fsicas y qumicas relevantes para la medicin.
Modelo matemtico : Representacin matemtica del modelo fsico,
plantea aproximaciones por la representacin imperfecta y limitada de las
relaciones entre las variables involucradas.
La medicin es un proceso y se identifican magnitudes de entrada ,
identificadas como xi
La relacin entre las magnitudes de entrada y el mensurando Y (magnitud
de salida) se representa por: Y = f (x1, x2, .... xn) = f (xi), siendo xi el mejor
estimado de la magnitud de entrada xi.
4.5.8.3 Identificar las magnitudes de entrada
Magnitud de entrada o magnitud de influencia : Magnitud que no es el
mensurando pero que afecta el resultado de la medicin.
4.5.8.4 Identificar las fuentes de incertidumbre
Diversas fuentes algunas descritas por las magnitudes de entrada
(magnitudes de influencia).

Otras contribuciones dependen de la definicin de propio mensurando, y

otras pueden depender de
el principio cientfico de la medicin
el mtodo de medicin
el procedimiento para la medicin.
Tambin influyen atributos no cuantificables.
Algunas fuentes de incertidumbre son:

Definicin incompleta del mensurando

Realizacin imperfecta de la definicin del mensurando
Muestreo no representativo
Conocimiento inadecuado de los efectos de las condiciones
ambientales sobre las mediciones
Errores de apreciacin del analista en la lectura de instrumentos
Resolucin finita del instrumento
Valores inexactos de los patrones de medicin y materiales de
referencia
Aproximaciones y suposiciones incorporadas el mtodo y
procedimiento de medicin
Variaciones en las observaciones repetidas del mensurando bajo
condiciones aparentemente iguales.

Estas fuentes no son necesariamente independientes.

4.5.8.5 Cuantificar la variabilidad de cada fuente y obtener la incertidumbre
estndar asociada a cada fuente
Para realizar la cuantificacin de la variabilidad de las fuentes de
incertidumbre se definen los siguientes parmetros:
-

Incertidumbre estndar: (x) componente de la incertidumbre (y)

expresada como desviacin estndar.

Incertidumbre estndar combinada: para el resultado y (que se obtiene

a partir de los resultados parciales (xi) es la combinacin de las
incertidumbres estndar de los resultados parciales que intervienen en
la funcin y aplicando la ley de propagacin incertidumbres. Se expresa
por c(y).

Incertidumbre expandida proporciona un intervalo dentro del cual se

cree que est el valor del parmetro medido para un cierto nivel de
confianza. U = kc(y) factor de cobertura 2 o 3 generalmente (nivel
confianza de 95 y 90%)
Existen dos tipos de evaluacin de la incertidumbre:
Evaluacin Tipo A : se caracteriza por representar componentes de la
incertidumbre que son evaluados a partir de distribuciones estadsticas
de los resultados obtenidos experimentalmente e el laboratorio en base

a series de repeticiones de ensayos. La variabilidad es expresada

generalmente en trminos de desviaciones estndar
Evaluacin Tipo B : pueden caracterizarse por desviaciones estndar
que se evalan a partir de distribuciones de probabilidad supuestas
basadas en la experiencia o en otro tipo de informacin , datos externos
al laboratorio.
4.5.8.6 Calcular la incertidumbre estndar combinada
Se obtiene la incertidumbre estndar combinada (c) utilizando la ley de
propagacin de incertidumbres
N

[c u (x )] + c

uc ( y ) =

i =1

i, j =

c j u ( xi ) u (x j ) R (X i , X j )

Donde :
uc(y) : incertidumbre estndar combinada
u(xi) : incertidumbre estndar de la magnitud de influencia i
ci : coeficiente de sensibilidad de la magnitud de influencia i
_

