You are on page 1of 20

BUKU PANDUAN PRAKTIK

GENETIKA DAN PEMULIAAN BIOTA AIR

X

X
Chitralada ♀

Aureus ♂
ZZ

XX
Z

Aureus ♀

Chitralada ♂
XY

WZ
X, Y

X
XZ

W, Z

WX, XZ, WY, YZ

DISUSUN OLEH
ANDI ALIAH HIDAYANI

LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN BIOTA
AIR
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN
JURUSAN PERIKANAN
FAKULTAS ILMU KELAUTAN DAN PERIKANAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
2016
PERCOBAAN 1

MEMBUAT MODEL DNA

A. Pendahuluan
DNA adalah molekul kompleks yang terdapat pada semua organisme. Untuk
memahami tentang struktur, fungsi dan replikasinya dapat dilakukan dengan cara
pembuatan model DNA. DNA mengandung informasi genetic yang dapat diwariskan
pada keturunan berikutnya. Berbentuk double heliks dengan struktur berbentuk
benang panjang yang tersusun atas gula dan pospat serta basa nitrogen (adenine,
timin, guanine dan sitosin). Satu unit dasar yang menyusun molekul DNA disebut
Nukleotida. Sebuah nukleotida tersusun atas pospat, gula deoksi ribose dan basa
nitrogen (A, T, S, atau G). Kode-kode yang terdapat pada DNA digunakan untuk
membuat protein dari asam amino di dalam sitoplasma. Proses pembentukan protein
diawali dengan pembentukkan RNAd yang membuat salinan DNA di dalam inti,
selanjutnya protein dibangun di ribosom.
B. Tujuan
Tujuan dari percobaan ini adalah mengenalkan bagaimana struktur DNA dan
menentukan jenis asam amino yang dibentuk berdasarkan kode-kode dari basa
nitrogen.
C. Alat dan Bahan
Unit-unit dasar DNA seperti gambar dibawah ini
1.
Pewarna
(merah,
hijau,
kuning,

biru,

hitam

dan

ungu)

2. Gunting
3. Lem
4. Pensil
5. Kawat

1

Pasangkan benang sebelah kiri dengan benang sebelah kanan sesuai dengan urutan pasangan basa nitrogennya 7. Prosedur B : menentukan asam amino 1. 3. Tabel 3 . Gunakan 12 nukleotida untuk membuat benang sebelah kiri dan 12 nukleotida lainnya untuk benang sebelah kanan 6. II. 1 untaian benang RNAd akan menghasilkan 4 kode asam amino. Cara Kerja I. timin (kuning). gunakan tali /senang untuk menghubungkan masing-masing basa nitrogen. guanine (hijau). Berilah warna untuk basa nitrogen. Bentuk struktur nukleotida dengan menempelkan pospat.kodon RNAd 2 . Aturan untuk pasangan basa DNA A berpasangan dengan T S berpasangan dengan G 5. Buat 23 buah nukleotida lainnya sehingga seluruh nukleotida terbentuk 24 buah nukleotida. Potong unit-unit pola di atas. pospat dan gula. Tali /senar D. lihat table 1 untuk jumlah yang dibutuhkan 2. gunakan kawat agar DNA tersebut dapat digantung. adenine (biru). dan buat pasangan basa nitrogen untuk RNAd 2. cocokan kode tersebut pada table 3 dibawah. Ambil untaian benang sebelah kiri DNA. Terbentuk DNA yang berbentuk seperti tangga. gula dan satu basa nitrogen menjadi satu rangkaian (lihat diagram 1) 4. pospat (hitam) dan deoksi ribose (ungu).6. sitosin (merah). Gunakan urutan 3 basa nitrogen dari RNAd menjadi 1 kode asam amino yang dikenal dengan istilah kodon 3. Prosedur A : membangun DNA 1.

