You are on page 1of 12

METODE DETEKSI ASAM NUKLEAT

oleh: Arif Hendrawan/1406531763

Abstrak
Asam nukleat dalam intisel terbagi menjadi dua jenis yaitu DNA (deoxyribonucleic acid)
atau asam deoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic acid ) atau asam ribonukleat. Deteksi asam
nukleat diartikan sebagai cara atau teknik untuk menganalisis asam nukleat pada suatu sampel.
Analisis ini bisa ditinjau dari dua sisi, yaitu dari segi kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif ini
bertujuan untuk mengetahui berat molekul dan urutan kode dari asam nukelat. Beberapa macam
metode yang termasuk analisis kualitatif adalah pewarnaan, elektroforesis gel, blotting, RFLP,
hibridisasi in situ, dan DNA/RNA sequencing. Sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk
mengetahui konsentrasi atau kadar asam nukleat pada sampel. Metode-metode yang tergolong
dalam analisis kuantitatif adalah spektrofotometri UV-Vis, PCR, microarray, dan SAGE.
Pendeteksian dari asam nukleat banyak sekali dimanfaatkan dalam bidang kedokteran dan
biokimia, umumnya analisis gen-gen sel abnormal.

Kata Kunci: deteksi, asam nukleat, analisis kualitatif, analisis kuantitatif, staining, elektroforesis
gel, blotting, hibridisasi in-situ, RFLP, DNA/RNA sequencing, SAGE, spektrofotometri
UV-Vis, microarray, PCR

A. Analisis Kualitatif
Secara sederhana metode ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen tertentu di
dalam asam nukleat, di berat molekul dari DNA/RNA, dan urutan kode genetic dari DNA/RNA.
Metode ini terdiri dari pewarnaan (staining), elektroforesis gel, blotting, RFLP, hibridisasi in situ,
dan DNA/RNA sequencing.
A.1. Pewarnaan (staining)
Metode staining ini menggunakan tambahan pewarna ke dalam sampel yang ingin diamati
untuk mendeteksi keberadaan DNA atau RNA sehingga mempermudah pengamatan visualisasi
dibawah mikroskop. Jenis pewarna yang digunakan untuk DNA/RNA ini pun khusus, berikut
beberapa contohnya:
1. Acridine Orange
Jenis pewarna ini akan memberikan warna hijau (526 nm) bila berikatan dengan DNA, dan
akan memberikan warna merah (650 nm) bila berikatan dengan RNA.

dan 4) In vitro stain. Dye mengikat sampel. Kemudian larutan yang mengandung potongan DNA ini diletakan di dalam gel. Tujuannya untuk menghentikan proses metabolisme dan mencegah degradasi struktur sel. Untuk mengetahui letak nucleus (warna pendar) & siklus sel (letak DNA/RNA)  Prosedur percobaannya yaitu : 1) Fixation. Lalu gel ini dihubungkan dengan arus listrik sehingga salah satu sisi gel akan bermuatan  positif.2. Mengetahui apakah sampel termasuk sel hidup atau tidak dengan mendeteksi keberadaan DNA 2. Menyisipkan dye pada sampel sehingga sampel berwarna (mordant). Bersifat kationik. sedangkan sisi lainnya bermuatan negatif. Berat molekul dari suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan dengan laju migrasi fragmen DNA yang sudah diketahui berat molekulnya. Acridine Orange Ethidium Bromide  Tujuan dilakukannya metode ini adalah untuk: 1.  Prosedur percobaan elektroforesis gel yaitu :  DNA akan dipotong menjadi beberapa fragmen oleh enzim restriksi. maka semakin rendah laju migrasinya. Dapat dilakukan sebelum atau sesudah fixation dan mounting. Pewarnaan jaringan hidup.2. Elektroforesis Gel  Metode ini bertujuan untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas perbedaan berat molekul dan struktur fisiknya. Tujuannya untuk merawat membran (surfaktan ringan) dan memungkinkan molekul dye yang lebih besar masuk ke bagian dalam sel. 2) Permeabilization. Dye mengelilingi sampel. Hoechst Jenis pewarna ini akan memberikan warna biru (461 nm) bila berikatan dengan DNA. Bersifat anionic. Dapat menggunakan bahan kimia ataupun pembekuan. A.  Tipe staining yaitu : 1) Basic stain (positive stain). . Meletakkan sampel ke preparat mikroskop (microtom). Makin besar berat molekulnya. dan 4) Stainning. 2) Acidic stain (negative stain). Fragmen DNA akan bergerak dari sisi negatif ke sisi positif. 3) Mounting. Pewarnaan jaringan yang sudah dipisahkan dari hubungan biologinya. Mengetahui apakah sampel berada dalam siklus proses sintesis protein dengan mendeteksi keberadaan RNA 3. 3) In vivo stain.

