Continuación de BQ-14 (Aplicaciones de la Biología Molecular) y BQ-15 (Diagnóstico Molecular

)
Dr. G.Castaño

MAPEO DE GENES. CLONAJE POSICIONAL.
(En la presentación PDF del Dr. G. Castaño hay muchos ejemplo, que es imposible transcribir; cdo hago
referencia a una diapositiva, pongo dos números separados por una coma; el 1º es la página (cada pág tiene
6 diapos) y el 2º es el número de la diapo)

a) ESTRATEGIAS GENERALES DE MAPEO

Mapeo genético: Es el ordenamiento de genes en cromosomas de acuerdo a la
frecuencia de recombinación (identifica las posiciones relativas de los genes en
los cromosomas mediante el análisis de ligamientos, midiendo las frecuencias
de recombinación). Puede ser necesario antes de encontrar sondas útiles para
mapeo físico.
Mapeo físico: Es la determinación de la distancia física entre genes (en pares de
bases de DNA) utilizando técnicas citogenéticas y moleculares (análisis directo
de las moléculas de DNA que constituyen cada cromosoma, identificando las
localizaciones físicas de los genes en un cromosoma). Se emplea en último lugar
para aislar el gen de interés.

b) ANÁLISIS DE LIGAMIENTO POR RFLPS
RFLPs ligados a genes enfermos
Cuanto más cercanos se encuentren dos marcadores genéticos en un cromosoma, tanto
mayor es la probabilidad de no ser separados por entrecruzamientos entre ellos y por lo
tanto ser coheredados por la progenie (ligados). Mediante el estudio de la coheredabilidad
en grandes grupos familiares de un gen de interés (p. ej. algún gen relacionado con una
det Enf) y un gran nº de RFLPs individuales, se pueden identificar ciertos RFLP que se
cohereden frecuentemente con dicho gen (la demostración de que el ligamiento es
estadísticamente significativo requiere el estudio de gran nº de individuos). S/e es de
destacar que el ligamiento no será absoluto excepto si el marcador RFLP se localiza en el
mismo gen (RFLP intragénico). En los demás casos el RFLP y el gen aberrante que
determina la Enf se separarán con una cierta frecuencia debido al entrecruzamiento
meiótico (recombinación) durante la formación de los gametos. Recordad que la
frecuencia de recombinación va a depender de la distancia entre el RFLP y el gen
enfermo a < distancia, más fiabilidad.

Los RFLPs proporcionan marcadores para todos los cromosomas humanos Ello permite
mapear genes causantes de enfermedades buscando ligamiento entre un RFLP determinado
1

lo que se correlaciona con la enfermedad es la ausencia de la banda inferior. por tanto. La frecuencia de recombinación y. Esta técnica permite determinar la posición en el mapa y aislar los genes de enfermedades genéticas para las que no se han identificado aún los genes causales. se INUTILIZA el patrón de RFLP ligado al gen enfermo en esa familia. Otro ejemplo: Diapo 7. esto se debe a que ha habido una recombinación. 5: análisis del ligamiento en la NF-1: en la familia de la derecha. Esto es cierto cuando la frecuencia de recombinación es baja. Saber (una vez más) que existe la posibilidad de recombinación entre el marcador polimórfico y el gen enfermo. Además establecer el ligamiento entre un RFLP y un fenotipo enfermo permitirá: 1. 3-4) - - - Conocer qué RFLP está ligado al gen enfermo en ESA familia (recordad la gran variabilidad genética debida a la recombinación). puesto que existe la posibilidad de recombinación entre el marcador polimórfico y el gen enfermo (posibilidad que será menor cuanta menor sea la distancia).y el fenotipo enfermo (Diapo 7. c) AISLAMIENTO DEL GEN RESPONASABLE Para el aislamiento de un gen existen tres opciones: 1. Partir de una proteína candidata DNA proteína 2. este ejemplo demuestra que es necesario determinar qué alelo cosegrega con el fenotipo enfermo en una determinada familia. Partir de un mRNA candidato DNA mRNA 2 . existe un sujeto de esta familia (*) que está enfermo sin cumplir con este criterio. Testar al probando (prenatal o asintomático): importante tener en cuenta que la predicción sólo sirve para la familia concreta en estudio. un hermano afecto “aa”) puede predecirse que padecerá la enfermedad. existe la posibilidad de que en una familia sea el alelo “a” el que se coherede con el gen enfermo o el “A”. Debemos tener en cuenta que la fiabilidad de este procedimiento depende del ligamiento (distancia) entre el RFLP y el gen enfermo. Si el probando tiene el mismo genotipo que otro familiar enfermo (en este ejemplo. Esto demuestra que cuando aparece una recombinación en una familia. la fiabilidad del marcador depende de la distancia entre el RFLP y el gen enfermo. porque al poder existir recombinación.1. aislamiento del gen responsable por clonaje posicional Valor predictivo de los RFLPs ligados (Diapos 7. predicción de aquellos individuos con riesgo de enfermar 2. como ocurre en la familia del ejemplo ). S/e.

