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Introducción a las

técnicas cromatográficas
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03/08/2015
Introducción a las técnicas cromatográficas

Descripción general de la cromatografía.

Parámetros cromatográficos.

Ensanchamiento de banda y eficacia de la columna.

Resolución de la columna.

Aplicaciones de la cromatografía.

Ejercicios.

Definición de cromatografía
Según la IUPAC, la cromatografía es un método físico de separación en el que los
componentes a separar son distribuidos entre dos fases, una de las cuales
permanece estacionaria mientras que la otra se mueve en una dirección
determinada.
Por lo tanto, en cualquier proceso cromatográfico distinguimos:

Una fase móvil (FM), que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico,
en la que va disuelta la muestra.

Una fase estacionaria (FE) inmiscible, la cual se mantiene fija sobre una
columna o sobre una superficie sólida.

Los componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven con
mayor lentitud en la fase móvil, mientras que aquellos que se unen débilmente a la fase
estacionaria se mueven con mayor rapidez. Esta diferencia de velocidades en el seno de
la fase móvil permite la separación y el análisis cualitativo o cuantitativo de los
componentes.

Clasificación de los métodos cromatográficos
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Según la forma de contacto entre la FM y la FE:

Cromatografía en columna: la FE se introduce en una columna estrecha a
través de la cual pasa la FM por efecto de la gravedad o de una presión aplicada.

Cromatografía plana: la FE se fija sobre una placa plana o a los intersticios de
un papel y la FM se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o
por gravedad.

Según el estado físico de la FM:

Cromatografía de líquidos: la fase móvil es un líquido.
Distinguimos la cromatografía líquido-líquido o de reparto (la FE es un
líquido), la cromatografía líquido-sólido o de adsorción (la FE es un sólido),
la cromatografía de intercambio iónico (la FE es una resina intercambiadora
de iones), la cromatografía de exclusión por tamaño (la FE es un líquido en
los intersticios de un sólido polimérico) o la cromatografía de afinidad (la FE
es un grupo de líquidos específicos unidos a una superficie sólida).

Cromatografía de gases: la fase móvil es un gas. Distinguimos la
cromatografía de gas-líquido (la FE es un líquido adsorbido o unido a una
superficie sólida) o la cromatografía gas-sólido (la FE es un sólido).

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el proceso de separación produce una dilución considerable del analito. las bandas van llegando individualmente al final de la columna y son eluidas. Cromatografía de fluidos supercríticos: la fase móvil es un fluido supercrítico (la FE está compuesta por moléculas orgánicas enlazadas a una superficie sólida). Cromatografía de elución en Columna La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por la adición de nueva fase móvil: Inicialmente se introduce una cierta cantidad de muestra diluida en FM. Según sea el coeficiente de reparto. Lógicamente. 3 . el eluyente (la parte de la muestra contenida en en la FM) desciende por la columna. que es la que consigue hacerlos avanzar. cuanto más tiempo pasen en la fase móvil. por lo que avanzarán a menor velocidad. A medida que se va añadiendo más FM a la columna. más rápidamente se moverán. por lo que los detectores empleados deben ser más sensibles que los que serían necesarios si el proceso de separación no fuera imprescindible. Por tanto. Al ir añadiendo FM nueva. donde tiene lugar un reparto o distribución entre la FM y la FE. Si al final de la columna se coloca un detector que responde a la concentración del soluto y se registra su señal en función del tiempo (o del volumen de FM añadido) se obtiene un cromatograma. los solutos estarán más o menos tiempo en la fase móvil. en una serie continua de transferencias entre las dos fases. La diferencia en la velocidad de desplazamiento de los solutos o analitos permite su separación en zonas o bandas a lo largo de la columna. Los solutos que presenten una mayor afinidad por la FE quedarán más tiempo retenidos. La fracción eluida se denomina eluato.

 Tiempo de retención (tR): tiempo transcurrido desde la inyección de la muestra hasta que uno de los componentes llega al detector.Parámetros cromatográficos 04/08/2015Deja un comentario 04/08/2015 Cromatograma El cromatograma es la curva de elución que se obtiene en una cromatografía y representa la señal recogida por el detector en respuesta a la concentración de analito en función del tiempo o del volumen de fase móvil añadido:  Tiempo muerto (tM o t0): tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector.  Volumen de retención (VR): volumen necesario para eluir un determinado soluto en la columna. 4 .  Volumen muerto (VM o V0): volumen de fase móvil necesario para eluir una especie no retenida.  Tiempo neto de retención o tiempo de retención corregido (t’R): es la diferencia entre el tiempo de retención de un componente con respecto al de una sustancia no retenida (tR – tM).

