FROTIS BACTERIANO,

COLORACION DE
GRAM Y USO DEL
MICROSCOPIO
Acero Sofa, Acero Jazmn, lvarez Melisa y Zuluaga
Johana
Fundacin universitaria San Gil Unisangil, Facultad de
Ciencias Naturales e Ingeniera
Ingeniera Ambiental
Yopal, Colombia
jaceror@unisangil.edu.co
melisaalvrez@unisangil.edu.co
adrianaacero@unisangil.edu.co
zuluagayohanna@gmail.com

Resumen el desarrollo de la prctica de laboratorio es

con el fin de realizar un frotis bacteriano a partir de
medios de cultivo y empleando la tincin de gram. Se
denomina frotis, a la extensin que se realiza sobre un
portaobjetos de un cultivo bacteriano, con el objetivo de
separar por extensin los microorganismos presentes.
Esta etapa es importante para lograr los resultados
esperados en cada una de las tinciones (simples o
compuestas). En la prctica se utilizaron los materiales
tales como los portaobjetos, el mechero, colorantes de
tincin, medio de cultivo con colonias bacterianas y el
microscopio. Se observ la presencia de bacterias gram
positivas en su diferente forma y tamao, finalmente se
culmin la prctica exitosamente.
Palabras claves
estafilococos, gram
microscopio, tincin.

frotis, bacteria, diplococos,

negativas, gram positivas,

Abstract development lab is in order to make a

bacterial smear from culture media and using gram stain.
Is called a smear, the extension is performed on a slide of
a bacterial culture, in order to separate by extension
microorganisms. This stage is important to achieve the
expected results in each of the stains (simple or
compound). In practice materials such as slides, lighter,
dye staining, the culture medium with bacterial colonies
and used microscope. the presence of gram positive
bacteria in their different shape and size was observed,
finally completed successfully practice.

Key words smears, bacteria, diplococci, staphylococci,

gram-negative, gram-positive, microscope, staining.

I.

INTRODUCCION

Para desarrollar un buen estudio microbiolgico se

realizaron las tcnicas de preparacin de un frotis,
fijacin y coloracin en las diferentes sustancias
permitiendo observar ms detenidamente los diferentes
microorganismos y sus diferentes estructuras adems
aprender de las diferentes tinciones y su importancia en
la observacin de estos microorganismos. Un frotis se
prepara distribuyendo una pequea suspensin de los
microorganismos sobre una superficie transparente que,
posteriormente, se fija a la superficie con calor o
solventes orgnicos lo que causar la inactivacin o
muerte celular y algunas modificaciones de sus
caractersticas.. Los colorantes biolgicos tienen varias
aplicaciones en microbiologa, se usan para clasificar las
bacterias en Gram positivas y Gram negativas, tambin
para observar las diferentes estructuras microbianas
como pared, capsula, espora, flagelo, ncleo y grnulos,
tienen utilidad para la observacin de levaduras y
estructuras, en medios de cultivo se emplean como
indicadores o inhibidores selectivos.
La morfologa bacteriana se puede observar claramente
por medio de coloracin de las clulas. En las tcnicas de
coloracin, las bacterias estn muertas por el hecho de
fijar con calor la muestra a la lmina y por el mismo
proceso de coloracin. Al aplicar un colorante a la
preparacin microbiana, las bacterias se tien
hacindolas resaltar con claridad, debido a la
composicin qumica tan diferente con respecto al medio
que las rodea, adems permite estudiar las caractersticas
morfolgicas y emplear mayores amplificaciones
microscpicas.

II.

OBJETIVOS

Realizar un frotis bacteriano a partir de medio de

cultivo slido y liquido
Colorear el frotis bacteriano empleando la Tincin
compuesta de Gram
Desarrollar en el estudiante la habilidad de manejo
correcto del microscopio.

III.

C. OBSERVACION AL MICROSCOPIO

MATERIALES Y EQUIPOS

Tabla 1: materiales y equipos

CANTIDAD
2
1
1
1
1
1
1
1
1

IV.

DESCRIPCION
Portaobjetos
Asa curva
Mechero
Set de colorantes de tincin de
Gram
Medio de cultivo con crecimiento
de colonias bacterianas
Toallas desechables
Marcador
Alcohol antisptico 70%
Microscopio compuesto

Observe al microscopio con objetivo de inmersin el

portaobjetos teido siguiendo las indicaciones dadas en
el presente manual.
V.

RESULTADOS

A. PREPARACION DEL FROTIS BACTERIANO

Imagen 1: realizacin del frotis bacteriano.