dan southern blotting untuk mengetahui urutan kode dari suatu sampel DNA. Metode blotting ini ada 2 jenis yaitu northern blotting untuk mengetahui ekspresi gen dengan cara mendeteksi RNA. Elektroforesis Gel Agarosa Dituangkan secara horizontal Memisahkan molekul yang besar Non-toxic Kebanyakan digunakan untuk pemisahan Elektroforesis Gel Poliakrilamida Dituangkan secara vertical Memisahkan molekul yang kecil Neurotoxic Digunakan untuk pemisahan DNA atau DNA Tahap pewarnaan sebelum dan sesudah protein Tahap pewarnaan setelah penuangan gel penuangan gel Mempunyai laju pemisahan yang lebih cepat Pembuatannya lebih sulit. kapiler. Denaturasi (untuk DNA). Mengalirkan listrik sehingga DNA/RNA yang bermuatan negatif akan  bergerak ke katoda (elektroda positif). dan Kemudian sampel diberi warna agar dapat terlihat jelas Gambar 1. Blotting Metode ini digunakan untuk mengetahui ekspresi gen atau urutan kode dari suatu RNA/DNA. Prosedur percobaan elektroforesis gel  Tipe elektroforesis gel : 1) Agarose (DNA/RNA).3. DNA/RNA dipisahkan dengan metode elektroforesis gel. Elektroforesis. . karena menggunakan poliakrilamida dengan resolusi tinggi A. Sampel DNA/RNA diletakkan pada membran nilon dengan proses transfer vakum. dan 2) Poliakrilamidan(protein). Prosedur percobaan blotting secara umum : 1) 2) 3) 4) DNA/RNA genom dipotong dengan enzim restriksi endonuclease. ataupun listrik.

Probe ini diartikan sebagai asam nukleat berantai tunggal yang telah diberi label atau penanda sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi sekuens dari sampel.4. Langkah-langkah Southern/Northern Blotting A. DNA-RNA. Hibridisasi Insitu Metode ini merupakan suatu cara untuk mengidentifikasi atau mengetahui suatu letak gen dari spesies dengan cara menghubungkan DNA/RNA sampel dengan DNA/RNA probe (masingmasing DNA/RNA berantai tunggal) sehingga berkemungkinan menghasilkan pasangan DNADNA. dan 7) Visualisasi dan deteksi (radioaktif atau non-radioaktif).5) Pelabelan DNA probe. Prinsip kerja baik dari FISH maupun GISH sama dengan hibridisasi in situ secara keseluruhan. Probe dapat digunakan untuk mendeteksi sekuens dari sampel karena memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer. probe yang digunakan ber-fluorescent yang dapat berpendar jika dikenakan sinar UV dan hanya berupa potongan asam nukleat pendek. Perbedaan dari kedua jenis metode ini adalah pada jenis probe yang digunakan. Sedangkan pada GISH probe yang digunakan adalah keseluruhan genom DNA dari suatu species. Tahapan kerja hibridisasi in situ: 1. atau RNA-RNA. Pada FISH. Pengikatan DNA berantai tunggal (sampel) pada membrane 2. Gambar 2. Selain itu metode ini juga ada 2 jenis. 6) Hibridisasi dengan DNA/RNA probe. yaitu fluorescent in situ hybridization (FISH) dan genomic in situ hybridization (GISH). Penambahan DNA probe ke dalam membrane agar terjadi pasangan antara DNA sampel dan DNA probe .