Los picos cromatográficos tienen forma de curva de error normal o Gaussiana. El valor de K se mantiene constante en un amplio intervalo de temperaturas. para un determinado soluto A: Siendo K la constante de distribución entre las dos fases y de ella dependerá. Estas curvas representan la distribución simétrica de los datos replicados alrededor de la media.  Desviación estándar (σ): altura media del pico en el punto de inflexión.  Altura de pico (h): intensidad máxima registrada por el detector. en buena medida. por lo que existe una proporcionalidad entre las concentraciones de soluto la fase estacionaria y la fase móvil.  Anchura de base del pico (ω): se define como 4σ. el reparto de soluto entre ellas y. Constante de distribución La distribución de un soluto entre la fase móvil y la estacionaria se puede describir mediante el siguiente equilibrio. en cuyo caso se habla de cromatografía lineal y los picos recogidos en el cromatograma son simétricos: 5 . por tanto.  Anchura de pico a la semialtura (ω0’5): es igual a 2’354σ. su separación.

Velocidad de migraciÓN La velocidad lineal promedio de la migración del soluto a lo largo de una columna de longitud L se define como: La velocidad lineal promedio de las moléculas en la fase móvil será: Ambas se pueden relacionar así: Esta última expresión relaciona la velocidad de migración del soluto con la constante de distribución y de los volúmenes de las fases móvil y estacionaria. Tasa de flujo volumétrico 6 .Las asimetrías suelen ser debidas a la presencia en la fase estacionaria de lugares que retienen al soluto con más fuerza que otros o a la inyección de una cantidad excesiva de muestra.

desconocemos el volumen disponible para el líquido.En el caso de un columna tubular abierta. Valores mucho mayores indican un tiempo de elución excesivamente largo. por lo que se expresa así: factor de capacidad o de retención El factor de capacidad o de retención para un soluto A se define como: El factor de retención mide la relación entre el tiempo que las moléculas del analito están en la fase estacionaria y el que están en la fase móvil. Valores mucho menores que la unidad indican que el analito sale de la columna en un tiempo próximo al tiempo muerto. Lo ideal es que el valor de los factores de retención de los solutos de una muestra oscilen entre 1 y 10. Se usa para comparar las velocidades de migración de los solutos. la tasa de flujo volumétrico F (cm³/min) está relacionada con la velocidad lineal a la salida de la columna: En el caso de una columna rellena. FACTOR DE Selectividad El factor de selectividad de una columna para dos solutos A y B se define como: 7 . y no depende de la forma de la columna o de la tasa de flujo volumétrico.

la altura de plato teórico H se puede definir en función de dichos parámetros como: 8 . El número de platos teóricos N de una columna de longutid L será: Cuantos más platos teóricos formen una columna mayor será su eficacia (o lo que es lo mismo. Podemos definir. denominadas platos teóricos. en los cuales se establece el equilibrio de distribución de cada soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Por lo tanto. Teoría de los platos teóricos Considera que una columna cromatográfica está constituida por una serie de capas estrechas. discretas pero contiguas. Como los picos cromatográficos tienen forma de curva gaussiana. plato teórico como la longitud de una columna en la que el soluto experimenta un equilibrio completo entre las dos fase. Ensanchamiento de banda y eficacia de una columna cromatográfica 04/08/2015Deja un comentario La eficacia de la separación de los componentes de una mezcla en una columna cromatográfica guarda una estrecha relación con la forma y la separación de los picos cromatográficos que se reflejan en el cromatograma.La selectividad es una manera de medir la eficiencia de una separación cromatográfica. la anchura de cada pico está directamente relacionada con la varianza (σ²) o la desviación estándar (σ). entonces. cuanto menor sea la altura de plato mayor será la eficacia).

Se puede deducir que el número de platos teóricos se relaciona con parámetros que pueden deducirse fácilmente de un cromatograma: Siendo tR el tiempo de retención del soluto.  Difusión longitudinal: desde la zona central de la banda. hacia los extremos de la banda. Los factores que contribuyen a la anchura de banda son:  Difusión en remolino o difusión de Eddy: las moléculas en disolución pueden atravesar la columna siguiendo trayectorias de distinta longitud con tiempos de retención diferentes. donde la concentración es menor. es inversamente proporcional 9 . en la que la concentración de solutos es mayor. Teoría cinética de la cromatografía Uno de los factores que afectan a la eficacia es el ensanchamiento de banda: La teoría cinética de la cromatografía ofrece una explicación más realista que la teoría de platos y permite razonar cuantitativamente las formas y también los anchos de las bandas. ω el ancho de la base del pico y ω0’5 es el ancho del pico a la mitad de su altura. es directamente proporcional al diámetro de las partículas que componen el relleno de la columna y no se ve afectada por la velocidad de difusión de la fase móvil. La forma gaussiana de una banda se atribuye a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las distintas moléculas a medida que descienden por la columna. cuando éstas son suficientemente altas. Conviene recordar que el plato teórico es una construcción artifical que nos permite explicar la forma de los picos y la velocidad de desplazamiento a través de la columna.