GCG Leusin Arginin CGU. GAC Fenilalanin Sistein UGU. UAC UAU. AUA Valin GUU. GGC. dan asam amino DNA RNA d Asam amino 3 . GCA. AUG. UUG. UUC CCU. UAA Start Trpytophan Kodon Tirosin UGG UAU. AUC. ACC. CGG. CGC. ACG Glycine GGU.Asam Amino Kodon Asam amino Alanin GCU. kodon RNAd. UGC Prolin Glutamin CAA. AAC Metionin Asam aspartat GAU. CUG AAA. ACA. AAG AUG UUU. CAG Serin Asam glutamat GAA. GUC. CUA. CAC Isoleusin AUU. GGA. UAC Tabel 4 Basa DNA. CCC. UGA. UCC.AGC ACU. CGA. GCC. CUU. GUG Stop UAG. UCG. AGU. CUC. CCA. AGA. UCA. AGG Lisin Asparagin AAU. GGG Histidin CAU. CCG UCU. GAG Treonin UUA.

Preparasi kromosom teknik jaringan padat lebih murah dan tidak membutuhkan waktu yang terlalu lama dibandingkan dengan teknik kultur darah. mengetahui serta menganalisa jumlah dan bentuk kromosom untuk menentukan tingkat ploidi dan karakteristik spesies ikan yang diamati. Pengamatan ukuran serta jumlah kromosom dapat dilakukan dengan pembuatan preparat kromosom. B. Pendahuluan Analisa kromosom dapat digunakan untuk menentukan tingkat ploidi (diploid. Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa mampu melakukan preparasi kromosom jaringan padat dan dapat mengamati. Bahan-bahan :  Kolkisin (C22H25NO6)  Etanol atau Metanol (C2H5OH)  Kalium Klorida (KCl)  Asam Asetat Glacial (CH3COOH)  Giemsa 4 . Pembuatan preparat kromosom dapat dilakukan dengan dua cara yaitu dengan teknik jaringan padat dan teknik kultur darah. tiploid dan sebagainya) dan karakteristik suatu spesies yang dikenal dengan teknik kariotipe. Untuk itu sangat diperlukan ketrampilan khusus dalam pembuatan preparat kromosom.PERCOBAAN 2 PREPARASI KROMOSOM (KARIOTIPE) A. Bahan dan Alat 1. C.

Setelah itu ikan dibunuh.007 % w/v : dibuat dengan melarutkan 70 mg kolkisin dalam 1 liter air.075 M) selama 60 menit pada suhu ruang. Larutan kolkisin 0. Larutan Carnoy diganti dengan yang baru setiap 30 menit. b. Akuades Alat-alat : Timbangan Mikroskop Binokuler Hot Plate Kertas Tissue Gelas objek Alat bedah (pinset dan pisau bedah) Pipet tetes Gelas objek cekung Cara Kerja 1. Pembuatan Reagen a. Larutan hipotonik 0. Larutan Carnoy : dibuat dengan mencampurkan Asam Asetat Glacial dan Etanol atau Metanol dengan perbandingan volume 1 : 3. Larutan hipotonik diganti setiap 30 menit selama waktu perendaman dengan volume 20 kali volume jaringan. 2.6 gram KCl dalam 1 liter akuades. c. e. c. Asam Asetat 50 % : dibuat dengan mencampurkan Asam Asetat Glacial dan akuades dengan perbandingan volume 1 : 1. Kemudian dilanjutkan dengan pembuatan preparat (bila diperlukan jaringan yang telah difiksasi dapat disimpan dalam refrigerator selama 2-3 minggu). f. Sirip ekor dan insang ikan dipotong kecil-kecil. Larutan alkohol 70 % : dibuat dengan mencampurkan Etanol Absolut dan akuades dengan perbandingan 7 : 3 (1 liter alkohol 70 % = 700 ml etanol absolut + 300 ml akuades). Perendaman dengan Kolkisin dan Pengawetan Jaringan a. Selama perendaman. Larutan Giemsa 20 % : dibuat dengan mencampurkan Giemsa dan akuades dengan perbandingan 2 : 8 (100 ml larutan Giemsa 20 % = 20 ml giemsa + 80 ml akuades).075 M (1 liter) : dibuat dengan melarutkan 5. 2. Jaringan difiksasi dengan larutan Carnoy selama 60 menit.07 w/v selama 6-9 jam. 5 . b.         D. Ikan direndam dalam larutan Kolkisin 0. Potongan jaringan tersebut direndam dalam larutan hipotonik (KCl 0. ikan dibiarkan berenang dalam wadah dengan aerasi yang baik. d. d.

