Bioqumica

Caracterizao e dosagem de casena no leite

Discentes: Julia Silva, Mariana Quintanilha, Mariana Tavares e Thamires

Reis
Docente: Priscilla de Souza
Turma: CAM 161
Prtica realizada em 01-06-2016
Entregue em 08-06-2016

INTRODUO
Protenas so macromolculas formadas por unidades denominadas
aminocidos. As protenas podem ser bem diversificadas, pois em sua estrutura esto
presentes vinte aminocidos ligados entre si atravs de ligaes peptdicas (ligao entre
o grupamento amina de um aminocido com um grupo carboxila de outro aminocido),
que o que forma as protenas. Os aminocidos possuem em sua estrutura um grupo
carboxlico, um grupamento amina, um tomo de hidrognio e um grupo R, que varia
sua composio dependendo do aminocido.
A casena uma protena conjugada pertencente classe das fosfoprotenas
(apresentam H3PO4) composta por aminocidos essenciais. Na natureza, essa protena
encontrada em maiores quantidades no leite de vaca e em quantidades considerveis no
leite humano. Atua como agente emulsificante, com a funo de manter unidas as
molculas de gua e de gordura que compem o leite. A grande variedade de
aminocidos confere casena um importante valor nutritivo, sendo, por isso,
classificada como protena nutriente ou de armazenamento.
A solubilidade das protenas depende de vrios fatores. Dentre eles, destaca-se a

presena das cargas eltricas ao longo da molcula. A existncia de uma carga positiva
ou negativa determina a interao com o meio aquoso, alm de estabelecer um estado de
repulso entre as prprias molculas de protena, aumentando a interao com o
solvente e, consequentemente, favorecendo a solubilidade.
As protenas podem ser purificadas de acordo com suas diferentes propriedades,
sendo elas: solubilidade, tamanho, carga e afinidade da ligao. No geral, as misturas de
protenas so sujeitas a muitos modos de separao, cada um baseado em uma
propriedade diferente at a protena pura ser alcanada, de fato.
As etapas iniciais buscam diminuir a solubilidade da protena que se quer
alcanar na inteno de precipit-la, para isso acontecer algumas tcnicas so
comumente empregadas, uma delas a precipitao isoeltrica que consiste na adio
de soluo cida concentrada gota - a gota. Em valores de pH afastados do ponto
isoeltrico, a solubilidade da protena maior devido a um aumento da carga lquida,
favorecendo a repulso entre as molculas de protena e possibilitando assim, a
formao de uma maior camada de solvatao. No ponto isoeltrico, como a carga
lquida zero, a fora de repulso entre as molculas e a camada de solvatao so
menores favorecendo a agregao e floculao das molculas.
Mtodo de biureto para caracterizao de protenas
O mtodo se baseia na reao do reativo de biureto, que constitudo de uma
mistura de sulfato de cobre pentahidratado, gua, tartarato duplo de sdio e potssio e
hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo. A reao
ocorre devido presena de pelo menos duas ligaes peptdicas, ou seja, reage com as
protenas no com os aminocidos. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas
formando um complexo de cor prpura com a ligao peptdica. Sendo assim, esse
mtodo eficaz apenas para a identificao de protenas em dada amostra.
Anlise da protena
O espectrofotmetro (Imagem 1) um aparelho amplamente utilizado em
laboratrios, cuja funo avaliar a concentrao de substncias, que absorvem energia
radiante, em um solvente em comprimentos de onda especficos. A partir da fonte de luz
presente no espectrofotmetro, escolhe-se qual comprimento de onda que deseja-se
utilizar. Tem-se conhecimento de que o espectro visvel est entre 400 a 800 nm e que
cada substncia colorida absorve dentro de uma faixa. Neste caso, o soluto em questo
(casena) que se quer dosar est dentro da faixa de 540 nm. O comprimento de onda
incide sobre a cubeta (j com a amostra tratada com biureto). A cor ento absorve
determinadas faixas de radiao e deixa passar outra parte. O espectrofotmetro informa
quanto de luz a amostra absorveu (absorbncia), enquanto a transmitncia informa
quanto a amostra no absorveu. A absorbncia proporciona valores varveis de 0 a 1
sem unidade. Dentro dessa faixa h uma equao que explicada pela Lei de LambertBeer:
log I0/I= cl
onde, I0 a intensidade da luz incidente; I a intensidade da luz transmitida; o
coeficiente de extino molar (em unidades litro por mol.centmetro); c a
concentrao da soluo a ser analisada (moles/litro); l a largura da cubeta (em
centmetros).

Imagem 1: Esquema do funcionamento interno de um espectrofotmetro

OBJETIVO
Determinar a concentrao de casena no leite pelo mtodo espectrofotomtrico.

