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PROGRAMA DE ENZIMOLOGA

Asignatura de la Licenciatura de Bioqumica


Materia troncal
Crdito: 6 Totales (4 tericos, 2 prcticos)
Profesor: Juan Parrado
parrado@us.es

OBJETIVOS
Objetivos de contenidos:

Comprender el concepto de enzima y conocer sus caractersticas generales.

Aprender las tcnicas utilizadas en el aislamiento, purificacin y caracterizacin de las enzimas.

Entender cmo las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones.

Comprender los mecanismos de accin de algunas enzimas y saber cmo se puede determinar
experimentalmente el mecanismo de accin de una enzima.

Comprender los mecanismos de regulacin enzimtica, sobre todo mediante unin reversible de
ligandos y los conceptos de cooperatividad y alosterismo

Conocer las posibilidades tcnicas de las enzimas y sus aplicaciones de inters biomdico e
industrial.

Conocer en profundidad los aspectos cinticos y los mecanismos que subyacen a su actividad.

Objetivos de competencias y habilidades que el alumno debe desarrollar:

Saber disear, ejecutar e interpretar correctamente un experimento de cintica enzimtica,


determinar los parmetros cinticos y conocer los distintos tipos de representaciones sabiendo
qu informacin que se puede obtener de cada una de ellas.

Conocer cmo se puede determinar experimentalmente el mecanismo de accin de una enzima.

Aprender a evaluar crticamente trabajo de investigacin relacionado con el uso y/o


caracterizacin de enzimas.

Aprender a buscar en bases de datos informacin acerca de las enzimas (composicin,


secuencia, punto isoelctrico, ligandos, reacciones que catalizan).

Conocer la existencia de programas informticos y de sus usos, y las limitaciones en el


tratamiento matemtico de los experimentos con enzimas.

Aprender a disear un experimento de purificacin de enzimas a partir de distintos organismos


o, en su caso, a interpretar crticamente uno publicado en la bibliografa.

Familiarizarse con el trabajo en el laboratorio, la instrumentacin y los mtodos experimentales


ms utilizados en la investigacin con enzimas, incluyendo la seguridad, la eliminacin de
residuos qumicos y biolgicos y el uso del cuaderno de laboratorio.

Estimular la capacidad de realizar presentaciones orales ante un auditorio.

EVALUACIN

Para poder ser evaluado de esta asignatura es imprescindible liberar los crditos prcticos para lo
que se juzga:
a) la asistencia a prcticas
b) Participacin activa en las prcticas
c) Cuaderno de laboratorio.
En la nota final el 80% corresponde al examen final y el 20% restante a los crditos prcticos. El
examen final consta de un test de unas 40 preguntas y de 2 cuestiones a desarrollar con apartados. El
examen incluye el programa terico y los problemas de la asignatura. Durante el curso pueden
conseguirse puntos adicionales en la calificacin final:
Entregando un trabajo y exponindolo en pblico sobre algn aspecto del temario de la asignatura que
se considere
Exponiendo y resolviendo los problemas de los diferentes temas de la asignatura

PROGRAMA DE ENZIMOLOGA

INTRODUCCIN
Tema 1. Introduccin a la enzimologa. Breve historia de la Enzimologa. Descripcin general
de las enzimas. Enzimas monomricas y enzimas oligomricas. Enzimas solubles y enzimas
ligadas a membranas. Clasificacin de enzimas. Isoenzimas. Enzimas no convencionales,
Ribozimas, Anticuerpos catalticos (Abismas), Synzimas.

ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LAS ENZIMAS


Tema 2. Purificacin
de enzimas .Introduccin. Reglas bsicas para la seleccin de un
P
proceso de purificacin. Actividad total y especfica. Mtodos de homogenizacin. Mtodos de
separacin. Tabla de purificacin. Evaluacin de la purificacin.
Tema 3.
3 Anlisis estructural de enzimas. Determinacin de la Masa molecular, composicin
aminoacdica y estructura primaria. Determinacin de la estructura secundaria y terciaria.
Determinacin de la estructura cuaternaria. Plegamiento/desplegamiento de estructuras.
Motivos y dominios estructurales.
Tema 4. Coenzimas. Caractersticas generales y clasificacin. Cofactores metlicos. Vitaminas
como Cofactores. a) Procesos redox, b). Transferencia de grupos, c. Funcin mixta.
Tema 5. Catlisis enzimtica. Introduccin. Conceptos termodinmicos. Teora del Estado de
transicin. Perfil energtico de una reaccin enzimtica. Centro activos de las enzimas
Tema 6. Mecanismo de accin enzimtica 1. Efectos energticos, Efectos entrpicos,
Efectos de orientacin y proximidad, Efecto del anclaje de los substratos sobre la enzima
.
Tema 7. Mecanismo de accin enzimtica. Catlisis cido-base. Catlisis covalente. Catlisis
por iones metlicos.
Tema 8. Aproximaciones experimentales para la determinacin del mecanismo de
accin. Estudios cinticos. Deteccin de intermediarios, modificacin qumica de aminocidos,
mutagnesis dirigida.
Tema 9. Mecanismos de accin de enzimas seleccionadas. Quimiotripsina, Triosafosfato
isomerasa, etc.

CINTICA ENZIMTICA
Tema 10. Cintica qumica. Velocidad de reaccin. Molecularidad y Orden de reaccin;
Ecuaciones cinticas. Reacciones reversibles. Determinacin de la constante de velocidad de
primer orden.
Tema 11. Efecto de la temperatura sobre las velocidades de reaccin. Teora de las
velocidades absolutas de reaccin. Equivalencia entre la aproximacin experimental de
Arrhenius y la teora de las velocidades absolutas de reaccin de Eyring.
Tema 12. Introduccin a la cintica enzimtica. Introduccin del concepto de complejo
enzima-sustrato Cintica enzimtica de reacciones monosustrato. Aproximacin del equilibrio
rpido: Ecuacin de Henri-Michaelis-Menten. Aproximacin del estado estacionario:
Tratamiento de Briggs-Haldane.Ecuacin de Michaelis-Menten. Significado de los parmetros
cinticos: Km, Vmax y kcat. Poder cataltico de una enzima. Medida de la eficiencia y la
especificidad de una enzima: kcat/Km .

Tema 13. Obtencin y anlisis de datos cinticos.


Integracin de la ecuacin de Michaelis-Menten.. Representacin grficas de la ecuacin de
Michaelis-Menten: v frente a [S], Doble reciprocos (1/v 1/[S]), Representacin de Hanes ([S]/v
[S] ) Representacin de Eadie-Hofstee (v [S]/v), Representacin directa o representacin
de Eisental-Cornish-Bowden o representacin de Macarulla
Tema 14. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten . Ecuacin de velocidad
reversible, Relacin de Haldane
Tema 15. Las enzimas en los seres vivos. Velocidad total. Resolucin de la ecuacin de
velocidad en el estado estacionario. Mtodo de King y Altman, Relaciones de Haldane

Tema 17. Inhibicin enzimtica I. Introduccin. Inhibicin reversible. Inhibicin competitiva


(inhibicin especfica). Inhibicin no-competitiva. Inhibicin incompetitiva o acompetitiva.
Representacin de Dixon. Inhibicin por sustrato
Tema 17. Inhibicin enzimtica II. Inhibicin pseudoirreversibles
Inhibidores irreversibles o venenos catalticos: Anlisis de la velocidad de inactivacin
enzimtica. Tipos de mecanismos de inhibicin irreversible
Tema 18. Reacciones multisustrato. Introduccin. Nomenclatura.Reaccin enzimticas con
2 sustratos y 2 productos. Resolucin de la ecuacin de velocidad para un sistema de dos
sustratos con formacin de un complejo ternario al azar. Resolucin de la ecuacin de
velocidad para reacciones multisustrato mediante el mtodo de King & Altman: Mecanismo BiBi ordenado, Mecanismo Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong.
Tema 19. Efecto de la temperatura y el pH. Dependencia de la temperatura.. Efecto del pH
sobre la actividad enzimtica. Deduccin de los pKa de los aminocidos del centro activo.
Efecto del pH sobre la ionizacin del substrato.

