Universidad Nacional “San Luis Gonzaga”

DEGRADACIÓN DE PETRÓLEO POR BACTERIAS HIDROCARBUROCLÁSTICAS
PRACTICA N°5 DE BIOTECNOLOGÍA

DOCENTE: DRA. ROSA ALTAMIRANO DÍAZ PRESENTADO POR: BRAVO ROMERO, ANGELA F. HUAMÁN CAICHIHUA, NADIA LOPEZ MONTOYA, VICTOR W. RAMOS BURGOS, ALFREDO J. VALVERDE LUNA, KATHERINE

X CICLO
ICA – PERÚ 2010

DEGRADACIÓN DE PETRÓLEO POR BACTERIAS HIDROCARBUROCLÁSTICAS PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA

PRACTICA N°5 DEGRADACION DE PETROLEO POR BACTERIAS HIDROCARBUROCLASTICAS

I. INTRODUCCIÓN La industria petroquímica es importante en una sociedad moderna, no obstante la falta de un programa de protección ambiental, hace que el medio ambiente se contamine al producirse derrames de petróleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a través de fisuras de la corteza terrestre y debido a la producción, transporte y almacenamiento de este recurso natural (3). El petróleo crudo es una mezcla extremadamente compleja y variable de compuestos orgánicos, donde la mayoría de los ellos son hidrocarburos, que varían en peso molecular desde el gas metano hasta los altos pesos moleculares de alquitranes y bitúmenes. Estos hidrocarburos pueden presentarse en un amplio rango de estructuras moleculares: cadenas lineales y ramificadas, anillos sencillos, condensados o aromáticos. Los dos grupos principales de hidrocarburos aromáticos son los monocíclicos, el benceno, tolueno y xileno (BTEX) y los hidrocarburos policíclicos (PAHs) tales como el naftaleno, antraceno y fenantreno (2). Los dispersantes químicos utilizados para favorecer la biorremediación de los ambientes contaminados pueden causar un mayor impacto ecológico que el mismo derrame, por su toxicidad y recalcitrancia a la biodegradación. Por tanto, una mejor alternativa de solución es el proceso de biorremediación, que es el tratamiento biológico del suelo, aire y agua, mediante la biodegradación de compuestos tóxicos para transformarlos en compuestos de menor o ningún impacto ambiental. Así en la biodegradación de hidrocarburos, se utilizan bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas: Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia, Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp., Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la concentración de hidrocarburos presentes en el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente. Estas bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensión superficial entre el petróleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a la fuente de carbono insoluble para su degradación (1). Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo fundamental evaluar el potencial de biodegradación de hidrocarburos que tiene un consorcio bacteriano recientemente aislado, determinando la biomasa inicial y final en el biorreactor, y que sirva como una alternativa para la solución de los problemas generados por estos compuestos en la industria petrolera peruana.

OBJETIVO BACTERIANO

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II. MATERIALES Material biológico:  Cepas mixtas de Bacterias Hidrocraburoclásticas Equipo:  Balanza analítica  Incubadora  Biorreactor burbujeado. Cristalería:  Matraz Erlenmeyer de 500 y 1000 mL  Pipetas de 5 y 10 mL  Vaso de precipitados de 250 y 1000 mL  Tubos de Ensayo 18 x 150  Tubos de Ensayo 18 x 150  Placas petri  Frasco Schott Utensilios:     Asa y porta-asa microbiológica Mechero Pinzas de disección Perlas de vidrio

Varios:      Algodón Papel Craff Papel aluminio Ligas Cinta de pH.

Insumos y Reactivos:      Caldo Petróleo al 5% Agar Nutritivo Agar Plate Count NaCl Agua destilada

III. PROCEDIMIENTO a) REACTIVACIÓN DE LA CEPA Se repicó por estría dos cultivos mixtos de bacterias hidrocarburoclásticas aisladas en tubos con agar nutritivo. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.

Repicaje de las cepas

b)

PREPARACIÓN DEL INÓCULO Proliferación celular: Se sembró en toda la superficie de 2 placas con agar nutritivo e incubó a 37ºC por 24 horas.

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Cultivo proliferado

Cosecha celular: a. Añadimos 3 ml de SFF estéril en cada placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio estériles. Luego movimos las placas suavemente hasta obtener una suspensión celular.

Agregando la Solución Salina Fisiológica

Removiendo células con perlas de vidrio

b. Se extrajo la suspensión celular y lo colocamos en un frasco schott de 150 ml estéril.

Extrayendo la suspensión bacteriana.

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Obtención del inóculo: a. Realizamos el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar Plate Count de diluciones seriadas del cultivo (aprox. Entre 107 y 108 UFC/ml). EL CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DEL INÓCULO SE OBTENDRÁ EN LOS PASOS SIGUINTES c) PREPARACIÓN DEL BIORREACTOR Armar y esterilizar el biorreactor de columna burbujeado.