R( X i X ) : coeficiente de correlacin
Coeficiente de sensibilidad ( ci ) : describen como la estimacin de la
magnitud de salida ( y ) vara con los cambios de las estimaciones de las
magnitudes de entrada ( xi )
Se obtiene mediante la siguiente expresin

ci =

f (Y )
X i

X 1 = x1 ,..., X N = x N

Coeficiente de correlacin ( R ) : Medida de la mutua dependencia relativa

de dos variables, es igual a la razn de sus covarianzas y la raz cuadrada
positiva del producto de sus varianzas.
Toma valores en el rango de + 1 a 1, y cuando R = 0 significa que las
magnitudes son independientes, no existe correlacin.
4.5.8.7 Elegir el nivel de confianza, cuantificar el nmero de grados de libertad y
determinar el factor de cobertura
El objetivo es obtener la incertidumbre expandida
Up = kp . uc (y)
que define un intervalo

y Up Y y + Up
que tiene una alta probabilidad de cobertura especificada o nivel de
confianza p. Se debe determinar entonces kp que produce un intervalo
alrededor del resultado de la medicin ( y ) que se espera incluya una
fraccin suficientemente grande especificada p de la distribucin de valores
que pueden atribuirse razonablemente al mensurando Y.
Para obtener el valor del factor de cobertura kp se requiere del
conocimiento detallado de la distribucin de probabilidad que caracteriza al
resultado de la medicin y su incertidumbre estndar combinada.
Para calcular una incertidumbre expandida Up = kp uc (y) que proporcione
un intervalo con un nivel de confianza p, se utiliza un valor obtenido de una
distribucin normal para kp., en los casos que el tipo de distribucin
asignada a la magnitud de salida ( y ) sea una distribucin normal
En los otros casos, cuando la distribucin asignada a la magnitud de salida
no es la normal, se puede emplean una distribucin t, asumiendo que la
distribucin de probabilidad sigue una funcin t y determinando kp mediante
la expresin
kp = tp (eff)
donde eff es el nmero efectivo de grados de libertad obtenido a partir de la
frmula de Welch Sattwethwaite

ef

ui ( y )

uc ( y )

i =1

donde:
i : nmeros de grados de libertad para la magnitud i
ui(y) : incertidumbres estndar individuales
uc(y) : incertidumbre combinada
ef : nmeros efectivo de grados de libertad
4.5.8.8 Calcular la incertidumbre expandida
De manera rigurosa la incertidumbre expandida se calcula como
U(y) = k.uc(y) = tp.(ef).uc(y) = kp .uc(y)
Donde tp.(ef) es el factor derivado de la distribucin t de Student a un nivel
de confianza p ( aprox 95%) y ef los grados de libertad

4.5.9 Sensibilidad
Sensibilidad : el cambio en la respuesta de un instrumento de medicin dividido
por el correspondiente cambio del estmulo ( ej . cantidad del mensurando
presente).( VIM 1984 y IUPAC Orange Book)
La definicin se puede aplicar el instrumento de medicin o a todo el mtodo
analtico tomando en cuenta otros factores.
Es el gradiente de la respuesta de la curva, si la respuesta es lineal con respecto a
la concentracin puede ser un parmetro til y ser empleado en la cuantificacin
del analito.
4.5.10 Robustez
Robustez : es una medida de la capacidad de un procedimiento analtico de
permanecer inalterado por variaciones pequeas pero deliberadas en los
parmetros del mtodo y proporciona una indicacin de su confiabilidad durante su
uso normal. (ICH Q2A, CPMP/ICH/381/95)
Es una medida de la efectividad del mtodo analtico.
Deben identificarse aquellas etapas del mtodo donde los cambios implicarn
efectos severos en el desempeo analtico, y evaluar su influencia mediante el uso
de pruebas de robustez.
La pruebas de robustez involucran realizar variaciones deliberadas al mtodo y
estudiar el efecto en el desempeo, as es posible identificar a aquellas variables
cuyo efecto ser ms significativo y en base a ello controlarlas. Con consecuencia
mejorar el mtodo , si es posible, sobre aquellas partes que se conocen como
crticas.
Las pruebas de robustez se aplican normalmente para investigar su efecto en la
precisin y en la exactitud del mtodo.
4.5.11 Recuperacin
La fraccin de analito adicionada a una muestra de prueba fortificada previa al
anlisis , muestras fortificadas y sin fortificar , el porcentaje de recuperacin (%R)
se calcula de la siguiente manera :
% R = (( CF CU)/CA) x 100
Donde :
CF : concentracin de analito medida en la muestra fortificada
CU : concentracin de analito medida en la muestra sin fortificar
CA : concentracin de analito adicionada en la muestra fortificada
(fortificacin) (AOAC PVMC)
Es necesario asegurar la eficiencia del mtodo al determinar todo el analito
presente, puede existir fallas para dicha determinacin que sea consecuencia de
un problema inherente del mtodo.