METODOLOGIA

A. PREPARACION DEL FROTIS BACTERIANO

1. Limpie un portaobjetos con alcohol, papel de filtro y

flamearlo.
2. Coloque una gota de agua en el centro del
portaobjetos y con el asa de siembra, esterilizada a la
llama del mechero, tome una pequea cantidad de
colonia bacteriana, colquela sobre la gota de agua
forme una emulsin y esprzala sobre el portaobjetos
generando un extendido muy delgado.
3. Fije la muestra con calor pasndola rpidamente el
portaobjetos por la llama del mechero dos veces.
4. Deje secar la preparacin a temperatura ambiente.
B. COLORACION
GRAM

DEL FROTIS-

TINCION

DE

1. Coloque el portaobjetos en el lugar dispuesto para

realizar la coloracin que le indique el auxiliar de
laboratorio.
2. aplique el colorante Cristal violeta sobre el frotis y
deje actuar por 1 minutos (controle el tiempo).
3. lave con agua de la llave y escurra el exceso
4. Cubra el frotis ahora con lugol y deje actuar por 1
minutos
5. Lave con agua de la llave y escurra el exceso
6. Cubra con solucin decolorante (alcohol-acetona)
por 30 segundos
7. Lave con agua de la llave y escurra el exceso
8. Cubra ahora con colorante de contraste (safranina o
Fuschina) deje actuar por 45 segundos
9. Lave con agua de la llave y escurra el exceso
10. Permita que la preparacin teida se seque al aire,
dejando la lmina en posicin inclinada

Imagen 2: fijando la muestra del frotis bacterianos con el

calor

B. COLORACION DEL FROTIS TINCION DE

GRAM

Imagen 3: colorante cristal violeta sobre el frotis

C. OBSERVACION AL MICROSCOPIO
OBJETI
VO
4X

IMAGEN

Microscopia ptica en objetivo 4X. Se observa la

colonia.
10X

Imagen 4: colorante lugol sobre el frotis

Microscopia ptica en objetivo 10X. Se observa

diferentes tipos de cocos.
40X

Microscopia ptica en objetivo 40X. Se observan

los diplococos y los estafilococos.
100X

VII.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

1. Cul es la utilidad del aceite de inmersin en la

observacin con lente 100X.
El aceite de inmersin se utiliza para aumentar la
resolucin de un microscopio mediante la inmersin de la
lente objetivo y el espcimen en un aceite transparente de
alto ndice de refraccin.
2. Que otros tipos de microscopios existen y cules son
las diferencias, establezca un cuadro comparativo.
TIPOS DE MICROSCOPIOS

MICROSCOPIO
COMPUESTO
Staphylococcus ssp en tincin de Gram.
Microscopia ptica en objetivo 100X. bacterias de
color violeta (Gram Positivas)

VI.

ANALISIS DE RESULTADOS

Se puede apreciar Staphylococcus ssp Gram positivos

que se encuentran en racimos, pares y e cadenas cortas
con forma redonda (coco). Esta bacteria se observa de
color violeta ya que en el proceso de tincin donde se le
agrego los diferentes colorantes como cristal violeta y
fucsina bsica, quedaron teidas; aun cuando se les retir
el exceso de colorante con agua destilada, tomando este
color caracterstico que se le denomina a las bacterias
que lo presentan Gram positivas. Estas bacterias
presentan este color ya que la envoltura celular de las
bacterias Gram- positivas cubren la membrana
citoplasmtica y una pared celular compuesta por una
gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La
pared celular se une a la membrana citoplasmtica
mediante molculas de cido lipoteicoico.
La capa de peptidoglicano le proporciona una gran
resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener
el tinte durante la tincin de Gram al poseer una gran
proporcin de este polmero complejo (murena) la cual
no la hace susceptibles a la accin del solvente orgnico,
sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos,
lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
A diferencia de las Gram-negativas, estas bacterias no
presentan una segunda membrana lipdica externa.

MICROSCOPIO
OPTICO

MICROSCOPIO
DIGITAL

MICROSCOPIO
FLUORESCENTE

Es un aparato ptico hecho para agrandar

objetos, consiste en un nmero de lentes
formando la imagen por lentes o una
combinacin de lentes posicionados cerca
del objeto, proyectndolo hacia los lentes
oculares u el ocular. El microscopio
compuesto es el tipo de microscopio ms
utilizado.
Tambin llamado "microscopio liviano", es
un tipo de microscopio compuesto que
utiliza una combinacin de lentes
agrandando las imgenes de pequeos
objetos. Los microscopios pticos son
antiguos y simples de utilizar y fabricar.
Tiene una cmara CCD adjunta y est
conectada a un LCD, o a una pantalla de
computadora. Un microscopio digital
usualmente no tiene ocular para ver los
objetos directamente. El tipo triocular de los
microscopios digitales tienen la posibilidad
de montar una cmara, que ser un
microscopio USB.
"microscopio epi-fluorescente" es un tipo
especial de microscopio liviano, que en vez
de tener un reflejo liviano y una absorcin
utiliza fluorescencia y fosforescencia para
ver las pruebas y sus propiedades.

