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Rodriguez Aguilar Mirna

Romn Gabino Ana Mayren


Martnez Miranda Josu
Leguizamo Medina Luz Mercedes
Lpez Portales Omar Enrique
6B

Laboratorio Modular de Formas


Farmacuticas Lquidas

PRCTICA 4. CONSTRUCCIN MOLECULAR, PURIFICACIN Y


EVALUACIN DE PLASMI DOS

INTRODUCCIN

Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico, de tipo circular, que se


replican y transmiten independientes del ADN cromosmico. Estn presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas
como las levaduras. Su tamao vara desde 3 a 10 kb. El nmero de plsmidos
puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos
por clula. Los vectores plasmdicos permiten clonar ligandos de DNA exgeno de
hasta 4 kb, ya que un tamao mayor a ste dificulta la clonacin en estos
vectores. El trmino plsmido fue presentado por primera vez por el bilogo
molecular norteamericano, Joshua Lederberg. (Joshua, 1952)
Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al
igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera
de los mismos. Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A
diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas.
En general, no contienen informacin esencial, sino que confieren ventajas al
hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo ms comn
es el de los plsmidos que contienen genes de resistencia a un determinado
antibitico, de manera que el plsmido nicamente supondr una ventaja en
presencia de ese antibitico.
Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de
insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el
cromosoma y se sitan en su interior, con lo cual, automticamente la maquinaria
celular tambin reproduce el plsmido. Cuando ese plsmido se ha insertado se
les da el nombre de episoma. (Joshua, 1952)
Los plsmidos se utilizan como vectores de clonacin en ingeniera gentica por
su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal as
como tambin porque es relativamente fcil manipularlos e insertar nuevas
secuencias genticas.
Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o dos genes
que les confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones
recombinantes. Hay otros mtodos de seleccin adems de la resistencia a

antibiticos, como los basados en fluorescencia o en protenas que destruyen las


clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos mtodos de seleccin de plsmidos
son de uso frecuente en agrobiotecnologa, debido a la fuerte crtica de grupos
ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibiticos en los organismos
modificados genticamente.
Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Estos son
usados para transferir genes desde un organismo a otro y tpicamente contienen
un marcador gentico confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a
favor o en contra. La mayora tambin contienen un polivinculador o sitio de
clonado mltiple (MCS), el cual es una pequea regin que contiene los sitios de
restriccin ms comnmente usados, permitiendo una fcil insercin de
fragmentos de ADN en ese lugar. (Joshua, 1952)

Tipos
Clasificacin por su funcin. Hay 5 clases principales:

Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen trans-genes, son capaces de


conjugarse.
Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir
resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como
Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.
Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la
produccin de) colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.
Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias
inusuales como tolueno o cido saliclico.
Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.

Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales. Los


plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria, debido
a la divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.
Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte Post
segregacional (PSK: Post segregational Killing System). Ellos producen en
conjunto un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta. Las clulas hija que
retienen una copia del plsmido sobreviven, mientras que una clula hija que falla
al integrar el plsmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al
veneno que obtuvo de la clula padre. Este es un ejemplo de plsmidos como el
ADN replicante. (Klein, Prescott, & Harley, 1999)
Aplicaciones

Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de


gentica e ingeniera bioqumica, donde son comnmente usados para multiplicar
(hacer muchas copias de) o como genes particulares expresos. Muchos plsmidos
estn disponibles comercialmente para dichos usos.
El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene genes
que hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso siguiente el
plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso llamado
transformacin. Luego, la bacteria es expuesta a un antibitico particular. Solo la
bacteria que toma copias del plsmido sobrevive al antibitico debido a que el
plsmido lo hace resistente. En particular, los genes protectores son expresados
(usados para hacer protena) y la protena expresada evita la accin del
antibitico. De esta forma, los antibiticos actan como un filtro que seleccionan
nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas bacterias pueden ser cultivadas
en largas cantidades, cosechadas y el plsmido de inters puede ser aislado.
Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de protenas.
En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que encierra al gen de
inters. Solo como la bacteria produce la protena que le confiere si resistencia a
los antibiticos, este tambin puede ser usado para producir protenas en grandes
cantidades desde el gen insertado. Esta es una forma barata y fcil de producir
genes o protenas que este codifica de forma masiva, como por ejemplo insulina, o
inclusive antibiticos. (Klein, Prescott, & Harley, 1999)

OBJETIVOS:
Realizar la purificacin de un plsmido bacteriano utilizando el mtodo de
lisis alcalina y el de columna.