más cercanas al “gen enfermo”) hasta que encontramos el gen buscado. la mutación candidata deberá aparecer sólo en los afectados. Evidentemente. Pero. entre las que se incluirían: grandes delecciones. Cuando la posibilidad de recombinación es mínima (menos de 1 cM) consideramos que el gen está muy próximo y usamos ese RFLP como punto de partida para el paseo cromosómico. La mutación detectada debe ser capaz de impedir la expresión génica con la consiguiente pérdida de la función de la proteína. Para ello. debemos asegurarnos de que es el gen responsable de la enfermedad.3. Debemos diferenciar polimorfismos benignos y verdaderas mutaciones. Clonaje posicional (diapos 8. La mutación detectada debe impedir la función del gen. Este proceso se inicia a partir del clon de DNA aislado mediante la sonda RFLP ligada. Para ello. el paseo cromosómico se acelera empleando genotecas clonadas en cósmidos o YAC que contienen grandes insertos de DNA. aquél que determina la enfermedad que estamos estudiando? Cuando la frecuencia de recombinación del último RFLP que hemos aislado es 0 en todos los miembros afectos de la familia que estamos estudiando (porque frecuencia de rec 0 = se transmite siempre con la enfermadad). Hoy en día. se emplea la técnica denominada PASEO CROMOSÓMICO (chromosome walking). se utiliza el extremo más alejado del anterior para preparar una segunda sonda DNA que se usará para localizar un nuevo clon genómico mediante hibridación. Clonaje posicional directo (partir directamente del DNA) DNA Aislamiento del gen responsable con sondas RFLPs ligadas. Esta técnica se basa el solapamiento de clones de DNA. 1-2) El primer paso del clonaje posicional (o aislamiento de genes con sondas RFLP ligadas) es el mapeo genético. Tras aislar este clon. ¿cómo saber cuándo hemos llegado al gen de interés. se deben cumplir los siguientes criterios: 1. para la identificación del marcador RFLP que cohereda con el fenotipo mutante. Repetimos el proceso varias veces (empleando sondas cada vez más alejadas del RFLP inicial y. Demostrar la presencia de una mutación. mutaciones en la pauta 3 . sin embargo. en un número suficiente para demostrar una relación estadísticamente significativa (debe observarse la misma mutación en muchos enfermos). 2. Criterios para la identificación positiva de un gen enfermo Una vez localizado el gen. del que se sabe que está muy próximo al gen de interés. A continuación se aísla un clon genómico (fragmento de cDNA) empleando como sonda un fragmento de DNA que hibride con el RFLP (mapeo genético). debemos comparar el gen entre individuos normales y afectados. Posteriormente.