Es difcil estar seguros que tan exitoso ha sido el mtodo al extraer el analito de la
matriz y una forma de determinar esta eficiencia es adicionar porciones de prueba
del analito a varias concentraciones, luego se extraen las porciones fortificadas y
se mide la concentracin del analito. Existen diferencias inherentes de
comportamiento qumico entre el analito adicionado y aquel que naturalmente se
encuentra en la muestra pudiendo obtenerse resultados irreales de eficiencia ,
pero es una tcnica aceptable y muy difundida de determinar la eficiencia
mencionada.
5. Utilizacin de mtodos validados
Si un mtodo , dentro del laboratorio, por otro laboratorio o es un mtodo de referencia, se
encuentra validado en condiciones de operacin extremas un nuevo analista competente
operar satisfactoriamente dentro de los datos de desempeo existentes, sin embargo
debera verificarse dicho nivel de desempeo
Se asume que los mtodos de referencia pueden usarse sin previa realizacin de pruebas
para obtener datos de desempeo , est afirmacin no es segura.
Reglas recomendadas al usar mtodos validados
5.1 El analista debe estar completamente familiarizado con el mtodo y con la base
cientfica del mismo antes de usarlo por primera vez, y trabajar en principio bajo
supervisin.
5.2 El analista de alcanzar los niveles de desempeo establecidos por el mtodo.
5.2 Optimizar el nmero de muestras que puede ser analizadas a un tiempo
determinado.
5.4 Asegurar que se cuenta con todos los elementos establecidos en el mtodo y
bajo sus especificaciones para su ptimo desarrollo antes de iniciar el trabajo. Esto
involucra equipos, materiales de referencia , reactivos, instalaciones, infraestructura,
condiciones ambientales etc bajo especificacin y debidamente controlados.
5.5 Si es necesario adaptar el mtodo o realizar algn cambio el proceso de
revalidacin ser necesario.
6. Utilizacin de datos de validacin para designar el control de calidad
6.1 Aseguramiento de la calidad : mediciones prcticas realizadas para segurar y
regular la calidad
6.2 Control de calidad : tcnicas operacionales y actividades que son usadas para
satisfacer los requisitos de calidad. Mediciones individuales que se relacionan
al monitoreo y control de operaciones particulares.
Relacin entre validacin y aseguramiento y control de calidad :
La validacin de un mtodo da una idea de las capacidades de desempeo
y las limitaciones del mtodo que son experimentadas al emplearse
rutinariamente cuando el mtodo se encuentra en control. En el uso

