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OBJETIVOS

Aislar DNA cromosmico de alto peso molecular de un microorganismo


Gram negativo (Escherichia coli W3350).
Establecer el espectro de absorcin del DNA aislado.
Determinar la concentracin y el grado de pureza del DNA obtenido.
Mediante la aplicacin del programa bioinformtico DNAMAN: determinar la
influencia de algunas caractersticas de la secuencia de DNA sobre su
desnaturalizacin.

INTRODUCCIN
Existen dos tipos de cidos nucleicos, el cido ribonucleico (RNA) y el cido
desoxirribonucleico (DNA).
Los cidos nucleicos son biomolculas que actan como depositarios y
transmisores de la informacin gentica. Son biopolmeros de alto peso molecular,
constituidos por unidades ms sencillas o monmeros que estn conectados por
enlaces covalentes, llamados nucletidos.
En cada caso, la unidad monomrica (nucletido) contiene un azcar de cinco
carbonos, ribosa en el RNA y la 2 desoxirribosa en el DNA, la diferencia en los
dos azcares radica nicamente en el grupo hidroxilo 2 de la ribosa en el RNA,
que esta sustituido por hidrogeno en el DNA. La conexin entre sucesivas
unidades monomricas en los cidos nucleicos se realiza mediante un residuo
fosfato unido al hidroxilo del carbono 5 de una unidad y al hidroxilo 3 de la
siguiente, por lo tanto se forma un enlace fosfodister entre estos dos residuos de
azcar. El grupo fosfato es un cido fuerte por esta razn se les denomina al DNA
y RNA cidos nucleicos. Cada monmero contiene una base heterocclica, que
siempre va unida al carbono 1 del azcar, a esta unin se le denomina enlace
glucosdico. Existen dos tipos de bases heterocclicas, que se denominan puricas
y pirimidinas. El DNA tiene dos purinas adenina (A) y guanina (G) y dos
pirimidinas, citosina (C) y timina (T). El RNA posee las mimas bases, excepto que
la timina esta sustituida por un uracilo (U).
Un nuclesido est compuesto por una base nitrogenada y azcar por un enlace
glucosdico-.
Dado que todos los cidos nucleicos pueden considerarse polmeros de
nucletidos, suele llamrseles de manera genrica polinucletidos. Los polmeros
pequeos, que contienen slo algunos residuos, se denominan oligonucletidos.
Como consecuencia de los sistemas de dobles enlaces conjugados los anillos de
purina y pirimidina, las bases y todos sus derivados (nuclesidos, nucletidos y
cidos nucleicos) absorben intensamente la luz en la regin del espectro del
ultravioleta cercano (230 nm a 280 nm espectro de absorcin caracterstico del
DNA). Los nucletidos constituyentes de las cadenas ya desnaturalizadas

absorben ms luz de 260 nm fenmeno el cual recibe el nombre de efecto


hipercrmico (aumento de la intensidad de la absorcin). Esta intensa absorbancia
se utiliza para la determinacin cuantitativa de los cidos nucleicos, ya que
permite medir las concentraciones de cido nucleico con una deteccin de
microgramos/mL mediante espectrofotometra. La temperatura a la cual se
encuentra desnaturalizado el 50% de la molcula del DNA en solucin se
denomina temperatura media de desnaturalizacin Tm, que es caracterstica de
cada molcula de DNA, la Tm tambin es conocida como temperatura de fusin.
Debido a la gran longitud del DNA y su dimetro pequeo (20 ), este es
sumamente rgido y cuando se solubiliza da lugar a soluciones muy viscosas, la
molcula puede romperse con gran facilidad al aplicar fuerzas de friccin.
A finales de la dcada del siglo XIX, poco despus de que el bioqumico alemn
Friedrich Miescher hubiera aislado por primera vez DNA del esperma de salmn,
algunos cientficos sospecharon que el DNA era el material gentico.
En 1944 Oswal Avery, Colin MacLaeod y Maclyn McCarty descubrieron que el
DNA de cepas patgenas de la bacteria Pneumococcus poda transferirse a cepas
no patgenas esta trasformacin era genticamente estable y las generaciones
sucesivas bacterianas conservaban las nuevas caractersticas. Sin embargo, fue
un elegante experimento realizado por Alfred Hershey y Martha Chase el que
convenci finalmente a muchos cientficos. Ellos demostraron que la transferencia
de DNA vrio de un virus a una bacteria lo que daba origen a nuevos virus.
ESTRUCTURA PRIMARIA
Una cadena polinucleotdica posee individualidad, determinada por la
secuencia de nucletidos. Esta secuencia se denomina estructura primaria.
Una cadena polinucleotdica posee un sentido o direccionalidad, la
secuencia de nucletidos se ordena desde 5 a 3 (5 3).
La importancia principal, es que la informacin gentica se almacena en la
estructura primaria del DNA, esta estructura codifica la informacin gentica.
ESTRUCTURA SECUNDARIA
En 1953, James Watson y Francis Crick propusieron una estructura para el DNA,
Es una cadena doble o doble hlice, dextrgira o levgira segn el tipo de ADN,
antiparalela, ambas cadenas son complementarias, pues la adenina de una se une
a la timina de la otra, y la guanina de una a la citosina de la otra, con 10 pares de
bases por vuelta, estas bases enfrentadas son las que constituyen los puentes de
hidrgeno. Tambin son posibles otras clases de estructuras secundarias en
circunstancias especiales, como la forma A, B y Z, las dos primeras de hlices
derechas y la ltima izquierda.
ESTRUCTURA TERCIARIA
Se refiere a como se almacena el ADN en un volumen reducido. Vara segn se
trate de organismos procariontes o eucariontes.