6)  Mapeo de delecciones: varias delecciones dan lugar al mismo fenotipo. demostrar que difererentes mutaciones dan lugar a diferente gravedad en los síntomas de la enfermedad. es porque se encuentra un gen en esa región (y se rompe su función). Reproducir la enfermedad en animales. Es decir. dónde se encuentra la zona del locus responsable (la común)  Análisis de los puntos de ruptura y traslocaciones: si los puntos de ruptura dan lugar a una enfermedad. de lectura.o Western Blot –proteína).  Hibridación in situ contra cromosomas (FISH) (Diapo 9. Normalmente se emplea el ratón. 6. demostrar que células aisladas de los pacientes recuperan la función al transferir el gen normal. Debemos demostrar que la interrupción de la función del gen homólogo en el ratón reproduce la enfermedad. La función anómala del gen candidato debe explicar la patogénesis. 7.  Localización cromosómica de genes 4 . realizar terapia génica (la introducción del gen normal en el paciente cura la enfermedad). 1-2): sonda de DNA marcada se hibrida con cromosomas metafísicos. Para ello. 5. Esto se realiza a través de:  Análisis citogenético (Diapo 8. Esto es realmente complejo si el gen se expresa en varios tejidos. Éste es el último criterio de que el gen responsable ha sido identificado. mutaciones en los sitios de splicing. d) OTRAS UTILIDADES DEL CLONAJE POSICIONAL. MAPA FÍSICO DE UN GEN ¿Qué otras cosas se pueden hacer con un gen aislado por clonaje posicional? 1.3. 4. Mapear el gen en su región cormosómica y determinar si el gen se correlaciona con un sitio donde se conozca que existe una anormalidad citogenética.. Es decir. También debemos demostrar que el gen se expresa en los tejidos afectados por la enfermedad (nos valemos para ello de Northern Blot –mRNA. Debemos demostrar la correlación genotipo-fenotipo. Demostrar la complementación génica. Es decir. mutaciones sin sentido..  Determinación de delecciones o duplicaciones: la sonda no se une o se une dos veces. Se trata de discriminar en la zona afecta por las distintas delecciones. aparición de codones de parada. la función del gen debe ser consistente con la patología (por ejemplo. Demostrar que la corrección del defecto génico cura la enfermedad. defecto de distrofina en DMD o CFTR en FQ).

Nos valemos de las siguientes técnicas:  Digestión con enzimas de restricción y análisis con Southern Blott  Secuenciación directa  Análisis con oligonucleótidos específicos de alelo (Técnica ASO). La PCR permite amplificar el DNA de una región seleccionada del genoma. y determinan los extremos del fragmento final de DNA que se obtiene. Si con el PCR se duplica más de una secuencia de DNA.  Análisis por PCR (Diapo 9. el fragmento es cada vez más pequeño hasta que sólo se amplifica el fragmento de interés. Por ejemplo. catalizada por una DNA polimerasa (Taq polimerasa. 4-). En este ejemplo. Después de varios ciclos. y que corresponden a sitios opuestos de la región a amplificar. El DNA resultante se analiza por electroforesis en gel. valorando la hibridación mediante un gel de agarosa. cada uno de los cuales es complementario de cada una de las cadenas de la doble hélice de DNA. el individuo 2 no se amplifica ningún exón porque tiene una delección total del gen. 3). En primer lugar se utilizan porciones de la secuencia que rodean la región que va a ser amplificada. en el que se producen delecciones variables de los 9 exones del gen de la Hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT)]. diagnóstico de la Fibrosis Quística por detección de la mutación F508 (Diapo9. 5 . Se utilizan como sondas oligonucleótidos sintéticos. Se diseñan 9 pares de cebadores. que reconocen específicamente los alelos normal y mutante. se denomina MULTIPLEX PCR [técnica empleada para el diagnóstico del Síndrome de Lesch-Nyhan. siempre y cuando previamente se conozca al menos una parte de su secuencia de nucleótidos. Diseñar estrategias diagnósticas de mutaciones. Estos oligont se utilizan como cebadores o primers para la síntesis del DNA. Para ello estudiamos las distintas anormalidades del gen en diferentes casos de la misma enfermedad. para diseñar dos oligonts sintéticos de DNA. Comentarios para el estudio del tema Lo más importante es el clonaje posicional y los criterios de identificación positiva de un gen enfermo. de forma que en el sujeto normal deben ser amplificados 9 fragmentos. Hibridamos el DNA digerido del individuo “problema” con ambos oligonucleótidos marcados.2. de Thermus aquaticus).