Gelas objek yang akan digunakan sebagai preparat sebelumnya direndam di dalam Alkohol 70 % minimal selama 2 jam. Kemudian jaringan tersebut diletakkan di atas gelas objek cekung dan ditmbahkan 3-4 tetes asam asetat 50 %. b. Preparat yang diperoleh kemudian difoto lalu digunting satu persatu. Pewarnaan dilakukan selama 20-30 menit pada suhu kamar.3. Pewarnaan Preparat a. 4. Preparat dibilas dengan menggunakan akuades lalu dibiarkan kering udara. d. atau melalui teknik perendaman. c. Selanjutnya kromosom tersebut diukur dan disusun mulai dari ukuran kromosom yang paling besar hingga terkecil. c. 5. Preparat yang telah berisi lingkaran (ring) diwarnai dengan larutan Giemsa 20 % dengan cara memberikan larutan sebanyak 3-5 tetes lalu disebarkan hingga menutupi ring dengan menggunakan tusuk gigi. dan dihisap kembali dengan cepat setelah terbentuk lingkaran (ring) dengan diameter 1-1. b.5 cm. Suspensi sel yang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet tetes lalu diteteskan di atas gelas objek yang ditempatkan di atas hot plate dengan suhu 45-50 ºC. Jaringan yang telah difiksasi diambil dengan menggunakan pinset dan disentuhkan pada kertas tissue untuk menghilangkan larutan fiksatif. Pembuatan Preparat a. Pada setiap gelas objek idealnya dapat dibuat menjadi 3 lingkaran. Setelah itu jaringan digerakgerakkan dengan menggunakan pisau bedah secara hati-hati hingga terbentuk suspensi sel (larutan menjadi keruh). Preparat diamati di bawah mikroskop. 6 .

PERCOBAAN 3 SIMULASI HUKUM HARDY-WEINBERG A. bentuk tubuh. Faktor lingkungan mempengaruhi keragaman ikan dalam kemampuannya untuk beradaptasi. Berbagai macam spesies ikan yang memiliki keragaman yang berbeda-beda yang dipengaruhi oleh 2 faktor utama yaitu faktor lingkungan dan faktor genetik. C. Pendahuluan Salah satu cabang ilmu genetika yang sangat berkembang saat ini adalah Genetika Populasi. ukuran. Bahan dan Alat 7 . Genetik populasi berhubungan dengan frekuensi dan interaksi alel dalam suatu populasi mendel (medium populasi). kecepatan pertumbuhan dan lain sebagainya. B. 3 Mengetahui pewarisan sifat yang terlihat (fenotip) dari parental ke keturunannya dengan merujuk pada hukum mendelian. sedangkan faktor genetik berpengaruh pada sifat-sifat ikan yaitu menyangkut warna. 2 Mempelajari sifat dari pasangan alel yang memungkinkan untuk bersifat dominan dan resesif dalam populasi yang diturunkan oleh parental. Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah mahasiswa : 1 Mempelajari kesetimbangan Hardy-Weinberg dengan menggunakan frekuensi alel dominan dan alel resesif. berat badan. Genetika Populasi merupakan ilmu yang mempelajari atau melukiskan konsekuensi pewarisan mendel dari suatu populasi dalam bahasa (terminologi) matematik. Adanya pengaruh faktor genetik pada keragaman ikan menyebabkan perlunya mempelajari tentang ilmu genetika atau pewarisan sifat. yaitu suatu kelompok interbreeding dari organisme yang masing-masing memiliki gen pool. 4 Mengetahui proporsi pewarisan sifat fenotip keturunan dari parental dengan fenotip yang berbeda khususnya pada kasus fenotip ikan guppy.