Determinar la cantidad y grado de pureza de plsmido obtenido mediante


espectrofotometra.

Realizar el patrn de digestin especfico de una construccin molecular


utilizando enzimas de restriccin.

Analizar mediante electroforesis en un gel de agarosa el patrn de


digestin, comparando contra un vector no digerido.

METODOLOGA:

Prctica N 4.
Construccin molecular,
purificacin y evaluacin
de plsmidos.
1.- Un da antes del
experimento, colocar en
un tubo de centrifuga de
50 ml, 6 ml de medio LB de
50 g/mL con kanamicina
y una colonia de la cepa
pVAX1/EGFP, esto se
realizar en el laboratorio
N 8

5.-Eliminar
sobrenadante
usando una
micropipeta o
por

6.-Agregar ms
cultivo y repetir
los pasos 3,4 y 5
hasta agotar el
cultivo

7.-Agregar 150 L
de la solucin l
anteriormente
preparada

11-Agregar 150 L
de la solucin lll
previamente
almacenada a 4C,
mezclar por
inversin por 10
segundos e incubar

12.-Centrifugar por 5
min a 13,000 rpm y
recuperar el
sobrenadante que
contiene el DNA y RNA.

3.-Una vez
obtenido el
cultivo, colocar 1
ml de cultivo en 2
microtubos de 2

2.-Incubar el
inoculo a 37C
por 12 hrs
aprox, con
agitacin a 250

8.-Resuspender el
botn celular e
incubar 5 min a
temperatura
ambiente.

10.-Agregar 150 L
de sta solucin, y
mezclar por
inversin 10 veces.
Incubar por 5 min a

13.-Agregar 1 ml de
EtOH absoluto
almacenado a 4C y
mezclar por
inversin 6 veces e
incubar a temp.
Ambiente por 2

4.-Centrifugar
por 1 ml a
12,000 rpm

9.-En el periodo
de incubacin,
preparar la
solucin ll
agregando en un
tubo ependorf lo
siguiente:

400 L de agua
destilada
500 L de SDS al
10%

14.-Centrifugar a
11,000 rpm durante
10 min. Eliminar
sobrenadante con
micropipeta.

e 15.-Lavar el botn por


inversin con EtOH al
70% a 4C durante 1
min.

16.-Centrifugar a
11,000 rpm durante 5
min. Eliminar el
sobrenadan con
micropipeta.

Resuspender el botn
de ADN en 30L de
agua MiliQ y
almacenar a -20C

Repetir pasos
15 y 16.

Decantar el
sobrenadante e invertir
los tubos en papel
secante hasta que se
haya eliminado
totalmente el etanol

Cuantificacin del
ADN plsmidico.

Para realizar la medicin


de la cantidad de ADN
obtenida, se hizo uso del
equipo Nanodrop.

Descongelar las
muestras de ADN
colocndolas en
hielo.

Los valores optimos de


cuantificacin son los
siguientes:
-Para la cantidad de protenas
los valores ptimos son: ~1.82.0
-La cantidad de sales los
valores ptimos son: 0.3-0.6

Posterior a su
cuantificacin,
almacenar el ADN a 20C para su posterior
uso.

Colocar X L de ADN en
el receptculo especial
del medidor del equipo

El equipo arroja
automticamente la
concentracin y
pureza del ADN, as
como la curva de
cuantificacin.

Ensayo de
restriccin.

Descongelar el
plsmido previamente
purificado colocndolo
en hielo.

Se prepararan las
siguientes
reacciones de
restricciones con el
ADN previamente
purificado.

En tubos ependorf
diferentes, se deben
de agregar los
reactivos en el orden
citado con el fin de
evitar someter al
DNA y a las enzimas a
una alta
concentracin de
sales.