La difusión en los líquidos es muy lenta y su efecto es mucho menor que en los gases.a la velocidad de flujo de la fase móvil. ya que el equilibrio de distribución no es inmediato y no tiene el tiempo suficiente para establecerse. Estos tres factores se relacionan con la altura de plato mediante la ecuación de van Deemter: Si representamos la altura de plato frente a la velocidad de flujo de la fase móvil. por lo que cuanto mayor es la velocidad de flujo de la fase móvil más breve es el periodo de tiempo que el analito reside en la columna (la difusión desde el centro de la banda hacia los extremos tiene menos tiempo para producirse).  Resistencia a la transferencia de masa entre la fase móvil y la fase estacionaria. vemos que existe una velocidad de flujo óptima para la cual la altura de plato se hace mínima y la eficacia es mayor: Resumimos los factores que afectan al ensanchamiento (permiten optimizar el valor de H):  Diámetro de las partículas que constituyen el relleno de la columna: al aumentar el diámetro aumenta la difusión en remolino 10 . por lo que es proporcional a la velocidad de flujo.

se debe tener en cuenta el ensanchamiento de banda extracolumna.  Velocidad de flujo de la fase móvil. La resolución (Rs) de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos (A y B).  Modificar las velocidades de migración (o los tiempos de retención) de los solutos: al aumentar la diferencia entre las velocidades (o los tiempos) se mejora la separación.  Coeficiente de difusión: su influencia es detectable en el caso de los gases.  En HPLC. en el caso de los líquidos su efecto es mínimo. Para ello se procurará:  Reducir el ensanchamiento de banda: al reducir la altura de plato se aumenta la eficacia de la columna. por ejemplo). ya que las velocidades suelen ser lo suficientemente elevadas como para que el término de transferencia de masar sea el que controla la eficacia de la columna. y permite evaluar la separación entre dos bandas con respecto a sus anchos: 11 .  Otros factores. Diámetro de la columna: al disminuir el diámetro de la columna se disminuye la contribución de la difusión de remolino a la altura de plato teórico. Resolución en las columnas cromatográficas 05/08/2015Deja un comentario Una separación cromatográfica se optimiza variando las condiciones experimentales hasta que los componentes de una mezcla se separan completamente en el menor tiempo posible. cuando la velocidad de flujo no es muy grande y el término de difusión longitudinal es determinante (aumenta con la temperatura). el tamaño de la muestra o la rapidez de la inyección (una inyección lenta conduce al ensanchamiento de banda y disminuye la eficacia). como la naturaleza de la fase móvil (su viscosidad.

Con una resolución igual a 1’0 el solapamiento entre los dos picos es del 4 %. el factor de selectividad y el número de platos que forman la columna: 12 . Con una resolución de 1’5 el solapamiento es tan sólo del 0’3 % y permite una separación esencialmente completa de los dos componentes: Factores que aFectan a la resolución de la columna La resolución de la columna se puede relacionar con los factores de retención de los dos componentes A y B.

lo cual aumentaría el tiempo necesario para la separación. controlando la velocidad del flujo o reduciendo la viscosidad de la fase móvil. cuando las FM son líquidas. o bien. y empleando tamaños de muestra pequeños para disminuir la resistencia a la transferencia de materia. Esto se puede conseguir aumentando la longitud (L) de la columna. en muchas ocasiones resulta difícil encontrar unas condiciones experimentales únicas que consigan la resolución de todos los picos de los analitos y además permitan la perfecta cuantificación de los mismos. un menor diámetro de la columna. cambiando la naturaleza de la fase estacionaria o mediante algún efecto químico específico. El factor de retención puede adecuarse modificando la temperatura. 13 .  Variación del factor de selectividad (α): el aumento de α (manteniendo kB entre 1 y 5) también puede lograrse modificando la temperatura de la columna o la composición de la fase móvil. o modificando la composición del disolvente. Según la ecuación de van Deemter la altura de plato puede disminuirse con un menor diámetro de las partículas del relleno. Variación del número de platos (N): Se consigue mejorar la resolución de la columna aumentando el número de platos. pero que dan lugar a tiempos de retención excesivos. El problema general de la elución En muestras complejas de un gran número de componentes.  Variación del factor de retención o capacidad (kB): el valor óptimo debe estar entre 1 y 5. Valores superiores no suponen un aumento significativo de la resolución. o disminuyendo la altura de plato (H). en el caso de FM gaseosas.