la dieta y la exposición a toxinas ambientales pueden afectar el fenotipo enfermo. c.Tiene un ligando desconocido. en una región transcrita de más de 32. Factores ambientales: Factores como el estilo de vida. sin embargo. a. por tanto es un receptor “huérfano”.  El gen del factor IX está localizado en el cromosoma X. tendrán ciertamente un montón de genes distintos (a no ser que sean gemelos univitelinos) y la expresión de estos genes de fondo puede influenciar el fenotipo enfermo manifestado.Une andrógenos y éstos aumentan en la pubertad. . - Receptor de andrógenos (AR): . 2.Son dedos de zinc de la superfamilia nuclear de factores de transcripción.700 pares de bases.  Mutaciones reguladoras: 6 . . Mutaciones en las secuencias reguladoras: Mutaciones en el promotor del factor IX. con 8 exones.  El promotor del gen del factor IX tiene dos sitios reguladores de unión de factores de transcripción (FT): receptor de andrógenos (AR) y HNF4.BASES MOLECULARES DE LAS ENFERMEDADES GENÉTICAS.Son dedos de zinc de la superfamilia nuclear de factores de transcripción. Naturaleza de la mutación: Diferentes mutaciones en el mismo gen (diferentes alelos enfermos) pueden dar fenotipos más o menos severos dependiendo de los efectos que tengan las mutaciones en la expresión del gen o en la función de la proteína. - HNF4 (Factor nuclear de hepatocitos4): . b. 1. Fondo genético (Background): Dos individuos de una misma familia aún teniendo el mismo alelo enfermo. DETERMINANTES DE LA EXPRESIÓN FENOTÍPICA a. TIPOS DE MUTACIONES QUE AFECTAN A LOS GENES. .Se expresa en el desarrollo temprano y en el hígado adulto.

S/e esta hemofilia mejora en la pubertad cuando aumentan los niveles de andrógenos que estimulan la actividad del FT AR. lo cual impide la expresión del gen.-36 -27 AR -22 -15 HNF4 - Una mutación a -20 resulta en la hemofilia B Leyden. Las diferentes hemoglobinopatías son: HbS 7 . - Una mutación a -26 resulta en la hemofilia B Brandenburg.  Expresión de las Hbs durante el desarrollo: - Hemoglobinas embrionarias: desaparecen al final del primer trimestre de la gestación. Mutaciones que afectan a la secuencia de proteína: Mutaciones en la βglobina. Esta mutación impide la unión del FT HNF4. más rara vez de deleciones o inserciones. ζ2ε2: Gower I α2ε2: Gower II ζ2γ2: Portland - Hemoglobinas fetales: α2 γ2 (HbF) - Hemoglobinas adulto: α2δ2 (HbA2): Inferior al 3% α2β2 (HbA)  Trastornos genéticos de las hemoglobinas:  Mutaciones que afectan a la estructura (hemoglobinopatías): se producen por un cambio en un aa en una de las cadenas de globina (en la β más frecuente que en la α). en la que los niveles de factor IX permanecen bajos incluso en la pubertad al afectar la mutación la zona de unión de ambos FT. b. el cual se une a su sitio de unión intacto y compensa el déficit. Se trata de mutaciones puntuales.

heredados dos del padre y dos de la madre debido a una recombinación por sobrecruzamiento desigual. En la alfa-talasemia. La clínica de las talasemias no sólo resulta de la disminución de la HbA. también por alteración en la forma del hematíe (dianocitosis). 8 . Mutaciones en gran escala: 1. de beta-talasemia. HbC y HbE (más frecuente en el sudeste asiático.GAG (glutámico)  AAG (lisina) . aumenta la síntesis de cadenas β.(anemia falciforme).  Alfa-talasemia: Los dos genes de la α-globina se originaron por duplicación génica y son casi idénticos. La herencia del cromosoma con la deleción de este gen α da lugar a la alfa-talasemia. y. Si se trata de la cadena α. . al ser más rígidos aumenta la viscosidad sanguínea y provoca obstrucción en la circulación capilar (crisis vasooclusivas) . que da lugar a la pérdida de uno de ellos..GAG (glutámico)  GTG (valina) .) .Delecciones en el locus de las globinas. Talasemias Suponen la falta de síntesis total o parcial de una cadena globina. . pero sin las crisis vasooclusivas de la HbS.Anemia hemolítica poco severa. Si son δ y β. Si es β la cadena afectada.Afecta al codón 6 de la βglobina.Anemia falciforme: (más frecuente en raza negra) .Afecta al codón 6 de la βglobina. hablamos de α-talasemia.  Talasemias: disminución de la producción de cadenas α o β  Persistencia hereditaria de Hb fetal (HPFH) c. con lo que se forman tetrámeros β (enfermedad de la HbH o HbΒ-4). sino que interviene además el desequilibrio en la producción de cadenas de globina.Hemoglobina C: (más frecuente en raza negra) . La alfa-talasemia es el resultado de la delección de alguno de los 4 genes de la cadena alfa (αα/αα). δ-βtalasemia.Los hematíes adoptan forma de hoz. Hay diferentes formas de alfa-talasemia con diferente gravedad dependiendo del nº de genes deleccionados.