Montaje de la reaccin para la enzima


E.CoRI (reaccin por duplicado)

Montaje de la reaccin para la enzima


Xho l:

2 L de buffer de esta enzima


1 L del DNA plsmidico
0.5 L de la enzima Xho l
16.5 L de agua miliQ

2 L de buffer de esta enzima


1 L del DNA plsmidico
0.5 L de la enzima Xho l
16.5 de agua miliQ

Se debe de incubar durante 1 hora a


37C

Se debe de incubar durante 1 hora a


37C

Doble digestin
Uso de las enzimas kpnI y XhoI
-2 L de buffer Tango
-5 L de ADN plsmidico.
1 L de cada enzima
12 L de agua miliQ
Incubar durante 1 hora a 37C

Electroforesis en gel de
agarosa al 0.8% de los
plsmidos digeridos con
las enzimas EcoRI y XhoI

Mientras se lleva acabo el


ensayo de restriccin, armar la
base donde se polimerizar el
gel de agarosa. Colocando el
peine en el molde para formar
los pozos donde ser cargada la
muestra.
Agregar la solucin
de agarosa al molde
cuando la solucin
est a 40C
aproximadamente.

Dejar solidificar a
temperatura ambiente
y retirar el peine con
cuidado de no romper
los pozos.

Realizar los
clculos para
preparar un gel de
agarosa al 0.8%
por duplicado.

Adir 500 L de buffer


TAE 50X y agregar 2 L
de bromuro de etidio al
gel sin solidificar y
mezclar. Usar guantes y
tener sumo cuidado
debido a que bromuro
de etidio es
sumamente
Una vez
solidificado,
colocar el gel en la
cmara de

Pesar la agarosa y
colocar en un
matraz Erlenmeyer
y agregar 24.5ml
agua destilada

Calentar con un
mechero Fisher o
en microondas
hasta disolver la
agarosa

Agregar el buffer
TAE 1X hasta cubrir
el gel.

Gel N 1: equipos 1 y 2:
N de carril
1.- Marcador PM
2.- Colonia 1 EcoRI
3.- Colonia 13 Xho I
4.-Colonia 14 EcoRI
5.-Colonia 2 EcoRI
6.- Colonia 21 XhoI
7.-Colonia 22 Eco RI
8.- Marcador PM

Cargar las
muestras de la
siguiente forma:

Gel N 1: equipos 3 y 4
N de carril
1.- Marcador PM
2.- Colonia 3 EcoRI
3.- Colonia 16 Xho I
4.-Colonia 17 EcoRI
5.-Colonia 4 EcoRI
6.- Colonia 23 XhoI
7.-Colonia 24 Eco RI
8.- Marcador PM

Correr ambos geles a


90 volts a 150 mili
amperes durante 50
min.
aproximadamente

Pasado el tiempo de
corrida, extraer el gel de
la cmara de
electroforesis y
enjuagar con agua
destilada

Exponer el gel en un
transiluminador con el
fin de observar las
bandas obtenidas.

RESULTADOS:

Resiembra de la 2da y 3ra seleccin de colonias de la cepa pVAZ1/EGFP


para realizar la construccin, purificacin y evaluacin de plsmidos
Colonias de la 2da y 3ra seleccin:

Seleccin de colonias por equipo; seleccionamos la colonia 1,


13 y 14

Resiembra de colonias:
Se realiz un cultivo de las colonias
seleccionadas en 5ml de Lb lquido
con 50g/ml de Kanamicina. La
kanamicina es para evitar el
crecimiento
de
algn
microorganismo contaminante o
bacterias no transformadas. Todo
esto fue en medio estril para evitar
contaminacin.
Estas cepas se
utilizaron posteriormente para la
construccin molecular y realizar la
evaluacin del plsmido

Actividad 1: purificacin de plsmido pVAX1/EGFP

RECUPERACIN DEL BOTN CELULAR:

Se recuper el botn de los cultivos celulares ya que estas son las clulas que
contienen el ADN plasmdico de inters y al concentrarlas es ms fcil recuperar este
AND. Se observan los botones con una coloracin negruzca, lo cual indica que pudieran
estas contaminadas nuestras cepas.