30. Tabel 1. aa) pada tabel 1. aa) dan frekuensi alel untuk alel dominan dan resesif. 23. 2. Tanpa melihat isi kotak. 25. Nilai yang didapat merupakan frekuensi hasil pengamatan (observed) di dalam populasi baru dan jumlahnya harus sama dengan satu. 2 Kembalikan kedua manik-manik yang telah terambil (langkah 1) ke dalam kotak dan kocok isi kotak tersebut untuk mengembalikan unggul gen (gene pool). 41. 5. 20. 29. 7. 6. 17. 39. Aa. 40. 28. 19. 50. Cara Kerja 1 Kocok manik-manik yang ada dalam kotak. Tabel 2. 27. Bahan dan Alat : Seratus buah manik-manik yang terdiri atas dua warna dengan nisbah (perbandingan) yang telah ditentukan dalam kotak tertutup. 36. Dengan mengembalikan manik-manik ke dalam kotak setiap waktu pengambilan berarti besar gen akan tetap dan peluang seleksi alel tetapsama dengan frekuensinya. 15. 24. 4 Catat jumlah individu diploid untuk setiap genotif pada tabel 2. Catat genotif individu yang didapat (AA. 13. 34. 32. 10. 44. 3. 31. 26. 14. 37. 8. 43. 38. 18. ambil secara acak dua buah manik-manik. 12. 3 Ulangi langkah kedua sampai anda mendapatkan 50 (lima puluh) individu yang membentuk generasi baru di dalam populasi. 21. 35. 2. 42. 46. 16. Frekuensi Genotip dan Alel Hasil Pengamatan dalam Populasi Baru 8 . 4. 9. 49. 11. Hitung frekuensi untuk ketiga macam genitip (AA. Data Pasangan Gen (Alel) Populasi Baru 1. 33. Keduannya menggambarkan datu individu yang diploid di dalam generasi berikutnya. 47. 22. Aa.a. 45. 48. Simulasi Hukum Hardy – Weinberg 1.

Selain itu. Hasil frekuensi genotip dengan rumus kesetimbangan Hardy – Weinberg : p2 + 2pq + q2 = 1. Jumlah individu harapan untuk setiap genotip dipoeroleh dengan mengalihkan 50 (total populasi) dengan frekuensi harapan (pada table 3). Tabel 3. anda dapat Chi-square digunakan untuk menguji suatu nilai proporsi dari 2 kategori. sebaiknya menggunakan Binomial test. harapan. chi-square (pada table 4). Chi-square test akan tepat digunakan apabila banyaknya observasi lebih besar dari 25. Frekuensi Harapan Genotip dan Alel pada Populasi Baru Nilai Pengamatan (Jumlah Genotip/Individu) Genotip Frekuensi Alel Harapan (Expected) Observed AA Aa Aa Jumlah 6 Untuk membandingkan hasil pengamatan dengan menggunakan uji statistik.AA Aa Genotip Aa Jumlah Presentase Individu Gen A Gen a Total Presentase 5 Untuk menentukan frekuensi harapan (expected). dapat digunakan Chi-square test. tipe data yang digunakan pada Chi-square Test adalah nominal. 9 . Apabila kurang dari 25 observasi. gunakan frekuensi alel yang telah ditentukan di awal praktikum (perhatikan bahwa frekuensi G = p dan frekuens g = q).

Uji Chi-Square untuk Membandingkan Hasil Pengamatan dan Harapan Genotip dan Alel pada Populasi Baru Genotip Nilai o – e AA Aa Aa Jumlah (X2 Hitung) Nilai (o – e)2 Nilai e Hasil (3 : 4) Keterangan : X2 tabel (db = 1. Data Fenotip dan Jenis Kelamin Guppy Ind.05) = 3. Tabel 5. 2. a = 0. 3. 2 Cara Kerja 1 Setiap kelompok mendapatkan 5 ekor ikan guppy yang memiliki fenotip berupa pigmentasi pada tubuh dan bentuk ekor yang berbeda.841 b. Fenotip Kode Genetik Jenis Kelamin 1. 2) gunakan untuk melakukan simulasi lima perkawinan dari induk jantan dan betina yang berbeda (setiap anggota).Tabel 4. 10 . 3 Data jenis kelamin yang telah ditentukan (no. Simulasi Hukum Mendelian I – II dan Genetika Kuantitatif 1 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam kegiatan ini adalah 10 ekor ikan guppy dengan berbagai fenotip (pigmentasi dan bentuk ekor). 4 Kerjakan pada lembar tugas yang telah disediakan dan hasil perkawinan tersebut masukkan ke dalam Tabel 6. 2 Catatlah fenotip tiap ikan dan berikan kode genetic untuk setiap jenis fenotip yang ditemukan serta tentukan jenis kelaminnya (Tabel 5) dengan membandingkan fenotip ikan yang diamati dengan daftar fenotip guppy yang telah disediakan.