MATERIAIS E MTODOS
Aparelhagem e materiais utilizados
Tubos de ensaio com tampa e sem tampa
Pipeta de 1, 2, 5 e 10 mL
Bquer de 100 mL
Estante para tubos de ensaio
Pipetador pi-pump
Papel de filtro
Funil
PHmetro
Basto de vidro
Reagentes
Leite desnatado;
Soluo de cido clordrico a 2%;
Soluo me de casena a 5 mg/mL;
Reagente de Biureto.

PROCEDIMENTOS
Precipitao isoeltrica de casena (PS)
Em um bquer de 100mL foi adicionado 10mL de leite e 10 mL de gua destilada
com auxlio de uma pipeta. Posteriormente, adicionou-se 1,5 mL de cido clordrico a
2%, vertendo aos poucos com uma pipeta de 2mL.
A amostra foi levada ao pHmetro, em seguida, filtrada utilizando papel de filtro,
funil e um bquer que ser o recipiente do filtrado.
Em um tubo de ensaio com tampa foi adicionado 1 mL do filtrado (TUBO 7)
Dosagem de protenas totais do leite (PT)

Foi adicionado em um tubo de ensaio 0,5 mL de leite desnatado e 9,5 mL de gua

destilada com auxlio de pipetas dispostas na bancada. Em um tubo com tampa foi
vertido 1 mL do leite diludo anteriormente (TUBO 8)
Preparao da curva de calibrao ou curva padro de
casena
Em uma estante foram dispostos 8 tubos de ensaio para iniciar a curva, onde os
tubos 7 e 8 j foram preparados nas etapas anteriores.Ser adicionado reagente de
biureto a eles aps a bateria dos seis tubos. A bateria foi preparada de acordo com a
tabela abaixo:
TUBOS
1
2
3
4
5
6
7
8
Soluo
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1.0
0
0
me (mL)
gua
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
0
destilada
(mL)
Reagente
5
5
5
5
5
5
5
5
de biureto
(mL)
Amostra
0
0
0
0
0
0
1.0
1.0
(mL)
Tabela 1: Volume em mililitros para a preparao da curva de calibrao

A soluo me (5 mg/mL de casena) foi adicionada com auxilio de uma pipeta

aos 6 tubos, em seguida, gua destilada. Posteriormente adicionado o reagente de
biureto aos 8 tubos e contabilizou 20 minutos de descanso a eles.
Os tubos foram utilizados para determinar a absorbncia no espectrofotmetro. A
leitura foi iniciada pelo tubo 1 com o objetivo de zerar o espectrofotmetro. Verteu-se
uma quantidade razovel em uma cubeta e a mesma foi colocada no espectrofotmetro,
seu valor anotado. O mesmo foi feito para o segundo tubo ao oitavo e todas as
absorbncias anotadas

RESULTADOS E DISCUSSO
O leite possui diversas protenas, como a lactoalbumina, lactoglobulina, casena,
entre outras. Para a prtica fez-se somente a dosagem da casena, para isso, houve a
necessidade de realizar a purificao utilizando o mtodo de precipitao isoeltrica. Foi
necessrio chegar ao pH ideal da casena de 4,6 para que a carga fosse zero (PI da
protena) e ocorresse a acidificao do meio.
I- Precipitao isoeltrica:
O pH do leite normal em mdia 6,7, sendo assim, para alcanar o pH de 4,6 e
realizar a precipitao foi necessrio adicionar um total de 3,5 mL HCl a 2%, atingindo
o pH de 4,61. Caso a quantidade de cido ultrapassasse o necessrio poderia ocorrer a
precipitao de outras protenas alm da casena.
Essa precipitao ocorre devido a igualdade entre o pH e o PI (zero) da protena,
pois no h repulso entre as molculas o que faz com que elas se agreguem.
Adicionou-se 1 mL do sobrenadante ao tubo 7 que consiste em protenas do
sobrenadante, o qual foi filtrado 2 vezes pois aps um tempo intacto houve a formao
de um precipitado que poderia interferir na espectrofotometria.

Figura 2: imagem do tubo 7

II- Dosagem de protenas totais do leite:

Para determinar a dosagem da casena necessrio calcular a diferena entre as
protenas totais do leite e as protenas do sobrenadante.
Para saber a concentrao de protenas totais foi utilizado o mtodo do Biureto. A
protena na presena de Cobre II (um dos elementos que constitui o Biureto) forma um
complexo de cor roxa, de forma que essa tonalidade seja proporcional ao teor de
protena no meio. Se aps adio de Biureto o mesmo apresentar colorao azul, sabe-se
ento que no h protena. Para saber essa concentrao em nmeros utiliza-se o
espectrofotmetro que expressa o quanto a soluo capaz de absorver luz. A
absorbncia proporcional concentrao do que estamos dosando, no caso, casena,
por isso quanto maior a absorbncia maior a concentrao da protena no meio.
Passados 20 minutos da adio de Biureto, viu-se que a colorao dos tubos se
comportou de modo a se intensificar na ordem crescente.