el incremento de temperatura permite conseguir las condiciones óptimas para las separaciones (programación de temperatura).  Análisis cuantitativo: los métodos cromatográficos proporcionan una valiosa información cuantitativa acerca de las especies separadas. bajo coste y gran eficacia de separación. caudal de la fase móvil. velocidad de inyección de la muestra…). estrechos y simétricos. Análisis basados en la altura del pico Se pueden realizar estudios cuantitativos de las muestras separadas a partir de las alturas de los picos cromatográficos.  Análisis cualitativo: la cromatografía es una herramienta muy empleada para identificar determinados componentes en mezclas sencillas de composición conocida. Aplicaciones de la cromatografía 05/08/2015Deja un comentario Las técnicas cromatográficas están ampliamente extendidas y su enorme aplicación se debe a su elevada sencillez. En cromatografía de gases. por lo que su aplicación es limitada. agudos. Hay que tener en cuenta que la altura es inversamente proporcional a la anchura del pico. mediante la comparación de las alturas o las áreas de los picos.Una solución frecuente consiste en cambiar las condiciones que afectan a k mientras tiene lugar la separación. 14 . La mayor precisión se consigue cuando tenemos picos bien definidos. Puede ser útil en ensayos de rutina o en aquellos en los que se prefiera una mayor rapidez. con una sensibilidad que supera en muchas ocasiones a la de otras técnicas. por lo que este método se ve muy afectado por las condiciones experimentales (temperatura de la columna. En cromatografía de líquidos se recurre a variaciones en la composición de la fase móvil durante la elución (elución en gradiente). esta identificación se hace a partir de la evaluación del tiempo de retención observable en el cromatograma. aunque se pierda exactitud.

La resolución de algunos picos puede ser problemática. Así. En realidad. Por ello. por lo que estos análisis son más precisos que los basados en las alturas de los picos. Una forma de estimar el área de los picos es multiplicar su altura por el ancho a la mitad de su altura. Con la información obtenida en el cromatograma.  Método de la normalización de las áreas: en este caso se procederá a la elución completa de todos los componentes de la muestra para determinar las áreas de todos los picos. De esta manera. en lugar de utilizar las áreas/alturas de los picos. que permitan establecer una relación lineal que nos servirá para determinar la concentración de la muestra problema. suelen emplearse dos métodos que solucionan este problema:  Método del patrón interno: se introduce en cada estándar y en la muestra una cantidad exactamente medida de otra sustancia que llamamos patrón interno. podemos reallizar una representación de las áreas o las alturas de los picos en función de las respectivas concentraciones. El error más habitual deriva de la incertidumbre en el volumen de la muestra. tomaremos como parámetro analítico la relación existente entre las áreas/alturas de los picos del analito y del patrón interno. Existen programas informáticos que ayudan al analista a calcular estas áreas.Análisis basados en las áreas de los picos Las áreas de los picos son independientes de la anchura. que puede ser realmente importante al tratar con muestras de volumen muy pequeño. siendo el parámetro analítico la relación de su área con el área total de 15 . cuyo pico cromatográfico esté bien diferenciado. aunque haya imprecisión en el volumen inyectado. aunque su lectura sea más sencilla. método de calibrado El método más sencillo para llevar a cabo un análisis cuantitativo de una muestra mediante cromatografía implica la preparación de una serie de disoluciones patrón de concentración conocida y de composición similar a la muestra. la relación entre analito y patrón interno no se verá afectada. la mayoría de los cromatógrafos actuales incluyen sistemas de integración electrónicos y programas informáticos que permiten que el analista pueda determinar con precisión las áreas de los picos.

los picos. Para poder emplear este método debemos tener mezclas que en las condiciones en las que trabajemos se puedan eluir todos los componentes en un tiempo razonable. Ejercicios de introducción a la cromatografía 05/08/2015Deja un comentario Ejercicio 1 Cálculo del número y la altura de los platos teóricos de una columna cromatográfica: Ejercicio 2 Cálculo de diferentes parámetros cromatográficos a partir de la información proporcionada por un cromatograma: 16 .

17 .

Ejercicio 3 Cálculos para obtener y mejorar la resolución de una separación cromatográfica: Ejercicio 4 Presta atención a la deducción y las aplicaciones de la siguiente expresión: 18 .

19 .

20 .

Ejercicio 5 Aplicación de la cromatografía con fines cuantitativos. basado en las áreas de los picos. Puedes ver más aplicaciones de los fundamentos cromatográficos aquí. 21 .