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA


Tema 20. Estrategias de control de actividad enzimtica I . Regulacin en la cantidad de
enzima.
Regulacin por modificaciones covalentes: Modificaciones covalentes irreversibles
Modificaciones covalentes reversibles
Tema 21. Estrategias de control de actividad enzimtica II. Regulacin por Cambios
Conformacionales. Interaccin protena-ligando.Funcin de Scatchard, Ecuacin de Hill.
Modelo concertado de Monod, Wyman y Changeux (MWC), Modelo secuencial (KNF).

APLICACIONES DE LA ENZIMOLOGA
Tema 22. Aspectos clnicos de la enzimologa
1. Introduccin
4. Determinacin de actividades enzimticas en el diagnostico clnico
5. Terapia enzimtica
6. Inhibidores enzimticos
ENZIMOLOGIA INDUSTRIAL: Estructura, funcin y aplicaciones de enzimas industriales
(SEMINARIOS).

PRCTICAS ENZIMOLOGA 2006/07


1. Utilizacin de herramientas informticas.
Programa Proteins Estudios de procesos de purificacin de protenas.
Programa Enzpack
Determinacin de parmetros cinticos Km y Vmax
Estudios de inhibicin: determinacin de la Ki y tipo de inhibicin
2.

Estudio cintico de la Succinato deshidrogenasa.

Aislamiento y purificacin de mitocondrias


Medida de parmetros cinticos
Estudios de inhibicin.
3. Purificacin de la lisozima mediante cromatografa de intercambio inico
Medida y evaluacin de la purificacin mediante SDS-Page
Estudios de la estabilidad de la estructura terciaria

BIBLIOGRAFA BSICA RECOMENDADA

Nez de Castro I (2001). Enzimologa. Editorial Pirmide, Madrid.


Tratamiento formal de la cintica qumica y enzimtica. Fundamentos y aplicaciones del
anlisis enzimtico.
Price NC and Stevens L (1999) Fundamentals of Enzymology: The cell and molecular
biology of catalytic proteins. Oxford University Press.
Enzimologa bsica y acercamiento a sistemas biolgicos.
de Arriaga M D, Soler J, Busto F y Cadenas E (1998) Manual de ejercicios de cintica
enzimtica. Secretariado de Publicaciones, Universidad de Len. Len.
Coleccin de problemas sobre cintica enzimtica.
Segel, IH (1982) Clculos de Bioqumica. Ed. Acribia. Zaragoza.
Aunque es un texto general, se trata de un libro muy pedaggico con mltiples
problemas de Bioqumica y que contiene una explicacin terica a cada tema. Como
indica su nombre est muy enfocado al tratamiento cuantitativo de la Bioqumica. El
captulo dedicado a las enzimas est centrado sobre todo en la cintica con abundantes
representaciones grficas.
Mathews CK y Van Holde KE (1999) Bioqumica (2 edicin). MacGraw-HillInteramericana, Madrid.
Introduccin a las tcnicas utilizadas en el estado preestacionario
cap. 11: Herramientas de la Bioqumica 11a: "Cmo medir las velocidades de las
reacciones catalizadas por enzimas".
Voet D y Voet JG (1992) Bioqumica. Ediciones Omega, Barcelona.
Nociones bsicas de cintica monosustrato.
Introduccin a la inhibicin enzimtica
cap. 13: Velocidad de las reacciones enzimticas
Explica varias tcnicas utilizadas en la purificacin de enzimas. Buenos grficos.
Cap. 5: Tcnicas de purificacin de las protenas
Stryer L, Berg JM y Tymoczko JL (2003) Bioqumica, Editorial Revert, Barcelona.
Estudio del mecanismo de accin de enzimas seleccionadas: proteasas, anhidrasa
carbnica, enzimas de restriccin y nuclesido monofosfato quinasas.
cap. 9: Estrategias catalticas (p. 227-260).
Godfrey T y West S, Eds. (1996) Industrial Enzymology. (2nd edition) Stockton Press,
New York.
Texto de referencia acerca del uso industrial de las enzimas. Suministra informacin
acerca de aplicaciones agroalimentarias, qumicas, farmacuticas e industrias
relacionadas con el media ambiente. Tambin se discuta acerca de la legislacin y
regulacin del uso comercial de las enzimas

ENLACES DE INTERS
Terminologa y nomenclatura

Terminologa Qumica y Bioqumica. Recomendaciones de la IUPAC/UIBBM sobre


terminologa Qumica y Bioqumica
(Department of Chemistry, Queen Mary and Westfield College, London).