Misalkan dengan metode ini kita ingin mengetahui asal gen pembawa suatu penyakit. Proses hibridisasi yang terjadi pada membrane akan menentukan panjang tiap-tiap fragmen yang berkomplemen dengan DNA probe 5. Aplikasi dari RFLP adalah untuk menganalisis suatu penyakit turunan di dalam keluarga.3. Tiap panjang fragmen ini disebut alel dan bisa digunakan untuk analitik genetic .5. Restriction Fragmen Length Polymorphism (RFLP) Dalam dunia biologi molecular RFLP merupakan suatu cara yang digunakan untuk mengeksploitasi beberapa variasi sekuens DNA yang homolog. Melakukan pencucian untuk menghilangkan sisa-sisa DNA probe yang tidak berpasangan dengan DNA sampel 4. DNA yang telah diisolasi dari sampel dipotong menjadi beberapa fragmen oleh enzim restriksi 2. Tahapan kerja hibridisasi in-situ A. Fragmen DNA yang telah terpisah dipindahkan ke dalam membrane melalui proses southern blotting 4. Hasil fragmen DNA ini dipisahkan dengan metode elektroforesis gel 3. Deteksi adanya hybrid dari pasangan DNA sampel dan DNA probe Gambar 3. Tahapan kera RFLP: 1. Dengan begitu asal muasal pembawa penyakit tersebut bisa diketahui. Selain itu dengan RFLP ini kita juga bisa mengetahui kemungkinan anggota keluarga lainnya untuk terjangkit penyakit. Maka langkah pertama adalah menganalisis DNA tiap anggota keluarga yang terjangkit penyakit dan mencocokan alelnya.

2) Denaturasi isolat DNA. 4) Elektroforesis gel. Terbentuk empat pasang potongan rantai primer yang terputus akibat bantuan DNA polymerase dan dideoxynukelotida. 2) Perlekattan primer dan pemanjangan basa. 3) Penambahan dimetil sulfat dan hidrazin. sedangkan pada metode Maxam-Gilbert proses sequencing berdasar pada reaksi peluruhan kimia. Pemutusan rantai primer dari DNA sampel menggunakan panas dan formamida. dan 5) Analisis urutan basa nukleotida pada DNA sampel dari urutan dideoxinukleotida pada potongan rantai primer Prinsip kerja metode Maxam-Gilbert: 1) Penandaan isolat rantai DNA dengan radioisotop 32P pada ujung 5’.6. Tahapan proses deteksi RFLP A. dan .Gambar 4. Pemisahan potongan rantai primer. 5) Elektroforesis fel. Tahapan kerja metode Sanger: 1) Denaturasi isolat DNA sehingga menjadi rantai tunggal dengan panas atau enzim restriksi. Dimetil sulfat bereaksi dengan purin dan hidrazin bereaksi dengan pirimidin untuk mematahkan ikatan glikosida antara gula ribosa dengan basa. DNA/RNA Sequencing DNA sequencing merupakan suatu metode untuk mengetahui secara tepat urutan nukleotida yang ada di dalam DNA. 3) Terminasi. DNA sequencing ini terbagi menjadi 2 metode. 4) Piperidin menjadi katalis untuk ikatan fosfodiester (tempat basa pada ikatan glikosida sebelumnya digantikan). sehingga keduanya menjadi rantai tunggal yang dapat disequence secara terpisah. yaitu metode Sanger dan metode Maxam-Gilbert. Pemisahan fragmen rantai tunggal hasil reaksi. Pada metode Sanger proses sequencing memanfaatkan enzim DNA polymerase.

 Terdapat 2 jenis spektroskopi yang sering digunakan. B.  Prosedur percobaan spektroskopi yaitu : 1) Isolasi DNA/RNA sampel. PCR. oleh karena itu RNA ini harus diubah terlebih dahulu menjadi cDNA dengan menambahkan enzim transcriptase. Sifat RNA kurang stabil bila dibandingkan dengan DNA. dan SAGE. B. maka dapat ditentukan kemurnian dan konsentrasi DNA/RNA. Pada RNA sequencing dengan metode Sanger ada sedikit perbedaan dengan yang sudah dijelaskan sebelumnya. Metode ini terdiri dari spektrofotometri UV-Vis.0→ nilai dd H 2 O yang diambil lebih banyak dari DNA /RNA  Menghitung konsentrasi DNA menggunakan rumus : [ DNA ]= Å 260 × 50× faktor pengenceran .8 → isolasi belum murni kemurnian> 2. Setelah berubah menjadi cDNA maka proses selanjutnya adalah sama mulai dari tahap awal. dan 5) Analisis hasil absorbansi.6) Pembacaan autoradiogram untuk menentukan sekuens DNA sampel. Analisis Kuantitatif Secara umum metode ini bertujuan untuk menentukan kadar/konsentrasi DNA/RNA yang ada di dalam suatu sampel. 3) Peletakkan kuvet berisi sampel ke dalam spektrofotometer. 2) Pelarutan sampel dan peletakannya ke dalam kuvet. yaitu : Spektroskopi Sinar Tampak Sinar tampak Panjang gelombang 380-750 Spektroskopi UV-Vis UV dan sinar tampak Panjang gelombang 190-380 nm nm Sampel harus berwarna Sampel tidak harus berwarna  Menghitung kemurnian DNA/RNA menggunakan rumus : kemurnian= Å 260 Å 280 Dalam hal ini.8 – 2. Dengan adanya perbedaan kemampuan menyerap sinar UV. Mircroarray. sedangkan kontaminan protein atau fenol pada 280 nm.  Pita ganda DNA/RNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm. 4) Penembakan kuvet berisi sampel dengan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. kemurnian DNA berkisar Antara 1. Spektrofotometri UV-Vis  Merupakan metode analisis yang digunakan untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian DNA/RNA suatu sampel berdasarkan kemampuan basa nukleotida (purin dan pirimidin) menyerap cayaha.0 sehingga : kemurnian<1.1.