A) En procariontes se pliega como una sper-hlice en forma, generalmente,


circular y asociada a una pequea cantidad de protenas.
B) En eucariontes el empaquetamiento ha de ser ms complejo y compacto y para
esto necesita la presencia de protenas, como son las histonas y otras de
naturaleza no histona. A esta unin de ADN y protenas se conoce como
cromatina.
En la actualidad es posible analizar algunas caractersticas de la molcula de DNA
en poco tiempo y de manera precisa, debido al avance en la bioinformtica. Con
base a lo mencionado en esta prctica analizaremos algunos parmetros que
pueden
influir
sobre
la
temperatura
de
desnaturalizacin
de
oligrodesoxirribonucleotidos mediante el uso de un programa bioinformtico.
CLCULOS
Ejemplo de los clculos utilizando los datos obtenidos del equipo 7.
Concentracin [g/ml]

Frmula para calcular la concentracin de DNA


As 260 nm
C=
Ae x b
24.627
C= 22500 x 1 cm

= 1094.53 g/ml

Relacin entre absorbancia y concentracin de DNA


1 unidad de As260nm de =
50 g/ml de DNA
DNA de doble cadena
de doble cadena
24.627 = X g/ml
X=1231.35 g/ml
Pureza de la solucin de DNA

Frmula para calcular la pureza de DNA

As 260 nm
Pureza= As 280 nm

24.627
Pureza= 11.755

= 2.095

Tabla 1. Resultados de cantidad obtenida y pureza en el aislamiento de DNA de


Escherichia coli.
Concentracin
[g/ml]

Absorbancia
Equipo

Pureza

Volumen
obtenido
L

Cantidad
obtenida
g

C=

As 260 nm
Ae x b

1As260nm
=50g/ml

260nm

280nm

24.627

11.755

2.095

1094.53

1231.35

33

40.62

22.150

11.010

1.995

984.44

1107.5

35

38.76

17.722

8.337

2.028

787.64

886.10

26

23.03

10

5.540

2.741

2.021

246.22

277.00

27

7.48

11

9.908

4.904

2.020

440.30

495.40

37

18.00

12

68.469

33.131

2.066

3044.26

3423.45

28

98.60

Tabla 2. Absorbancia de la muestra de DNA del equipo 7 a diferentes longitudes


de onda.

Longitud de onda
(nm)

Absorbancia

230

10.276

240

16.03

250

23.216

260

24.627

270

19.154

280

11.755

290

4.759

300

0.87

30

25

20

Absorbancia

15

10

0
220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

Longitud de onda (nm)

Grfico 1. Espectro de absorcin al UV del DNA de E. coli W3350. Equipo 7.


