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INTRODUCCION

Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa ms rpidamente


debido a la presencia de catalizadores biolgicos llamados enzimas. Como
sucede con los catalizadores inorgnicos, las enzimas modifican la velocidad de
una reaccin qumica sin afectar el equilibrio final y slo se requieren pequeas
cantidades para efectuar la transformacin de un gran nmero de molculas de
sustrato.
Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente
fundamentalmente que la accin cataltica de las enzimas es de carcter
especfico; o
sea, cada reaccin qumica debe ser catalizada por una
determinada enzima. El reactante o sustancia qumica que reacciona para dar un
producto en un sistema enzimtico se llama sustrato, habra entonces tantos
sistemas enzimticos como sustratos reaccionantes existen en un organismo vivo.
Debido a que solo se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para
catalizar una reaccin dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse
directamente.
En general, la actividad de cualquier sistema enzimtico puede ser demostrada de
dos maneras:
1. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL) despus
de un tiempo determinado de incubacin en condiciones especficas de pH
y temperatura.
2. Verificando los productos liberados despus de un tiempo determinado de
incubacin en condiciones especficas de pH y temperatura.
La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad
enzimtica, utilizando a la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de
producir degradacin del almidn en maltosa (Disacrido reductor) y algo de
glucosa como ejemplo de un sistema enzimtico.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

I.

MATERIALES Y REACTIVOS
A. DE LABORATORIO:

Tubos de ensayo
Pipetas graduadas
Gradilla
Pinzas para tubos de ensayo

B. REACTIVOS A UTILIZAR:

Solucin de almidn pH 6.0 al 1%.


Cloruro de sodio solucin 0.1M
Enzima al 1% (amilasa salival).
cido Clorhdrico 0.05N
Solucin yodada.
Reactivo Folin Wu:

II.

Solucin Cprica alcalina.


Solucin fosfomolbdica.

PROCEDIMIENTO

Armar el siguiente sistema :


TUBOS
COMPONENTES

II

Solucin de almidn 1% pH 6.0

5 ml.

5 ml.

Solucin de cloruro de sodio 0.1M

1 ml.

1 ml.

Agua destilada

4 ml.

3 ml.

Colocar los tubos al bao de agua a 37C por 5 minutos.


Agregar 1 ml. de enzima al tubo II.
Volverlos a colocar al bao de agua a 37C durante 10 minutos.

EXPLICACIN: A simple vista el contenido del tubo I y II es


igual, lo cual no es correcto, ya que en el tubo II ocurri la
reaccin de la enzima Amilasa con el Almidn (enzimasustrato) pero no se visualiza porque no utilizamos el
marcador.

CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL.


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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

De cada uno de los tubos de incubacin transferir 0.5 ml. de su correspondientes del
cuadro siguiente, inmediatamente de cumplidos los 10 minutos.
TUBOS
COMPONENTES
cido clorhdrico 0.05 N
De los tubos I y II: Etapa A
Solucin yodada

I.1
5 ml.
0.5 ml.
0.5 ml.

II.2
5 ml.
0.5 ml.
0.5 ml.

MEZCLAR: Observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad


del color resultante.
EXPLICACION: El cambio de color del tubo I.1 de incoloro
a azul oscuro se debe a que el indicador usado (solucin
yodada) reacciono con la presencia del almidn (sustrato),
en cambio en el tubo II.2 el color amarillo claro se debi a
que el indicador no encontr sustrato sobre el cual
actuar, manteniendo el color caracterstico de la solucin
yodada.
CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS
(Folin WU)
TUBOS
COMPONENTES
De los tubos I y II: etapa A
Solucin Cprica alcalina
Hervir 8 minutos
Enfriar
Solucin fosfomolbdica
Agua destilada

I.1.1
1ml.
1ml.

II.2.2
1ml.
1ml.

1ml.
2ml.

1ml.
2ml.

Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del
color resultante
EXPLICACION: En el tubo I.1.1 se obtuvo un color celeste, distinto al tubo I.2.2
en el cual se obtuvo un color naranja, esto se debi a que la
solucin cprica reacciono con los productos de la reaccin enzimtica
que son azucares reductores como glucosa y maltosa, estos actan
sobre el cobre, reducindolo. Al agregar la solucin fosfomolbdica ocurren
diferentes cosas en los tubos. En el I.1.1 no se observ ningn cambio en el
color debido a que no hay ningn tipo de productos, en cambio en el II.2.2 pas

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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

del color naranja a un azul oscuro debido a la reaccin reductora de los


productos sobre el molibdeno (azul de molibdeno).

III.

CONCLUSIN

de
laboratorio
nos
permiti
que
determinar

La prctica de laboratorio nos permiti identificar que existen reactivos


llamados indicadores capaces de demostrarnos la actividad enzimtica a partir
de las variaciones de color que se mostraban en los tubos despus de cada
reaccin.
V.

CUESTIONARIO

1) QU MTODOS
ENZIMTICA?

CONOCE

PARA

DETERMINAR

LA

ACTIVIDAD

Verificando el sustrato no transformado (sustrato residual) despus de


un tiempo determinado de incubacin en condiciones especficas de pH
y temperatura.
Verificando
sus
productos
liberados
despus
de
un
determinado de incubacin en condiciones especficas de
temperatura.

tiempo
pH y

2) CMO SE PUEDE OBJETIVAR LA PRESENCIA DEL SUSTRATO


RESIDUAL?

En los ensayos de aspecto fotomtrico puede seguirse el curso de una


reaccin observando cmo cambia la luz absorbida por la solucin en la que se
est dando la reaccin, para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber
entre los sustratos a los productos algunos que absorba luz a una longitud de
onda determinado y que sea de esta forma, se puede observar el aumento o la
disminucin de la observacin a dicha longitud de onda. Cuando la luz
absorbida se muestra en el espacio visible es posible observar un
cambio en el color de la muestra y entonces hablaramos del mtodo
calormetro.

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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

3) CMO DEMOSTRAR SI SE HA PRODUCIDO O NO REACCIN


ENZIMTICA EN UN EXPERIMENTO REALIZADO?

Todos los ensayos enzimticos miden el sustrato consumido o el producto


generado en la reaccin durante un tiempo. Existe un gran nmero de mtodos
diferentes para medir la concentracin de sustratos y productos, y que muchas
enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras habitualmente en
bioqumica se estudian las reacciones catalizadas por enzimas.
EXPERIMENTOS EN LA FASE DE EQUILIBRIO

EXPERIMENTOS
LA
FASE
DE
EN
EQUILIBRIO

En estos experimentos se perturba una mezcla de enzimas sustrato y


productos que han alcanzado el equilibrio qumico por ejemplo combinando la
temperatura, la presin o el pH, el anlisis de estos experimentos requiere que
la reaccin sea reversible.

4) CMO SE PUEDEN OBJETIVAR LOS PRODUCTOS DE UNA REACCIN


ENZIMTICA?

Al agregar a los tubos la solucin cprica alcalina y proporcionndole un


ambiente adecuado de temperatura observamos que en el TUBO I.1.1, es
color celeste, mientras que en el TUBO II.2.2 es color anaranjado debido a la
presencia del cobre que va dar por resultado azucares reductores como la
glucosa y la maltosa, con la que queda demostrado la accin de la enzima
degradando al almidn.

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