AGREGADO DE SOLUCIONES
Solucin I

Se agregaron 150l de solucin 1.


Esto para iniciar lisis celular

Solucin II

Se agregaron 150l de solucin II.


En esta etapa se lleva a cabo la
desnaturalizacin de protenas y lisis
celular. Se puede observar el lquido
turbio

Solucin III

Se agregaron 150l de solucin II. Aqu


se muestra una turbidez blanca debido a
la precipitacin de protena y el ADN
cromosmico. Posterior
a esto se
centrifugo y se recuper el sobrenadante
ya que aqu es donde se encontraba el
ADN plasmdico y el RNA

ADICIN DEL ETANOL ABSOLUTO

Se agreg 1mL de etanol absoluto a 4C y se incubo por dos minutos y se centrifugo,


esto fue para poder precipitar el ADN plasmdico y poder eliminar el ARN

ADICIN DEL ETANOL al 70%

Una vez obtenido el botn, se agreg 1mL de etanol al 70% y se


incubo por 1 minuto, esto con el fin de lavar el ADN plasmdico.

ADICIN DEL AGUA MILIQ

Una vez lavado el botn, este se


resuspendi con 4L de agua MiliQ
estril, esta sirve como vehculo para
poder preservar nuestro ADN plasmdico

Actividad 2: cuantificacin del ADN plasmdico.


n de
equipo

n de
colonia
1
14
13
2
21
22
3
16
17
4
23
24

[ ] g/l
2041.1
2181.3
961.5
1286
465.6
1310.6
1746.9
2117.9
1580.7
2815.3
1779.5
1213.6

abs. 260
nm
40.823
43.626
19.229
25.721
9.313
26.213
34.938
42.358
31.614
66.307
35.589
25.473

abs. 280 nm
19.959
21.219
9.374
13.054
4.782
13.455
17.836
21.114
16.1
27.13
17.101
12.196

260/280
2.05
2.06
2.05
1.97
1.95
1.95
1.96
2.01
1.96
2.08
2.08
2.09

Optimo
(1.8-2)
NO
NO
NO
SI
SI
SI
SI
NO
SI
NO
NO
NO

260/230
2.38
2.37
2.35
2.35
2.28
2.4
2.4
2.28
2.34
2.33
2.36
2.34

Optimo
(0.3-0.6)
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO

Actividad 3: ensayo de restriccin.

GEL 1: EQUIPO 1 Y 2

Se observan los fragmentos del ADN plasmdico cortados con las enzimas de restriccin:
Kpn I para el extremo 5 y Xho 1 y EcoR I para el extremo 3. Se observa el vector
(pVAX1) por debajo de los 3000pb y el fragmento de ADN (EGFP) por debajo de 761pb.

GEL 2: EQUIPO 3 Y 4

Se observa una gran conglomerado, lo cual podra ser RNA, es decir que an hay impurezas en
nuestro ADN plasmdico debido a que no utilizamos la enzima RNAsa para poder llevar a cabo
la digestin de este. En el carril 4 se observa un banda en los por debajo de los 3000pb los cual
nos indica que podra tratarse del vector (pVAX I), tambin esta muestra puede haberse
degradado debido a que se muestra barrida esta muestra

Marcador de peso molecular utilizado

DISCUSIN DE RESULTADOS:

Durante la construccin molecular y purificacin del plsmido pVAXI/EGFP se


llevaron a cabo diferentes etapas, iniciando con la purificacin de lisis alcalina. En
donde se utilizaron 3 soluciones que fueron de vital importancia ya que con estas
se llev a cabo la desnaturalizacin de protenas y lisis celular con las soluciones
1 y 2 y con la solucin 3 se precipitaron las protenas y el ADN cromosmico. Otro
factor importante tambin fue el agregar el etanol absoluto debido a que con este
se precipit el ADN plasmdico y as poder eliminar el ARN. Al final de este
proceso se coloc el ADN plasmdico en agua MiliQ para poder preservarlo.
Durante la cuantificacin de ADN plasmdico se determinaron las concentraciones
de cada una de las colonias seleccionadas. Se realiz la medicin a distintas
longitudes de onda (230nm, 260nm y 280nm) con el nanodrop para poder obtener
la concentracin de ADN y determinar la pureza de este, es decir, qu tan
contaminado estaba con protena y con sales. Esto se determin con parmetros
tericos (abs. de 260/230: 0.3-0.6 para las sales y abs. de 260/280: 1.8-2.0 para
protenas) los cuales nos indica que nuestro ADN contena una concentracin de
sales y de protenas por arriba de los valores ptimos; por lo cual se considera que
se debera de haber realizado una segunda purificacin antes de realizar el
ensayo de restriccin y de la electroforesis.