DISCUSIN

Se obtuvo una muestra de la cepa W3350 de Escherichia coli y se centrifug para


separar del cultivo de caldo Luria. El paquete celular se suspendi en TE
(Tris/EDTA) pH 7.8, para eliminar los restos celulares este paso tiene la funcin de
ser un lavado, el EDTA es un agente quelante el cual quela al cofactor Mg 2+ y as
impide la accin de las nucleasas. Se centrifugo de nuevo eliminando el
sobrenadante y se resuspendi el precipitado en TE con ayuda de un vrtex para
separar todas las clulas y as aumentar la superficie de contacto y lograr que
todos los reactivos lleguen a la clula, la solucin de TE pH 7.8 tambin sirve para
proteger las RNAsas que se agregaran en el siguiente paso, ya que le
proporcionan al medio las condiciones adecuadas para que estas acten sobre el
RNA y se permita la purificacin del DNA.
Posteriormente agregamos RNasa la cual tiene la capacidad de degradar al RNA y
se dej incubar, ya que estas necesitan una temperatura ptima para poder actuar
sobre el RNA que hay fuera de las clulas, posteriormente se agreg lisozima y
SDS, la primera tiene la funcin de romper los enlaces 14 Glucosdico de la
pared celular de la bacteria y el segundo reactivo funciona solubilizando los
fosfolpidos de la membrana celular, y as con ambos compuestos se lleva a cabo
la lisis celular.
En este paso hubo un aumento en la viscosidad de la solucin, debido a que se
lisaron las clulas y el material gentico quedo expuesto y una de las
caractersticas de DNA es que presenta una alta viscosidad debido a que se trata
de una molcula muy larga y rgida.
Posteriormente incubamos y se agreg TE con una concentracin menor a la
inicial porque ya se han desnaturalizado protenas, sea disminuye la cantidad de
nucleasas y as acta bien una concentracin menor de TE, este se utiliz para
solubilizar al DNA y facilitar su extraccin. Tambin se agreg cloruro de sodio,
para aumentar la fuerza inica y desproteinizar la muestra.
Posterior a esto se agreg fenol a la solucin y se agit por inversin para formar
una emulsin, debe de intentar homogenizarse muy bien antes de que se
centrifugue, ya que la finalidad es que ambas partes interacten y se puedan as
separarse las protenas desnaturalizadas por accin del fenol en una interfase. Se
utiliza fenol ya que las protenas no son solubles en l.
Se realizaron dos lavados con fenol para eliminar la mayor cantidad de protenas
posibles. Despus se extrajo el sobrenadante que es la fase acuosa donde se
encuentra el DNA y se deposit en otro microtubo Posteriormente se agreg una
mezcla de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1, este se agrega para desproteinizar,
precipitar todo lo que es soluble en cloroformo, como protenas restantes, lpidos

de las membranas, y el fenol residual. Es importante extraer todo el fenol de la


solucin, ya que este nos puede interferir en estudios posteriores que se quieran
realizar en la muestra de DNA por ejemplo en una PCR donde se ocupa a la DNA
polimerasa al ser una protena desnaturalizarla.
Una vez centrifugado lo anterior se extrae la fase acuosa y a esta se le agreg
etanol absoluto fro, con la finalidad de deshidratar al DNA y al estar fro baja la
solubilidad y lo precipita. Se centrifug y decanto cuidadosamente sin eliminar el
botn de DNA para posteriormente seguir deshidratando con etanol al 70% esto
para que el agua (30%) que se encuentra en la solucin de etanol solubilice los
restos de cloruro de sodio y creen una esfera de solvatacin para ayudar a
precipitar la mayor cantidad de DNA.
Finalmente la muestra se dej secar, y se le agreg 10

L de agua inyectable

para su posterior lectura en el espectrofotmetro nanodrop, donde se requiere solo


una pequea cantidad de la muestra para analizar.
Se ley el espectro del DNA en un espectrofotmetro nanodrop y se obtuvieron los
datos de absorbancia en un rango de longitud de onda de 230nm a 290nm.
Posteriormente se utilizaron los datos obtenidos para realizar la caracterizacin del
DNA aislado.
En la tabla 1 se observan los resultados de pureza y concertacin de los 7
equipos. Los datos obtenidos de pureza se encuentran dentro de un rango de 1.8 2.1, por lo cual se consideran que el aislamiento de DNA se realiz correctamente.
De no encontrarse dentro de este rango se puede asumir que se podra haber una
gran cantidad de protenas en la muestra y el aislamiento no fue adecuado.
De acuerdo con los resultados de concentracin se puede observar una amplia
variacin en las concentraciones de los diferentes equipos, esto se puede deber a
que algunos equipos tuvieron errores al realizar las extracciones con formol, ya
que pudimos observar que al intentar extraer el DNA algunas hebras se
encontraban en la interface, mezcladas con las protenas, esto provoc que no se
extrajera una gran cantidad de DNA, disminuyendo as la concentracin. Otro de
los errores es que al decantar el etanol absoluto se pudo haber desprendido el
botn de DNA. La concentracin calculada con la frmula vara respecto a la
calculada por la proporcin con una diferencia no significativa, pero la ms
aceptada es la de la proporcin.
En base a la concentracin calculada y a los L obtenidos se pudo conocer la
cantidad de DNA aislado, en el caso del equipo 10 obtuvieron una menor cantidad
ya que al homogenizar por inversin para realizar la extraccin con fenol no

tuvieron la precaucin de tapar bien el microtubo, teniendo as una gran prdida


de DNA, pseme a esto su pureza no se vio afectada.
En la grfico 1 se observa el espectro de absorcin de DNA del equipo 7, donde la
absorbancia mxima se encuentra a una longitud de onda de 260, como
consecuencia de los sistemas de dobles enlaces conjugados los anillos de purina
y pirimidina, tericamente los cidos nucleicos absorben intensamente la luz en la
regin del espectro del ultravioleta de 260 nm, lo que reitera que el aislamiento
fue correcto.