Figura 3: Tubos com adio de Biureto

Aps anlise no espectrofotmetro, obtiveram-se os seguintes valores de absorbncia

para os respectivos tubos:
Tubos
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3
Tubo 4

Absorbncia
0
0,025
0,070
0,0109

Tubo 5
Tubo 6
Tubo 7
Tubo 8

0,145
0,189
0,084
0,105

Tabela 2: Valores da absorbncia

III- Preparao da curva de calibrao:

Para montar a curva de calibrao em funo da absorbncia e concentrao
mg/mL, h uma relao entre absorbncia X massa de casena, o clculo da massa de
casena presente nos tubos de 1 ao 6 feito a partir da concentrao da soluo me de
casena pela seguinte proporo:
5mg _____ 1mL
X mg ____ Y mL
OU
C1.V1=C2.V2
Branco
TUBOS

Curva de
calibrao
3

Absorbnc
ia
[]
(mg/mL)

0,025

0,070

0,109
3

0,145

0,18
9
5

0,08
4

0,10
5

Tabela 3: Valores da absorbncia e concentrao

Essa curva relaciona absorbncia com concentrao, nos fornecendo a equao

sobre a qual possvel descobrir o que se deseja, no caso, a concentrao de protenas
nos tubos 7 e 8.

Grfico 1: Curva de Calibrao - Absorbncia versus concentrao de protenas.

Atravs do grfico, obteve-se a seguinte equao:

y= 0,0403x - 0,0133.
Substituindo os valores das absorbncias na equao descrita acima, de forma
que y seja igual absorbncia e x igual concentrao de protenas em cada tubo, temos:
Tubo 7 (Protenas do
sobrenadante)
0,084 = 0,0403x 0,0133
0,084 + 0,0133 = 0,0403x
X= 0,0973/0,0403
X=~2,414 mg/mL

Tubo 8 (Protenas totais)

0,105 = 0,0403x 0,0133
0,105 + 0,0133 = 0,0403x
X = 0,1183/0,0403
X=~2,935 mg/mL

Aps a obteno dos valores de concentrao de protena atravs da equao,

calculou-se a diluio para saber as concentraes de PS e PT no leite:
Tubo 7 (PS)
C7curva * 20 = C7real*10
2,414 * 20 = C7 real*10
48,28 = 10* C
C = 4,828 mg/mL
Tubo 8 (PT)
C8curva *10 = C8real* 0,5
2,935*10 = C8 * 0,5
29,35 = 0,5 * C8
C8= 58,7 mg/mL
Alterou-se as concentraes obtidas de PS e PT de mg/mL para % p/V (g/100 ml) a
fim de calcular a concentrao de casena no leite:
TUBO 7
X------100 mL
0,00482 ---- 1 mL
X = 0,4822 %p/v (g/100mL)

TUBO 8
0,0587 --- 1 mL

X ---- 100 mL
X = 5,87%p/v (g/100mL)

Calculou-se a concentrao de casena no leite:

Ccasena = PT PS
C = 5,87 0,4822
C = 5,38% p/v
Calculou-se o teor de casena:
PT --- 100%
Ccasena --- X (teor)
58,7 ---100%
5,38 ----x
X = 9,16 %

CONCLUSO
Com os experimentos realizados no laboratrio, foi possvel encontrar 91,6%
para o teor de casena no leite mas como o valor descrito na literatura de at
aproximadamente 80%, pode-se concluir que este o mesmo foi ultrapassado, ou seja, o
valor da casena no leiite se encontra fora da faixa proposta. Esta incompatibilidade de
resultados, no modo prtico e terico, pode estar associado a erros na execuo do
experimento."

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1. NEVES. Determinao do ponto isoeltrico da casena, Araraquara. Disponvel em
<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/ponto_isoeletrico.h
tm> . Acesso em 02-06-2016
2. CARDOSO.
Casena.
Infoescola.
Disponvel
em
<http://www.infoescola.com/compostos-quimicos/caseina/> . Acesso em 02-06-2016
3. LICHTIG.
DETERMINAO
DE
PROTENAS
TOTAIS
VIA
ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MTODOS
EXISTENTES.
Qumica
Nova.
Disponvel
em
<http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914> Acesso em 02-06-2016