Simbologa y nomenclatura de cintica enzimtica. Normas de la IUPAC/UIBBM sobre


simbologa y nomenclatura de cintica enzimtica.
(Department of Chemistry, Queen Mary and Westfield College, London).

Nomenclatura de enzimas.Normas de la IUPAC/IUBBM sobre nomenclatura de enzimas


Permite bsquedas de enzimas concretas
(Department of Chemistry, Queen Mary and Westfield College, London).

ExPASy: Nomenclatura de enzimas. Busca una enzima y devuelve su clasificacin


(Expert Protein Analysis System (ExPASy) Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of
Bioinformatics)

Glosario de Bioqumica y Biologa Molecular. Definiciones concisas de trminos y


tcnicas utilizados en Bioqumica y Biologa Molecular. Permite bsquedas
(David M. Glick. Glossary of Biochemistry and Molecular Biology. Portland Press, London).

Bases de datos sobre enzimas


ExPASy: Expert Protein Analysis System . Mltiples herramientas para bsqueda de
secuencias, estructuras tridimensionales y predicciones sobre protenas.
(Expert Protein Analysis System (ExPASy) Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of
Bioinformatics)

ExPASy: SWISS-PROT. Base de datos de secuencias de protenas (SWISS-PROT) con


posibilidad de realizar bsquedas. Informacin detallada acerca de la secuencia,
mutaciones, nmero de clasificacin de enzima (E.C.) requerimiento de cofactores,
modificaciones postraduccionales, bibliografa y mucho ms. Enlaces directos con mltiples
herramientas que permiten, por ejemplo, estimar la masa molecular y el punto isoelctrico o
realizar predicciones estructurales.
(ExPASy Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of Bioinformatics)

ExPASy: "Boehringer Mannheim Biochemical Pathways" Permite localizar una enzima


en un mapa metablico detallado e interactivo del metabolismo celular (Boehringer
Mannheim Biochemical Pathways).
(ExPASy Molecular Biology Server, from the Swiss Institute of Bioinformatics)

BRENDA La mayor base sobre datos funcionales de las enzimas (Km, pH ptimo,
dependencia de cofactores, inhibidores, mtodos de almacenamiento y purificacin,
referencias bibliogrficas...) Incluye datos de aproximadamente 3500 enzimas. Es gratuita
pero hay que registrarse.
(Institute of Biochemistry, Cologne University, Germany)

National Institutes of Health (NIH): NCBI Mltiples bases de datos acerca de secuencias
de protenas, cidos nucleicos, mapas genticos y fsicos de distintos organismos y mltiples
herramientas de prediccin y visualizacin de estructuras. Pueden buscarse artculos
originales en MEDLINE a travs de PubMed.
(National Center for Biotechnology Information (NCBI). National Library of Medicine. National Institutes
of Health (NIH)

Protein Data Bank (PDB). Protein Data Bank (PDB): obtencin, tratamiento y visualizacin de
datos estructurales de macromolculas (3D) obtenidos principalmente mediante cristalografa
de rayos X y RMN.
(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics: RCSB)

Enzyme Structures Database: E.C.- PDB. Base de datos con la estructura de todas las
enzimas conocidas ordenadas por clase (E.C.). Cada entrada incluye la secuencia de la
enzima, mapa de su estructura secundaria, nmero de acceso a la estructura tridimensional
(PDB), dibujos, informacin sobre el sitio activo y alineamientos con secuencias de protenas
relacionadas.
(Biomolecular Structure and Modelling Group, University College, London)

LIGAND: todas las reacciones catalizadas por enzimas Una gran base de datos sobre
todas las reacciones catalizadas por enzimas, ofreciendo detallada informacin sobre
sustratos, productos y las propias enzimas. Incluye adems rutas bioqumicas, secuencias de
genes y enfermedades genticas ligadas a vas especficas o enzimas.
(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG), Kyoto University, Japan)