A pesar de que el DNA no se encontraba en condiciones ptimas para el ensayo


de restriccin, este se llev a cabo, demostrando que en el gel perteneciente al
equipo 1 y 2 se observa claramente una banda por debajo de los 1500pb, esta
banda no concuerda con la banda esperada del fragmento correspondiente a la
parte del vector pVAX1, debido a que se esperaba observar una banda cerca de
las 3000pb, ni tampoco la banda que se encuentra muy por debajo de las 500pb
concuerda con la banda esperada del fragmento EGFP, debido a que se esperaba
que esta estuviera cerca de las 700pb.
Estos resultados, no son del todo confiables, debido a que la muestra contiene
una alta concentracin de sales, protenas y RNA. En el caso del gel de los
equipos 3 y 4 es ms obvia la presencia de estos contaminantes, debido que solo
en el carril se observan dos bandas, las cuales ninguna de las dos concuerda con
las bandas esperadas para los fragmentos pVAX1 y EGFP, mientras que en los
dems carriles se observa una saturacin en la parte inferior del gel,
correspondiente al RNA contaminante, e incluso se considera que la muestra del
carril 4 pueda estar ligeramente degradada debido a que se observa la muestra
ligeramente barrida. La degradacin del DNA es algo que ocurre comnmente,
debido a la presencia de RNAsas y DNAsas en el medio ambiente, por lo cual es
de suma importancia tener cuidado al momento de la manipulacin del DNA, as
como de evitar exponer al DNA a altas temperaturas o en condiciones poco
favorables. Se debe de considerar que siempre que no se est trabajando con el
DNA este debe de permanecer en hielo o almacenado a -22C para evitar su
desnaturalizacin o algn otro problema.
Debido a este mismo problema presentado en las muestras, se decidi no incluir
la prueba de restriccin usando las enzimas KpnI y XhoI, debido a que no
arrojaron datos concluyentes para verificar que se obtuvo el plsmido buscado.
Es de suma importancia realizar anlisis de restriccin para poder observar la
presencia del plsmido, esto se observa mediante el PM de ste. Tambin aqu
se puede observar la pureza que se tiene.
CONCLUSIONES:

Se realiz la construccin molecular y purificacin del plsmido pVAX1/EGFP


mediante el mtodo de lisis alcalina y se determin la concentracin de nuestro
ADN plasmdico y el grado de impurezas, determinando que el ADN contena una
elevada concentracin de protenas y sales, es decir, estaba contaminado.
En el ensayo de restriccin se realiz la liberacin del inserto y la linearizacin de
nuestro vector. Se observ que el equipo 1 y 2, obtuvieron 2 bandas, las cuales
pudieran pertenecer al el vector (pVAX1) y el fragmento de ADN (EGFP). Pero el
gel del equipo 3 y 4 se observa una clara contaminacin de ADN. Estos
resultados no son confiables debido al grado de impureza que tiene nuestro ADN
plasmdico.

CUESTIONARIO:

1. Qu pasara con la absorbancia del ADN si hubieran utilizado RNAsa?


Discutir con base a las diferentes absorbancias que fueron medidas.
R= Si se hubiera utilizado RNAsas, se hubiera obtenido el rompimiento de la doble
hebra de ADN plasmdico, adems de que esta enzima cataliza la hidrolisis de
ARN en componentes ms pequeos adems de que es Un mecanismo de
proteccin, para el ADN, el cual abarca una fraccin relativamente grande de las
protenas celulares y se une a ciertas RNAsas con mayor afinidad que cualquier
otra interaccin protena-protena por lo que en las absorbancias se puede mostrar
la relacin que hay entre ADN/protena y ADN/sales; que estas relaciones si salen
fuera del rango se estar hablando de una contaminacin del ADN plasmdico ya
sea por sales o protenas e incluso por los dos.
2. Qu actividad prctica propondras para demostrar la integridad e identidad
del plsmido?
R= Una replicacin del plsmido por PCR, despus esta secuenciacin replicada
se llevara a electrofesis en un gel de agarosa para tener el tamao de los
fragmentos obtenidos, seguido de esto se realizara la purificacin, secuenciacin
y obtener el peso molecular del plsmido.
3. Describir los tipos de plsmidos utilizados en la ingeniera gentica as como
sus propiedades.
R= Los plsmidos empleados en ingeniera gentica se llaman vectores. Son muy
tiles para sintetizar en grandes cantidades protenas de inters mediante un
procedimiento conocido como transformacin. Los vectores de clonacin tienen la
capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN.
Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen trans-genes, son capaces de
conjugarse.
Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir
resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como
Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.
Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la
produccin de) colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.

Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales


como tolueno o cido saliclico.
Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.
4. Investigar los mapas genticos de 3 plsmidos de clonacin y de 3 plsmidos
usados para expresin tanto en bacterias como en clulas animales. Colocar
los respectivos diagramas e identificar cada una de sus partes.
PLSMIDO DE CLONACIN

Para el proceso de clonacin, se utiliz el plsmido de referencia pTK-IRES-tPA,


en el cual se realiz la ligacin del gen de la gD amplificada para su posterior
seleccin por resistencia ampicilina generando el plsmido pTK-IRES-tPA-gD
5. Investigar el origen de los sistemas de restriccin tipo II.
R= tipo II: Aqu cada subunidad del dmero reconoce la misma secuencia,
presente en cada una de las partes especulares del palndromo, y realiza un corte
en un lugar especfico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena
de la otra mitad del palndromo. Ms de la tercera parte de las cepas bacterianas
presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a
partir de genes situados en plsmidos. Algunas caractersticas que tiene este
mecanismo son:

Las dos actividades las realizan dos protenas distintas que no


forman complejos multiproteicos.

No utilizan ATP. Slo necesitan iones Mg++ para funcionar. La


metilasa usa SAM como donador de metilos.

Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce la


misma secuencia especfica de ADN.

El sitio de reconocimiento consta de 4 6 pb que constituyen una


secuencia palindrmica.

La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce


grupos metilo en una A o en una G (segn la metilasa en cuestin),
en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento.

La enzima de restriccin suele ser una protena formada por dos


subunidades del mismo tipo, ensambladas simtricamente. Pueden
dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de
restriccin dejan extremos sobresalientes 5', mientras que otras
dejan extremos sobresalientes 3'.

6. Cul es la nomenclatura que se sigue para nombrar una enzima de


restriccin?
R= El nombre de cada enzima de restriccin est asignado segn el origen
bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas
consiste en:
1. Tres letras que corresponden al nombre cientfico del microorganismo (ej.
Escherichia coli (Eco); Haempphilus influenzae (Hin))

2. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa RY13 de E. coli)


3. En nmeros romanos, un nmero para distinguir si hay ms de una
endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima
de restriccin.
4. Todas deberan llevar adelante una R de restriccin o un M de metilasa segn
la funcin de la enzima, pero generalmente se omite.
7. Investiga las secuencias de reconocimiento y los organismos de los cuales se
aislaron las siguientes enzimas de restriccin: EcoR I, Bam HI, Not I, Hind III,
SmaI, XhoI, EcoRVI, XbaI, MunI, HaeIII.
R= Secuencia de reconocimiento de EcoR I producida por la bacteria Escherichia
Coli
5GAATC- 3CTTAAG
Secuencia de reconocimiento de Bam HI producida por la bacteria Bacillus
amyloliquefaciens
5GGATCC- 3CCTAGG
Secuencia de reconocimiento de Not l producida por Nocardia otitidis
5 GCGGCCGC-3 CGCCGGCG
Secuencia de reconocimiento de Hind III producido por Haemophilus influenzae
5AAGCTT-3 TTCGAA
Secuencia de reconocimiento de Sma I producido por Serratia marcescens
5 CCCGGG- 3 GGGCCC
Secuencia de reconocimiento de Xho I producida por Xanthomonas holcicola
CTCGAG
Secuencia de reconocimiento de EcoR I aislada de ciertas cepas de Escherichia
coli. Tiene el nombre alternativo de Eco 321.
3'-CTA | TAG-5'
Secuencia de reconocimiento de XbaI producida por Xanthomonas badrii
TCTAGA