2005). Misalnya saja kulit hitam pada orang ada yang hitam sekali. dalam kenyataannya kelas fenotip tadi tidak dapat dibedakan semudah itu. Di lain pihak tertentu ada kelompok antara yang sukar dikategorikan. hitam biasa. yaitu sifat-sifat yang mudah digolongkan ke dalam kategori fenotip yang jelas. Akan tetapi bila diperhatikan dengan baik. Pendahuluan Sifat-sifat Mendel klasik yang dijumpai dalam bab-bab terdahulu bersifat kualitatif. Sebabnya karena seringkali masih dapat diketahui adanya beberapa variasi di dalam suatu kelas fenotip. Kelompok ini mewakili zona transisi diantara kedua sistem pewarisan karakter dan termasuk bentuk antara yang diwariskan karena pengaruh interaksi lingkungan yang memungkinkan adanya sejumlah genotip yang diekspresikan pada bentuk fenotipnya (Agus. Fenotip-fenotip yang jelas ini berada di bawah kendali genetik dari hanya satu atau beberapa gen dengan sedikit atau tanpa modifikasi-modifikasi lingkungan yang mengaburkan pengaruh-pengaruh gennya (Stansfield. Rosana dan Sjafaraenan. 2013). 11 . Biasanya kita beranggapan bahwa suatu kelas fenotip itu selalu mudah dibedakan dari kelas fenotip yang lain. Tahapan Perhitungan Hasil Perkawinan I. Jantan : XYIrCi Betina : XXFl X XFl X XX XXFl Y XXEl XFlYIrCi PERCOBAAN 4 KASUS GENETIKA KUALITATIF PADA IKAN A. sawo matang (Suryo.Tabel 6. 1991). Pewarisan karakter kualitatif mudah dibedakan karena masing-masing mempunyai populasi yang jauh berbeda.

c. Persentase fenotip dominan dan resesif yang muncul adalah? 2. Menentukan hasil rasio fenotip dan genotip. C. Ikan mas berpigmen normal dikawinkan dengan ikan mas bergaris kuning pada spinal dorsal. Berapa persen didapatkan spina normal blondi? 3. : …. f. 6. Ikan guppy spina normal abu-abu dikawinkan dengan ikan guppy spina bengkok blondi. d. Menghitung hasil persentase persilangan dengan rumus. Menentukan hasil persilangan berupa F1. Bahan . Ada berapa perbedaan fenotip yang muncul? 7. B. Ikan rainbow trout golden dipijahkan dengan ikan rainbow trout palomino. Cara Kerja Adapun metode yang dilakukan dalam praktikum ini yaitu dengan menjawab 7 soal yang diberikan sebagai data dengan mengacu pada tabel fenotip yang dipengaruhi oleh gen tunggal otosom dengan aksidominan lengkap dan tabel genetika kualitatif dari buku Dasar-dasar Genetika Ikan dan Pengembangbiakan. Menentukan fenotipe dan gamet pada masing-masing individu. Stok ikan molly didomestikasi dengan warna MMNn. Tujuan Tujuan Percobaan ini adalah mahasiswa mampu menganalisis beberapa kasus dalam genetika kualitatif dan bagaimana secara genetic hal tersebut terjadi. MmNN. Menentukan hasil persilangan berupa F2. Fenotip yang muncul adalah? D.Menurut Nasir (2001) karakter kualitatif merupakan wujud fenotipe yang saling berbeda tajam antara satu dengan yang lain secara kualitatif dan masingmasing dapat dikelompokkan dalam bentuk kategori. Ikan guppy GgCucu dikawinkan ikan guppy Ggcucu.Soal pemahaman genetika yang berisi: 1.Lengkapi (%) bahwa pigmen golden menjadi galur murni dibandingkan palomino. Ikan cupang (Siamese fighting fish) warna biru gelap dikawainkan dengan warna hijau. Ikan cupang biru mengkilat dikawinkan dengan ikan cupang hijau./16 x 100% 12 . mmNN. Langkah dalam proses mengerjakan soal tersebut yaitu: a. Bagaimana hasil rasio progeni untuk genotip dan fenotipnya. . e. b.Buku bahan ajar: Dasar-dasar Genetika Ikan dan Pengembangbiakan. Menentukan parental dari masing-masing individu. Mana yang merupakan galur murni? 5. Berapa yang menghasilan warna biru logam? 4.