Delección de un solo gen alfa. Alfa1-talasemia (anemia leve) (α . Reducción muy discreta de la Hb./ α -) Enfermedad Hb H (anemia de leve a severa) (α .-) Delección de tres genes alfa./ . Los niveles de HbA2 y HbF son normales. Hydrops fetalis (.-) 9 .-) Consecuencia de la delección de dos genes alfa./ . Alfa1-talasemia (anemia leve) (α α / . Pacientes asintomáticos. Estos enfermos tienen entre un 5-40% de Hb H (beta 4) y en fetos se observa Hb Bart (exceso de cadenas γ formando tetrámeros).Normal (α α / α α) Alfa2-talasemia (portador silente) (α α / α -) Totalmente asintomático..

por qué la PHHF presenta niveles más altos de expresión del gen de la cadena gamma? 2. Una recombinación por sobrecruzamiento desigual da lugar a la fusión de los genes β y δ por la alta homología que existe entre ambos (los genes son 90% homólogos). 10 . son el resultado de delecciones de genes. La expresión clínica es similar a una beta-talasemia severa por disminución de la síntesis de la proteína de fusión δβ por la debilidad del promotor de la δ-globina. - Existen dos incógnitas en estas dos patologías: 1. Algunas. la mayoría de las beta-talasemias son el resultado de mutaciones puntuales que causan la transcripción o procesamiento defectuoso del RNAm de la cadena beta. La única Hb que poseen es la Hb Bart (γ4) (no sintetizan HbA ni HbF).¿Por qué ambos grupos tienen expresión postnatal del gen de la cadena gamma?  Beta talasemias (en clase no habló de ellas pero las pongo porque son las más frecuentes).  Hemoglobina Lepore (beta-talasemia): Es consecuencia de un sobrecruzamiento desigual entre los genes beta y delta. resultando su síntesis total o parcialmente suprimida. Se produce una compensación por síntesis de cadenas γ. con el resultado de un gen híbrido (gen Lepore) que codifica una globina mixta β-δ. poco frecuentes. pero cuya síntesis está disminuida. Como resultado.La delección de los 4 genes alfa da lugar a la muerte intraútero (hidrops fetalis) por hipoxia. A diferencia de las alfa-talasemias.  Grandes delecciones con fenotipo escaso o nulo: o δβ-talasemia: Se produce la deleción de los genes de las cadenas δ y β. Están por tanto afectadas las cadenas β y δ.Este trastorno es más benigno que el anterior ya que se produce más cantidad de HbF.¿Si sus delecciones se solapan. o Persistencia hereditaria de Hb fetal (PHHF): En esta patología las delecciones se solapan con las de la patología anterior. la síntesis de hemoglobina F (α2γ2) continúa postnatalmente con un nivel elevado compensando la ausencia de Hb A (α2β2). y para compensar existe un 100% de HbF(se mantiene intacta la secreción de cadenas gamma).