Secuencia de reconocimiento de HaeIII producida por Haemophilus aegyptius


GGCC
8. Identifica los sitios de restriccin del plsmido pVax1-GFP con respecto al uso
de la enzima ECORI. Cuntos fragmentos se deben recuperar y cul es el
tamao de cada uno de ellos?
La enzima EcoRI realiza dos cortes, en 754 y 766, por lo tanto, se recuperan
dos fragmentos a partir de dichos cortes. El primer fragmento tiene un
tamao de 12pb, mientras que el segundo tiene un tamao de 3749pb.
(Thermofisher, 2012)

9. Considerando que el plsmido tuviera sitios de restriccin en los pares de


bases: 587, 925, 2250, y 3427, indicar el nmero de fragmentos que se
obtendran as como su tamao y hacer un diagrama del gel de agarosa que
se obtendra despus de correr las muestras digeridas.
5 0

Fragmento numero 4
Tamao: 921 pb

Cuarto corte: 3427 pb


3` 3761 pd

Primer corte: 587 pd

Fragmento numero 1
Tamao:338 pb

Fragmento numero 3
Tamao: 1177 pb

Segundo corte: 925 pd

pVax1-GFP
2820 pb

3761 pb

Tercer corte: 2250 pd


Fragmento numero 2
Tamao: 1310 pb

940 pb

Suponiendo que el plsmido tuviera los sitios de restriccin anteriormente


mencionados, se obtendran 4 fragmentos de tamao variado (indicados en el
mapa molecular de arriba).
El primer fragmento abarcara desde la base 587 hasta la base 925, teniendo un
tamao de 338 pd.
El segundo fragmento abarcara desde la base 925 hasta la base 2250, teniendo
un tamao de 1310 pb
El tercer fragmento abarcara desde la base 2250 hasta la base 3427, teniendo un
tamao de 1177 pb
El cuarto y ltimo fragmento, correspondera de la base 3427 hasta la base 587,
pasando por la base cero, completando el crculo del cromosoma, teniendo un
tamao de 921
Debido al fundamento de la electroforesis, los fragmentos ms grandes quedaran
al en la parte superior del gel, quedando en este caso los fragmentos en el
siguiente orden: Fragmento 2, con un tamao de 1310 pb, el fragmento 3 con un
tamao de 1177 pb, el fragmento 4 con un tamao de 921 pb y por ltimo el
fragmento 1 con un tamao de 338 pb.
Haciendo uso del marcador de peso molecular Gene ruler 1 kb, las bandas
quedaran de la siguiente forma en el gel de agarosa:

Cdigo de colores

Fragmento 2:
Fragmento 3:
Fragmento 4:
Fragmento 1

10. Por qu es importante hacer un anlisis de restriccin?


Es para verificar si hay plsmido de acuerdo al tamao de los fragmentos
obtenidos.
BIBLIOGRAFAS:

Enzimas de reconocimiento. (n.d.). Retrieved from


http://www.biorom.uma.es/contenido/av_biomo/FigT10/Tema10.pdf
FIBAO, M. M. (n.d.). Tipos de plasmido. Retrieved from http://medmol.es/glosario/87/
Joshua, L. (1952). cell genetics and herededitary symbiosis. (Vol. 32). Physiol.
Klein, D. W., Prescott, L. M., & Harley, J. (1999). Microbiology. Boston : Mc Graw-Hill .
Lewis, B. (1996). Genes. Barcelona-Bogota-Buenos Aires.: Reverte S.A.
Thermofisher. (2012, 03 02). Thermofisher. Retrieved 10 09, 2015, from Thermofisher:
http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pvax1_man.pdf