studi taksonomi. baik yang di alam maupun di lingkungan budidaya. interpretasi hasil analisa fenotip tidak pernah mencerminkan genotip yang dimiliki oleh organisme tertentu. lebih sensitif. Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari molekulmolekul lain di dalam suatu jaringan yang dilarutkan. Sedangkan kelemahannya adalah prosedur yang cukup rumit dan mahalnya biaya analisa. Penggunaan marker pada level DNA memiliki beberapa kelebihan yaitu tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan faktor pertumbuhan.PERCOBAAN 5 ANALISIS DNA A. Analisa pada level ini. Dengan kata lain. Prosedur analisa DNA diawali dengan mengekstraksi genom DNA dari sumber sel yang diikuti dengan proses isolasi sekuen DNA tertentu. Karena secara alami. Seperti yang diutarakan oleh Lewin (1994). Pendahuluan Analisis DNA banyak digunakan untuk karakteristik sifat genetik pada level molekuler yang secara langsung mencerminkan sifat genotip (materi genetik) yang dimiliki oleh organisme tertentu. bahwa langkah awal dalam menganalisa DNA adalah memecahkan genom DNA menjadi fragmen-fragmen spesifik yang berukuran lebih kecil. hampir semua jaringan dapat digunakan sebagai sumber material genetik dan dapat digunakan dalam jangka waktu yang relatif lebih lama. DNA adalah suatu molekul primer yang keberadaannya selalu terkait dengan RNA dan 13 . Aplikasi analisis DNA antara lain penentuan marker (penanda) dalam mengukur hubungan kekerabatan antar kelompok ikan dalam populasi. dan diagnosa penyakit. genetika populasi. jauh lebih akurat dibanding dengan analisa fenotip (morfometrik) karena ciri fenotip merupakan hasil interaksi antara genotip dengan lingkungan.

b. Tambahkan campuran/mix Lysis Solution sebanyak 50 l. dengan komposisi :  100 mM Tris HCl (pH 8. Ekstraksi DNA a. c. d. 1973). Metode Ekstraksi DNA Secara Manual Bahan : i. 1. yang terdiri dari :  5 l 10x Isolasi DNA Buffer  2 l Proteinase K  43 l SDW (Aquabidest steril) Diinkubasi pada temperatur 55-60 ºC selama 2 jam atau sampai semua tissue telah mengalami lysis. kemudian diinkubasi lagi pada temperatur 100 ºC selama 5 menit. 10 x Isolasi DNA Buffer. disimpan on ice. Sedangkan dalam menganalisa DNA yang diperlukan adalah DNA dalam bentuk murni (Stine. f. Cara Kerja 1. g. Langkah pertama dalam mengekstraksi DNA umumnya adalah menghancurkan sel dan isolasi asam nukleat.5 ml. Cara Kerja : Tissue/jaringan sampel dimasukkan ke dalam tube 1.0)  200 mM NaCl  200 mM EDTA  1 % SDS ii. Tujuan Tujuan percobaan ini adalah mahasiswa mampu melakukan ekstraksi DNA secara sederhana dan mengamati presipitasi DNA C. sirip. e. Sedangkan kondisi sumber sel meliputi sumber sel segar.protein. Penghancuran Sel (Cell Lysis) 14 . Dalam ekstraksi DNA. D. Proteinase K (20 mg/ml) 2. darah dan sel hasil kultur. Supernatan yang terbentuk merupakan larutan DNA dan siap digunakan untuk proses selanjutnya. otot. sumber sel terfiksasi dan sumber sel beku. Setelah lysis. Sentrifuse dengan kecepatan 15. lalu tambahkan 50 l SDW.000 rpm selama 5 menit. vortex. Dinginkan pada suhu ruang. a. Langkah kedua adalah pemisahan DNA dari bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein. Selanjutnya dilakukan penghancuran inti sel sehingga DNA akan terlepas dan akan menyebabkan viskositas larutan meningkat sehingga molekul DNA terlihat lebih nyata. B. jenis sumber sel yang digunakan ada beberapa macam seperti hati.