cotidiano es necesario aplicar los controles al mtodo para verificar que

contina bajo control y que se est desempeando de acuerdo a lo
esperado. En la prctica lo ideal es que dichos controles se efecten con
cada lote de muestras como parte del proceso de control de calidad.
Las clase de revisiones depender de
su naturaleza
la frecuencia
lo crtico del anlisis
el tamao de lote
el grado de automatizacin
la dificultad de la prueba
la experiencia durante el proceso de desarrollo y de validacin
El control de calidad puede tomar variedad de formas en forma interna al
laboratorio o en forma externa.
Control de calidad interno
Este control incluye la utilizacin de :
- blancos
- estndares de calibracin
- muestras adicionadas
- muestras ciegas
- muestras rplica
- muestras de control de calidad
se recomienda el uso de cartas de control para monitorear los resultados de los
controles, principalmente de las muestras de control.
Los tipos de control de calidad empleados deben ser optimizados y ser suficientes
para asegurar la validez de los resultados, se pueden emplear diferentes clases de
control de calidad para evaluar diferentes tipos de variacin dentro del proceso.
Con el fin de establecer lmites reales en las cartas de control , los clculos
iniciales de la media y de la desviacin estndar deben reflejar la forma en que el
mtodo pretende usarse diariamente. De este modo las lecturas deben imitar
todas las posibles variaciones en las condiciones de operacin : diferente analista,
variaciones en la temperatura del laboratorio etc.
Si no se hace esto, la desviacin estndar ser irrealmente pequea, resultando
en lmites en la carta que no sern posibles de obtener en el uso normal.
Para un anlisis de rutina un nivel de control de calidad interno del 5 % es
razonable , para mtodos de rutina robustos con un gran nmero de muestras un
nivel menor de muestras de control puede ser razonable. Para procedimientos ms
complejos un nivel del 20 % y en ocasiones hasta del 50% puede requerirse. Para
anlisis poco frecuentes un sistema de validacin completo debe realizarse en
cada ocasin. Aquellos anlisis realizados con frecuencia debern ser objeto de
procedimientos sistemticos de control de calidad incorporando el uso de cartas de
control de calidad o muestras de control.

Control de calidad externo : pruebas de aptitud

Las pruebas de aptitud tcnica son una forma de monitorear el desempeo del
laboratorio contra sus propios requisitos y contra la norma de laboratorios similares
, implica la participacin peridica en programas de pruebas de eficiencia. (PT).
Importancia de estas pruebas para :
Asegurar el desempeo de la reproducibilidad entre laboratorios
Detectar errores sistemticos
Monitorear la trazabilidad
Verificar el aseguramiento de la calidad y tomar las acciones
necesarias
A menudo pueden no existir esquemas relevantes a ciertos tipos de anlisis
que el laboratorio desea verificar si se trabaja aisladamente.
7. Documentos de los mtodos validados
Al completarse el proceso de validacin es importante documentar los procedimientos
para que el mtodo pueda ser implementado claramente, puesto que cuando el mtodo
sea usado se har de la misma manera cada vez, de no hacerse as el desempeo no
corresponder al nivel preestablecido por la validacin de los datos. La documentacin
adems es necesaria para propsitos de auditora y de evaluacin y ser requerida para
propsitos contractuales o regulatorios.
Varias normas de referencia proporcionan una gua de que clase de informacin debe
incluirse cuando se documenta un mtodo. A continuacin se presenta un esquema
basado en la norma ISO 78/2 :
Protocolo de Documentacin del mtodo
0
0.1
0.2

Resumen de Actualizacin y Revisin

Actualizaciones
Revisin

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Ttulo
Alcance
Precauciones de advertencia y seguridad
Definiciones
Principio
Reactivos y Materiales
Aparatos y equipos
Muestreo y muestras
Calibracin
Control de calidad
Procedimiento
Clculos
Reporte de procedimientos incluyendo la expresin de resultados

14
15
16

Referencias normativas
Apndice en validacin del mtodo
Apndice en incertidumbre de la medicin
Los mtodos documentados forman una parte importante del sistema de calidad
de un laboratorio y deben ser objeto de un grado de control de documentacin
apropiado. El propsito de esto es asegurar que slo los mtodos y
procedimientos que han sido autorizados como convenientes para su uso son de
hecho utilizados.
Los mtodos deben ser actualizados con el tiempo. El control de la documentacin
permite el retiro de los mtodos obsoletos y la edicin de mtodos revisados. Los
cambios pueden realizarse con la correspondiente autorizacin y esto debe ser
debidamente controlado.