Armando el Biorreactor de columna burbujeado

d)

PRODUCCIÓN DE BIOMASA

a. Se colocó 5 ml. del inóculo y el medio base + petróleo (caldo petróleo) al 5% hasta un
volumen de trabajo de 800ml. en el biorreactor.

Caldo petróleo al 5%

Agregando el caldo petróleo

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Agregando el inóculo

b. Se sembró por incorporación en 3 placas con agar Plate Count para obtener la Concentración Inicial de Fermentación y con este dato obtener la Concentración del Inóculo y se incubó a 37ºC por 24 horas.

Calculo de la Concentración del Inóculo 8.3 x 1010 UFC/ml.

Concentración Inicial de Fermetación obtenida: Ci = ? V1= 5 ml.

CIF = 8.3 x 1010 UFC/ml. V2 = 805 ml.

Ci x V1 = CIF x V2 (Ci) x (5 ml.) = (8.3 x 1010 UFC/ml.) x (805 ml.) CIF = 1.33 x 1013 UFC/ml

c. Poner en funcionamiento ininterrumpidamente por espacio de 7 días a temperatura ambiente.

Con solo 1.35 de VVM

Comienzo de fermentación

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IV. RESULTADOS La evaluación de la Biodegradación del Petróleo se llevó a cabo solo por siete díaz, obteniendo lo siguientes datos:

A.

CARACTERÍSTICAS DEL FERMENTO

TABLA N°1 Características del Medio de Fermentación a los siete días Carácterística Primer día (*) Sétimo día

Turbidez

Menos turbio al principio dado que los hidrocarburos del Petróleo están intactos.

Mas turbio al término de la concentración dado que hay un aumento de subproductos del petróleo solubles.

Consistencia del Petróleo

Ascenso rápido de micelas de Petróleo, debido a la mínima degradación hasta esa momento.

Ascenso lento de micelas, debido a gran degradación de las cepas bacterianas al Petróleo

Concentración Bacteriana

Sin aumento

Aproximadamente a continúa en aumento, ya que todavía hay presencia de micelas.

(*) Se considera primer día al tiempo “0”

B.

CONCENTRACIÓN FINAL DE FERMENTACIÓN La concentración final de fermentación del Caldo Petróleo al 5% a los 7 días posterior al agregado el inoculo fue de: 2.1 x 1018

Recuento Final

Biorreactor a los 7 días de fermentación

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V. DISCUSIÓN

En Perú se registran derrames de petróleo desde 1978, los cuales contaminan el medio ambiente. Ante este problema surge la biorremediación como alternativa de solución, la cual es el tratamiento biológico de suelos, agua y aire, mediante la biodegradación. Adicionalmente es necesario la utilización de procedimeintos industriales adaptados para este método, debido a su validez adquirida a lo largo del tiempo y el tratamiento de grandes volúmenes. En el presente estudio, después de determinar un inóculo de 1.33 x 1013 UFC/ml, se presentó notable efectividad al realizar un proceso en la mitad del tiempo requerido, es decir que siendo necesario un tiempo de 15 días en el biorreactor, bastó con 7 días para poder visualizar y comprobar la degradación del petróleo.

VI. CONCLUSIONES

• El experimento fue un éxito, debido a que se determinó un resultado mediante el proceder de técnicas preestablecidas en la degradación de petróleo mediante un biorreactor de columna burbujeado. • El inóculo agregado al medio fermentación con petróleo al 5% fué más eficiente de lo esperado a los 7 días. • Se logró determinar el incremento de especimenes bacterianos hidrocarburoclásticos, a través del conteo de UFC del boirreactor antes y después de la fermentación. Teniendo en un principio de la degradación una cantidad de 8.3 x 1010 UFC/ml. y 2.1 x 1018 UFC/ml. al final de la degradación. • El incremento de la carga bacteriana hizo evidente una degradación parcial de los hidrocarburos del petróleo, lo cual se observó a simple vista en la parte superior del biorreactor. • El biorreactor de columna burbujeado utilizado fué efectivo para este procedimiento realizado con microorganismos aerobios, ya que el suministro de oxígeno (1.35 VVM) fue difundido aparentemente con notoria homogenicidad.

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VII. REFERENCIAS 1. Aycachi R. Biodegradación de Petróleo Diesel. [Internet]. Chiclayo-Perú, 2008. [Acceso 15 de abril del 2010]. Disponible en: http://www.scribd.com/doc/6440793/Biodegradacion-de-Petroleo-DieselPRESENTACION

2. Vargas, A. y col. Biorremediación de Residuos de Petróleo. [Base de datos en Internet]. Colombia, 2004. [Acceso 15 de abril del 2010]. Disponible en: http://ciencias.uniandes.edu.co/pdf/petroleo.pdf

3. Wedel, R.; Mosquera, J.; Goldsmith, D.; Hater, G.; Wong, A.; Fox, T.; Hunt, W.; Paules, M.; Guiros, J.; Iegand, J.1988. Biodegradación Bacteriana de Hidrocarburos del Petróleo en aguas residuales, in situ, en California. Water Science and Technology. 20 (11/12):501-530.

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