0. 2. 8. kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi pelet DNA. 5. lalu dimasukkan ke dalam tabung evendorf (1.000 rpm selama 3 menit hingga terbentuk endapan protein dan larutan yang mengandung DNA. homogenat didinginkan pada suhu ruang. 2.000 rpm selama 1 menit hingga terbentuk pelet DNA di dasar tabung. Pengendapan DNA 1. Kemudian larutan DNA disimpan dalam freezer atau langsung digunakan untuk proses selanjutnya. Semua peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan ekstraksi DNA diautoclave. 6. 2. 3. Kemudian homogenat disentrifuse pada kecepatan 14. d. Larutan supernatan dibuang dan tabung dikeringkan di atas kertas tissue.5 l Proteinase K ditambahkan ke dalam tabung dan diaduk dengan menggunakan pipet. 7. 100-200 l Cell Lysis Solution ditambahkan ke dalam tabung yang diletakkan di atas es lalu jaringan digerus hingga homogen. Pelet DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan menambahkan 20 l akuades steril (SDW) ke dalam tabung. 3. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 15-60 menit. Larutan supernatan yang terbentuk dituangkan dengan hati-hati ke dalam tabung baru yang telah berisi 200 l Larutan Isopropanol 100 %. Kemudian larutan etanol dibuang dengan hati-hati. Tabung berisi suspensi kemudian diinkubasi pada suhu 55 ºC selama 3-24 jam. Pengendapan Protein 1. 0. Tabung disentrifuse pada kecepatan 14. Eliminasi RNA 1. Kemudian tabung tersebut disentrifuse dengan kecepatan 14.5 ml). b. Sampel ikan ditimbang sebanyak 10-20 mg.1. Kemudian 200 l Cell Lysis Solution kembali ditambahkan ke dalam tabung dan dihomogenkan. c. 5. 15 . Setelah inkubasi selesai. Lalu tabung dibolak-balik beberapa kali untuk membilas sisa-sisa DNA yang berada di dinding tabung. lalu tabung dikeringkan diatas kertas tissue dan dibiarkan kering udara selama 15 menit.5-1 l Rnase dimasukkan ke dalam setiap tabung lalu diaduk dengan membolak-balikkan tabung sebanyak 25 kali. 4. 200 l Larutan Etanol 70 % dingin.000 rpm selama 1 menit. 30-40 l Protein Precipitation Solution ke dalam larutan homogenat lalu divortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik. 9. Tabung yang berisi larutan DNA ini kemudian diaduk dengan membolakbalikkan tabung sebanyak 50 kali hingga terlihat untaian pita DNA yang berwarna putih. 4. 2.