muscular de Duchenne está causada por una duplicación o por una mutación puntual. Mutaciones por expansión de trinucleótidos: Trastornos neuropsiquiátricos Son los siguientes: - Distrofia miotónica (Distrofia miotónica de Steinert) - Sdr del cromosoma X frágil - Atrofia muscular espinobulbar (Enfermedad de Kennedy) - Enfermedad de Huntington Para entender estas enfermedades es necesario definir los microsatélites: - son regiones cortas y repetidas en el genoma. Se trata de una mutación intrónica consistente en una expansión inestable del trinucleótido CTG n veces en la región 3´del gen de la proteína kinasa miotónica en la cadena de ADN.3. Puesto que su contenido en G+C es usualmente mayor que la media del genoma aparecen como una banda de diferente densidad por lo que se denominan satélites. siendo por tanto uno de los mayores genes humanos. el triplete GAG incluye. La longitud de los alelos es proporcional al número de repeticiones. CTG. 5’ CAGCAGCAGCAGCAG 3’ 3’ GTCGTCGTCGTCGTC 5’ · El número de repeticiones y por tanto su longitud es altamente polimórfica dando lugar a VNTRs (variable number of tandem repeats). El gen de la distrofina se localiza en el brazo corto del cromos X y tiene un tamaño de aprox 2000 kb. CAA. la D. CAG. - Están frecuentemente trinucleótidos. CGG. pero no lo desarrolla). CAG. El 65% de los casos de Distrofia muscular de Duchenne se deben a delecciones (pérdida de uno o más exones). constituidos por repeticiones de Una forma de microsatélites: las repeticiones de Trinucleotidos: · Las más comunes en el genoma humano son.2. resultando la 11 .Delecciones de la distrofina (sólo se hace mención a este apartado como otra mutación en gran escala. TGC y GCT. AGC. Para el que quiera: La distrofina es una proteína localizada en la superficie interna del sarcolema de la fibra muscular..  Distrofia miotónica: 9q13. Los niños que padecen esta enfermedad carecen de distrofina. · Puesto que el DNA es de doble cadena. d. Con menor frecuencia. GAG. GCA. TAA.

frente amplia y macroorquidia. Clínica: retraso mental. Clínica: debilidad muscular y atrofia. Clínica: trastornos progresivos del movimiento. El número n de repeticiones de CGG determina el estatus del individuo: normal (13-28). No se comenta en clase. premutación (55-200) y afectados (>200). Es la repetición del triplete CAG n veces. retraso mental… La anticipación genética (aumenta la gravedad del fenotipo y la precocidad de las manifestaciones clínicas en generaciones sucesivas) se acompaña de un aumento del nº de repeticiones del trinucleótido. Varias enfermedades genéticas presentan imprinting y. resultando éste afectado (se produce inhibición de la transcripción del gen por hipermetilación e inhibición de la traducción). calvicie frontal. muestran una expresividad variable según que el gen defectivo sea heredado del padre o de la madre. Lo he añadido porque me lo sugirió Jacobo (¿Por qué?). disminución del tamaño cefálico. Las contribuciones genéticas de madre y padre son. Es la expansión de la repetición del trinucleótido CAG que codifica una proteína que se denomina “huntingtina” (esta proteína está en todas las neuronas del cerebro y su función es desconocida). El número n de repeticiones de CGG determina el estatus del individuo: normal (6-55). 12 . Es la repetición del triplete CGG n veces en la región 5´ del gen FMR-1 en la cadena de ADN. complementarias. lo que se traduce en una pérdida parcial de algunas de sus funciones fisiológicas y activación de otras. Imprinting genético (impronta) se define como las modificaciones en la línea germinal que producen diferencias en la expresión del material genético dependiendo de su procedencia. e) Imprinting genético (no lo nombró en clase. miotonía. premutación (30-75) y afectados (>75). por tanto.expresión de este gen afectada.  Síndrome de X frágil: Xq27. S/e existen regiones del genoma humano donde sólo el alelo materno o paterno se llegan a expresar.  Enfermedad de Huntington.Gen IT15. premutación (28-39) y afectados (39-60). debilidad muscular. La clínica de este trastorno es multisistémica: cataratas. Se produce una expansión del componente poliglutámico de la proteína.3. ni tampoco viene en su presentación PDF. 4q. El número n de repeticiones de CTG determina el estatus del individuo: normal (5-30). materna o paterna. Este triplete se encuentra en la secuencia que codifica para el receptor de andrógeno.  Atrofia muscular espinobulbar (enfermedad de Kennedy): Xq12. en la mayoría de los casos.

implicados cada uno en la etiología del Sdr de Prader-Willi y del Sdr de Angelman. y que tienen un mecanismo de imprinting opuesto : . la falta de la copia paterna (por una delección p ej) causa la Enf.Existen dos genes en la misma región 15q11-13. - El gen responsable del Sdr de Angelman es inactivo en el cromosoma paterno (imprinting paterno) y la falta de expresión de la copia materna manifiesta el fenotipo de la enfermedad. 13 . en el cromosoma materno. por tanto. se inactiva fisiológicamente. respectivamente.El gen causante del Sdr de Prader-Willi sufre imprinting y.