3. Que tinciones se usan para la observacin de cada

una de las siguientes estructuras microbianas:
capsula, flagelos, esporas y grnulos. En que consiste
la coloracin y como se observan al microscopio.
TINCION DE CAPSULA
A. METODO DE DUGUID

1. Poner con el asa una gota pequea de tinta china en

el centro de un portaobjetos limpio.
2. Poner una gota de agua del mismo tamao junto a
la gota de tinta china
3. Tomar con el Asa bacteriolgica un pequeo
fragmento del cultivo de bacterias
4. Hacer una suspensin ( sin extenderla) en la gota de
agua
5. Mezclarla con la tinta china

6. Colocar un cubreobjetos sobre la suspensin,

evitando que queden burbujas
7. Observar la preparacin al microscopio con el
objetivo seco fuerte y de inmersin.
La cpsula se observa como una zona brillante alrededor
de la bacteria en un campo oscuro.
B. METODO DEL ROJO CONGO

1. Poner una gota pequea de rojo Congo en el centro

de un portaobjetos limpio
2. Tomar con el asa bacteriolgica un pequeo
fragmento de crecimiento de colonia bacteriana
3. Suspender la muestra en la gota de rojo Congo y
hacer un frotis
4. cubrir el frotis (SIN FIJARLO A LA FLAMA DEL
MECHERO) con una gotas del mordente de
cpsula y dejarlo actuar durante un minuto.
5. Lavar el frotis con agua destilada y dejarlo secar al
aire
6. Observar la preparacin al microscopio con el
objetivo de inmersin
La cpsula se observa como una zona brillante alrededor
de la bacteria de color rojo en un campo de azul oscuro.
TINCION DE FLAGELOS

Los flagelos se tien con mucha dificultad debido a que

se suelen retraerse con facilidad si la tincin no es
adecuada, de ah que se requiere de tcnicas especiales y
especificas basadas en la afinidad que los flagelos
presentan frente a ciertas anilinas.
Tcnica:
-

Realizar el frotis de cultivo joven y fijar.

Cubrir la preparacin con mordiente Rhodes
durante unos 4 minutos.
Lavar con agua destilada.
Cubrir con nitrato de plata amoniacal al 5%
calentndolo casi hasta ebullicin si dejar que se
seque la solucin en la muestra durante unos 4
minutos.
Lavar con agua destilada, aplicar un cubre objetos y
examinara a inmersin.

Resultado: Los flagelos se observan por la precipitacin

del nitrato de plata amoniacal sobre ellos lo que les da un
aspecto pardo ms o menos oscuro que contrasta sobre el
resto de la bacteria.
TINCIN DE ESPORAS

Las espora son estructuras bacterianas que se forman en

condiciones adversas por parte de ciertas bacteria como
puedes ser: del genero Bacillus y Clostridium.
Tales esporas son capaces de resistir situaciones muy
desfavorables de ah su denominacin de resistencia. Las
esporas se tien muy difcilmente requiriendo
determinados colorantes muy concentrados.
Tcnica:
Mtodo de Wirtz o verde de malaquita:
-

Cubre el portaobjetos con solucin de verde de

malaquita y calentar hasta la emisin de vapores
por unos 5 minutos impidiendo que el colorante se
seque o se queme.
lavar con abundante agua.
Cubrir la preparacin con safranina o fucsina como
colorantes de contraste durante 2 o 3 minutos
Lavar con abundante agua, secar, rotular, y
observara a inmersin.

Resultados: se observan esporas verdes

TINCION DE GRANULOS

Se da por el cubrimiento del frotis con azul de metileno

de loeffler por cinco minutos, tambin por el cubrimiento
con el colorante de Albert por un minuto y as mismo con
lugol de Albert. Para llegar a observar los grnulos en el
microscopio se utiliza el aceite de inmersin.

VIII.

CONCLUSIONES

En el desarrollo de la prctica, elaborando el frotis

bacteriano y ejecutando cada uno de los puntos, se lleg
a conocer las bacterias por la tincin de Gram. Tanto las
bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram
negativas se presentan morfolgicamente como cocos o
bacilos, sin embargo al ejecutar tincin de Gram en estas
para identificar su grupo taxonmico, las Gram positivas
se tien de color violeta mientras que las Gram negativas
se tien de color rosado.
Mediante la tincin de Gram se identifican bacterias
Gram positivas y Gram negativas gracias al color que
tornan despus de ser teidas; en el caso de las bacterias
Gram positivas se tien de violeta, esto se debe a que
gracias a que contienen una pared gruesa de
peptidoglicano y gran cantidad de cidos teicicos que
permiten fijar y retener rpidamente el colorante inicial el

cual es, el cristal violeta, y adems son resistentes a la

decoloracin.
La tincin de Gram permite conocer la morfologa
celular, el tamao, la forma y su clasificacin taxonmica
(Gram positivos o Gram negativos) de acuerdo al color
que tornan las bacterias despus de la tincin, sin
embargo no permite conocer la especie o gnero de la
bacteria al cual pertenece.
IX.

BIBLIOGRAFIA

https://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Pr
oductos/Accesorios/Aceite-de-inmersion

http://www.tiposdemicroscopio.com/
http://microbiologiaulat2013.blogspot.com.co
/2013/12/tincion-de-la-capsulabacteriana.html
https://estructurayfuncioncelularbacteriana.w
ikispaces.com/Tinciones+de+microorganismo
s