Cartas de control
Los grficos de control constituyen la forma ms cmoda y verstil de llevar a cabo el
control de calidad interno en los laboratorios. El origen de estos grficos hay que situarlo
en los aos 30, cuando el Dr. Shewhart los dise a partir de ah se fueron incorporando
en numerosos mbitos productivos as como en laboratorios de diferente tipo.
Un grafico de control representa los valores de una muestra de control introducida en
anlisis de rutina con una frecuencia preestablecida para evidenciar deficiencias en el
proceso analtico de medida e imponer las acciones correctivas pertinentes tan pronto
comosea posible ( Seminario sobre Trazabilidad, Incertidumbre y Validacin, Dr. Angel
Ros Castro Universidad de Crdoba (Espaa))
Grficos de Shewhart
Utilizados con distintas finalidades
_

x + 3s/n ------------ lmite de actuacin superior ----------------_

x + 2s/n ------------ lmite de aviso superior ----------------------_

Parmetro medido

x ---------------valor medio muestra de control --------------------_

x - 2s/n ------------ lmite de aviso inferior ------------------------_

x - 3s/n ------------ lmite de actuacin inferior ------------------n de muestra de control

Se obtienen n observaciones del proceso de medida determinndose el valor promedio

_

x y la desviacin estndar s. Se establece el valor central del grafico en el eje vertical

dado por el promedio , siendo el mejor estimado del valor del mensurando. Se localizan
alrededor de este valor central los lmites a 2 y 3 veces el valor de la desviacin estndar.
Los lmites a 2s son llamados lmites de aviso y la zona entre ellos debe incorporar
aproximadamente al 95 % de los resultados.
Los lmites a 3s son llamados lmites de actuacin y la zona entre ellos debe incorporar
aproximadamente al 99 % de los resultados.
Una vez obtenido el grfico ( con mayor o igual a 20 observaciones ) los valores obtenidos
en las muestras de control se van ingresado al grfico de manrea que sea rpida y
sencilla la deteccin de cualquier tendencia o desvo.
Se dan las siguientes pautas :
- si los valores estn siempre entre los lmites de aviso el proceso est bajo
control y los resultados cumplen los requisitos de calidad
- si un resultado est fuera de los lmites de aviso no requiere ninguna accin si
el siguiente est dentro de dichos lmites
- si dos resultados consecutivos se encuentran fuera de los lmites de aviso pero
dentro de los lmites de accin se debe revisar el proceso de medida y detectar
la causa del comportamiento. Si ambos valores estn del mismo lado del valor
promedio pueden ser indicativo de un error sistemtico, si estn a ambos lados
puede ser indicativo de variaciones aleatorias.
- Si un resultados est fuera de los lmites de actuacin el procedimiento est
fuera de control. En este caso se rechazan todos los resultados posteriores al
ltimo resultados situado dentro de los lmites. Se corrige la anomala y el
control estadstico debe ser reestablecido ( esto se consigue cuando tres
resultados consecutivos nuevos se encuentra dentro de los lmites) antes de
aceptar nuevos resultados.
- Si un punto se encuentra en la zona entre los lmites de aviso y de actuacin
se debe considerar la posicin del siguiente punto, as :
o Si dicho punto est dentro de los lmites de aviso el proceso est bajo
control
o Si dicho punto est tambin situado en la zona entre los lmites de aviso
y de actuacin el proceso est fuera de control. Y todos los resultados
de las muestras analizadas luego del primer punto situado en la zona
entre ambos lmites deben ser desechados y analizados nuevamente
luego de corregida la anomala y de verificar que el proceso se
encuentre nuevamente bajo control.
Si ambos puntos situados en la zona entre los lmites de aviso y de
actuacin se encuentran al mismo lado del valor promedio es indicativo
de la presencia de un error sistemtico , si se encuentran en lados
distintos es indicativo de variaciones aleatorias mayores a las
aceptadas.
No deben existir tendencias ni agrupamientos alrededor del valor central.