50 adalah larutan dengan nilai absorbnsi 1.  Menghitung konsentrasi RNA menggunakan rumus : [ RNA ] =Å 260× 50× faktor pengenceran Dalam hal ini.0 sebanding dengan 50µg untai ganda DNA per ml atau 50µg/ml untai ganda DNA (dsDNA). PCR (Polymerase Chain Reaction) Metode ini digunakan untuk membuat salinan suatu segmen tertentu dalam jumlah yang banyak dari DNA sampel. B. namun pada umumnya berkisar 72oC. Pada tahap ini dipastikan bahwa tiap rantai tunggal DNA telah mengalami proses elongasi .0 sebanding dengan 40µg untai tunggal RNA per ml atau 40µg/ml untai tunggal RNA (ssRNA). Tahap ekstensi/elongasi: suhu pada tahap ini tergantung dari DNA polymerase yang digunakan. mengidentifikasi bakteri atau virus.Dalam hal ini. 40 adalah larutan dengan nilai absorbnsi 1. Tahap akhir elongasi: suhu pemanasan pada tahap ini berkisar 70-74oC selama 5-15 menit. Tahap denaturasi: pemanasan kembali DNA template pada suhu 94-98oC selama 2030 detik. Tahap inisialisasi: pemanasan DNA template pada suhu 94-96oC selama 1-9 menit 2. Tahap annealing: suhu pemanasan diturunkan sampai 50-65oC selama 20-40 detik.2. Tahapan kerja PCR: 1. Pada tahap ini DNA akan memisah dan menjadi rantai tunggal 3. membantu kepolisian dalam mengungkap kasus criminal. Pada tahap ini primer akan menempel pada DNA template 4. Umumnya metode ini digunakan untuk mendiagnosa penyakit. dan lain-lain. Pada tahap ini DNA polymerase mulai mensintesis rantai DNA baru yang komplemen dengan cara menambahkan dNTP yang sesuai ke DNA template 5.

Memberi pewarna yang berbeda pada tiap cDNA (misal sel normal diberi warna hijau. Kenyataannya tiap gen yang identik belum tentu selalu aktif di tiap sel tubuh manusia. Untuk melihat pola warna yang terbentuk diperlukan alat pindai khusus . Tahapan kerja microarray: 1. Dengan mengetahui karakteristik ini. yang nantinya akan merubah mRNA menjadi cDNA 3. Lalu meletakan kedua jenis cDNA pada alat microarray 5.Gambar 5. Menandai tiap mRNA yang telah diisolasi dengan enzim transcriptase. Skema PCR B. dan sel kanker diberi warna merah) 4. Microarray Mircroarray ini merupakan suatu metode yang digunakan untuk melihat dan mempelajari gen mana saja yang aktif di dalam sel tubuh manusia. dan pola warna yang sebelumnya diberikan pada masing-masing cDNA akan bercampur 6. sekarang para ilmuwan sudah bisa mengetahui efek negatif yang ditimbulkan apabila gen yang berada di dalam sel tubuh manusia tidak bekerja secara normal. Dengan teknologi ini ilmuwan sudah mulai lebih memahami beberapa jenis penyakit dan infeksi yang bisa terjadi pada tubuh manusia.3. Mengisolasi mRNA yang ada di dalam sel tubuh 2. Pada alat ini cDNA tadi akan mengalami hibridisasi.