Setelah itu larutan asam nukleat yang akan diukur dimasukkan ke dalam kuvet sebanyak 70 l dan kuvet ditempatkan di dalam alat. Kalibrasi dilakukan dengan mengukur absorbansi pelarut (SDW untuk DNA).00 l x jumlah sampel x 1. Kemudian kuvet dimasukkan ke dalam alat. Larutan DNA diencerkan terlebih dahulu 10-20 kali (tergantung pada hasil ekstraksi). kuvet dikeluarkan dan dibilas dengan akuades. dan kuvet dikeluarkan dari tempat penyimpanan lalu dibilas dengan akuades. Kuvet yang akan digunakan. hasil pembacaan akan menunjukkan nilai absorbansi 0.00 l x jumlah sampel x 1.00 l x jumlah sampel x 1. Dilanjutkan dengan pengukuran konsentrasi DNA atau RNA. b. e.1 0. d.2.50 l x jumlah sampel x 1. Pengukuran Konsentrasi DNA dan RNA a. lalu tekan tombol “set ref”. Alat Gene Quant dinyalakan. c.25 l x jumlah sampel x 16 .1 1.1 2. Pembuatan larutan premix yang terdiri dari : Bahan 10 x Buffer Ex Taq DNTP Primer  Forward  Reverse Ex Taq Jumlah 2. Preparasi sampel dapat dilakukan dengan beberapa cara sesuai dengan Taq Polymerase yang digunakan :  Menggunakan ExTaq Polymerase 1. dibilas terlebih dahulu dengan 20 l larutan DNA yang akan diukur. 3. dengan memasukkan 70 l pelarut tersebut ke dalam kuvet. PCR (Polymerase Chain Reaction) a. Setelah tombol “sample” ditekan dan konsentrasi larutan sudah terbaca.1 1.000.

45 detik 90 detik 7 menit Note : Suhu annealing disesuaikan dengan sekuen primer yang digunakan. yang telah berisi SDW (Sterile Distillated Water) sebanyak 17. Larutan premix dibagi ke dalam masing-masing mikrotube sebanyak 6.  Menggunakan Pure Taq Ready-To-Go-PCR Beads Tambahkan pada tube yang berisi PCR Beads masing-masing bahan berisi berikut ini. 4.1. Masukkan masing-masing mikrotube ke dalam mesin PCR yang telah diprogram sebagai berikut : Proses Pengkondisian Awal Siklus PCR : Suhu 94 ºC Lama Waktu 4 menit Denaturasi Annealing Extension Penstabilan 94 ºC 50 ºC 72 ºC 72 ºC 0. Masukkan masing-masing sampel DNA sebanyak 1 l sehingga volume akhir tiap mikrotube adalah 25 l.75 l. Sampel DNA Primer Forward Primer Reverse SDW Total Volume 2 l 2 l 2 l 19 l 25 l b. hingga volume akhir setiap mikrotube adalah 25 l.1 2. Elektroforesis 17 . 3.  Setelah proses PCR mencapai 30 ulangan dan mesin menunjukkan suhu 4 ºC. mesin dimatikan dan hasil PCR disimpan di dalam refrigerator untuk selanjutnya dapat dielektroforesis.25 l.45 detik 0.

Gel dibiarkan membeku. 2.Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose yang kepekatannya disesuaikan dengan sampel yang akan dicek. 3.8-1 % 1% 1. kemudian dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer elektroforesis. Larutan dibiarkan sampai hangat kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang telah dilengkapi sisir/comb sebagai cetakan sumur/well elektroforesis. Bak elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan 250 volt dan kuat arus 80-100 mA. Campuran dimasukkan ke dalam sumur-sumur elektroforesis. 3. maka proses elektroforesis dapat dihentikan. 5. 2. 4. 1. yaitu sebagai berikut : No. Gel diangkat dari bak elektroforesis dan dilepaskan dari cetakan untuk selanjutnya diamati dengan menggunakan ultraviolet transluminator dengan panjang gelombang pendek (280 nm). 18 . ± 3 l volume sampel yang akan di cek dicampur dengan 0. 4. b. 2.5 l loading buffer yang mengandung bahan pemberat DNA dan pewarna (Bromophenol Blue).5 menit atau larutan sampai menjadi bening. Jenis Sampel Hasil ekstraksi DNA Hasil PCR Hasil restriksi Konsentrasi Gel 0. Prosedur Elektroforesis 1.5-2 % a. Cara pembuatan gel agarose 1. 3. Panaskan dalam microwave selama 1. Larutkan serbuk agarose dalam larutan Tris Borate EDTA (TBE) yang mengandung Ethidium Bromide (30 l/1 liter TBE). Setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif mencapai ¾ bagian dari panjang gel.

19 .