12
10
8
6
Serie1

Serie2

Serie3

0
-2 0

20

40

60

80

100

Serie4

-4
-6
-8

Grficos de blancos
Permiten el control de los blancos reactivo, es decir de las condiciones de trabajo,
los reactivos y sistema de medida empleados en el proceso analtico. Se emplean n
valores independientes e individuales del blanco por cada serie de anlisis , los lmites se
establecen a partir de la desviacin estndar de la media
smedia = s / n
y los lmites siguen los mismos principios de los grficos de valor central.
Grficos de porcentajes de recuperacin
Detectan variaciones debida a la matriz de las muestras cuando estos errores son
proporcionales puesto que si son aditivos no son detectados.
Se emplean muestras fortificadas y se realiza el clculo de porcentaje de recuperacin
(%R)
%R = (( x fortificada x )/ f ) * 100
donde f : es el valor de fortificacin empleada, que debe ser aadida sin exceder el lmite
superior de determinacin del analito.
La sustancia aadida debe contener al analito
- y tener solubilidad parecida
- reaccionar en forma similar
- estar en las mismas condiciones de estado de oxidacin
que en la muestra
el volumen aadido debe ser mnimo y realizar los clculos de correccin
correspondientes.

120,0000
115,0000
110,0000
105,0000

Serie1

100,0000

Serie2

95,0000

Serie4

Serie3

90,0000
85,0000
80,0000
0

10

20

30

40

50

Grficos de recorrido
Son grficos de control para evaluar precisin. Se trabaja con el rango o recorrido que se
define como la diferencia entre el mximo y el mnimo valor de las rplicas realizadas.
Para la construccin de este tipo de grficos se debe tener la siguiente informacin:
-

n : nmero de medidas o rplicas por subgrupo

N : nmero de subgrupos
Ri : rango o recorrido del subgrupo i

R : rango o recorrido promedio

UWL : lmite de aviso superior

= DWup *

LWL : lmite de aviso inferior

= DWlow*

UCL : lmite de actuacin superior= DClow*

LCL : lmite de actuacin inferior = DClow* R

R
_

Siendo los valores tabulados obtenidos en tablas

Las situaciones fuera de control de este tipo de grficos son las siguientes :
-

Un punto por encima de la lnea de control

Siete puntos consecutivos mostrando una tendencia positiva o negativa

Siete puntos consecutivos por encima de la lnea de

Cuando se observen ciclos.

0,0035
0,0030
0,0025
0,0020
0,0015
0,0010
0,0005
0,0000
-0,0005

10

20

30

40

50

-0,0010

Bibliografa
El presente documento se encuentra basado en la informacin extraida de los siguientes
documentos
(1)
The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to
Method Validation and Related Topics - EURACHEM Guide 1998
( en los temas de validacin)
(2)
Seminario sobre Trazabilidad, Incertidumbre y Validacin Su aplicacin a
Laboratorios de Ensayos Qumicos Dr Angel Ros Castro Universidad de
Cordoba ( Espaa)
( en los temas de cartas de control )
(3)
Gua para la Expresin de la Incertidumbre en la Medicin
BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML 1999
( en los temas de estimacin de la incertidumbre de la medicin )
adems de ser , cada uno de ellos, valioso material para el desarrollo de cada
tema involucrado en este texto.
Y como material bibliogrfico de consulta adicional, el siguiente:
(4)
Guide Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement
EURACHEM Guide 2000
(5)
Guidelines for Evaluating and Expressing the Uncertainty of NIST
Measurement Result Taylor, B ; Kuyatt, C 1994.