Apabila pada hasil pindai lebih banyak menghasilkan pola berwarna hijau maka sel normal lebih aktif daripada sel kanker. Proses deteksi dengan microarray Misalkan menggunakan gambar contoh diatas. Namun apabila lebih banyak menghasilkan pola berwarna merah berarti sel kanker lebih aktif daripada sel normal. pasien yang diuji melalui metode microarray ini memiliki kemungkinan untuk terkena kanker.Gambar 6. B. Mengklon rangkaian sekuens tersebut 5. atau biasa disebut concatamer 4. Dalam bidang biologi molekular metode ini biasa dipakai untuk memahami karakteristik sel yang sehat dan yang terkena penyakit dengan cara membandingkan kedua sel yang berbeda.4. Mengurutkan rangkaian yang telah diklon dengan DNA sequencers 6. Mengekstraksi sebagian sekuens pada bagian tertentu dari tiap mRNA 3. SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) SAGE merupakan metode yang digunakan untuk analisis secara keseluruhan dari pola ekspresi gen. dan melihat aktivitas gen dalam sel secara keseluruhan. Analisi data yang didapat dengan computer untuk menghitung label sekuenssekuens yang lebih kecil . Concatamer : menghubungkan tiap-tiap sekuens yang telah dipisahkan membentuk rangkaian yang lebih panjang. menggambarkan populasi mRNA yang ada dalam sampel. Lalu apabila pola yang muncul berwarna kuning (bukan kedua warna awal yang telah kita berikan) ini artinya sel normal dan sel kanker memiliki tingkat keaktifan yang sama. Secara sederhana berikut tahapan kerja dari SAGE: 1. Mengisolasi mRNA dari sel sampel (misal sel tumor/kanker) 2. Dengan kata lain berdasarkan contoh gambar diatas. sel normal diberi pewarna hijau dan sel kanker diberi pewarna merah.

Elektroforesis gel untuk memisahkan fragmen DNA/RNA. yaitu : 1. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk memperbanyak DNA/RNA dan menghitung jumlah yang dihasilkan. Microarray untuk analisis gen aktif. 5. Spektroskopi untuk mengukur kemurnian dan konsentrasi DNA/RNA. 3. Hibridisasi untuk mengetahui urutan basa nukleotida dengan memasangkan DNA probe. 2.Gambar 7. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) untuk analisis ekspresi gen secara keseluruhan. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) untuk membandingkan perbedaan dengan DNA homolog dari hasil potongan fragmen enzim restriksi. 4. 2. DNA/RNA sequencing untuk mengetahui urutan basa nukleotida DNA/RNA Pada metode analisis kuantitatif asam nukleat terdapat 4 metode yang dapat digunakan. yaitu : 1. dan 4. 3. Summary Setelah semua pembahasan dijabarkan satu-persatu dapat disimpulkan bahwa Secara garis besar terdapat 6 metode analisis kualitatif asam nukleat. Langkah kerja SAGE C. dan 6. . Staining atau pewarnaan untuk meningkatan hasil visualisasi DNA/RNA. Blotting untuk mengetahui urutan basa nukleotida dengan transfer DNA/RNA.

thermofisher. 5th ed”.ro/revista/1/Paper1pp.pdf  http://www.pdf  http://www.bio-rad.indiana.pdf  http://www.ncbi..com/id/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleicacid-gel-electrophoresis/southern-blotting.id/filenya/Handout%20Kuliah/Analisis%20Senyawa %20Aktif/Elektroforesis. Johnson.cs.ugal.com/en-us/applications-technologies/introduction-pcr-analysis  https://www. J. Raff. NY  http://web.edu/~predrag/classes/2004falli400/lecture_notes_4.html  http://www.. Walter. Lewis.pdf  http://www. Taylor & Francis Group.fa.uvm.html  http://download.itb. Roberts.ac. B..ac.unair.gov/pubmed/11251221 .thermofisher.id/admin/file/f_35969_PCR.com/order/catalog/product/H1399  https://www. “Molecular Biology of the Cell.edu/~cgep/Education/RFLP.DAFTAR PUSTAKA  Alberts. K.nih. A. (2008).gov/10000533/dna-microarray-technology/  http://www..nlm. Garland Science.genome.bioaliment. P. M.