E>) TOXICOLOGIA AVANZADA Copyrighted materialToxicologia avanzada Editor: M. Repetto Doctor en Ciencias Quimicas y Medicina Profesor Titular de Universidad, en Toxicologia Director del Departamento Territorial det Instituto Nacional de Toxicologia. Sevilla "Esta obra ha sido publicada con la Ayuda de la Direccién General del Libro, Archivos y Bibliotecas, del Ministerio de Cultura© Manuel Repetto, 1995 Reservados todos los derechos. «No esté permitida la reproduccién total o parcial de este libro, ni su tratamiento informatico, ni la ransmisién de ninguna forma 0 por cualquier medio, ya sea electrénico, mecanico, por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright.» Ediciones Diaz de Santos, S.A. Juan Bravo, 3A. 28006 MADRID Espafia ISBN : 84-7978-201-3 Depésito legal: M. 8.930-1995 Fotocomposici6n: Fer, S.A. Impresién: Edigrafos, S.A Encuadenacién: Novimar, $,L.Contenido Autores sesiiss cain ei N ais Gea MADARA A pee s.ne.pnepnnneserssce PROPRCIO) ec sinsnecrnnameannenmnenmmmaeeneunieciananenenemomne Capitulo 1 Manuel Repetto Metodologia de la investigacion toxicolégica. Concepto de ciencia. La experimentacién cientifica. Método cientifico. Etapas del proceso de investigacién. Estructura de una publicacién cientifica. Guia para la evaluacién critica de un trabajo. Seguimiento de un articulo. Factores de impacto. Bibliografia toxicolégica. Fuentes de informaci6n en toxicologia Capitulo 2 Guillermo Repetto y Manuel Repetto Métodos alternativos: estudios toxicolégicos in vitro. Introducci6n. Clasificacién de los métodos alternativos. Justificacion de los ensayos in vitro. Ventajas e inconvenientes. Validacién y acepta- cién de los métodos in vitro. Componentes de los modelos experimen- tales de toxicidad in vitro. Sustratos biolégicos empleados in vitro. In- dicadores de toxicidad empleados in vitro Capitulo 3 Domingo Martinez, Miguel Lépez-Artiguez y Manuel Repetto Garantia de calidad y buenas practicas de laboratorio. Principios de las buenas practicas de laboratorio. Normativas de ga- rantia de calidad en el andlisis toxicolégico. Acreditacién de laborato- rios. Unidad de garantia de calidad (UGC). Procedimientos normaliza- dos de trabajo (PNT). Elecci6n de un método. Controles de calidad .. VIL 37 61 xiXi CONTENIDO Capitulo 4 Pilar S Los US te genéticos como causa de la variabilidad indi- vidual de |. See tapodcbonoe elites a diferencias genéticas en el metabolismo. Predisposiciones debidas a diferencias genéticas en la sensibilidad del 87 tejido. Glosario de algunos términos genéticos utilizados ............ Capitulo 5 Pilar Sanz y Manuel Repetto Implicaciones toxicolégicas de las enzimas colinesterasas. Introducci Caracteristicas bioquimicas. Mecanismos de accién y funciones fisiolégicas. Inhibici6n de las colinesterasas. Reactivacion de nes de los medicamentos. Referencias fslopatelegicas y clinicas. De- terminacién analitica Capitulo 6 Manuel Repetto y Pilar Sanz Fundamentos de ecotoxicologia. Antecedentes hist6ricos. Definiciones. Objetivos de la ecotoxicologia. Fase toxicodinamica. Modificaciones ambientales con efectos biol6gi- cos indirectos. Acidificacion del medio y Iluvias acidas. Interaccion de contaminantes. Respuestas del ecosistema a la polucion. Métodos para Capitulo 7 Ana Cameén y Manuel Repetto Estado actual de la toxicologia alimentaria. Clasificacién de los téxicos segtin su fuente. Incidencia en la bibliogra- fia. Sustancias t6xicas naturales en alimentos. Contaminantes biol6gi- os. Contaminantes quimicos. Aditivos alimentarios. Téxicos deriva- dos. Cancerigenos alimentarios. Dieta-cancer. Interacciones nutrientes- xenobiéticos en los alimentos. Sindrome del aceite téxico. Radionieli- i Copyrighted materialCONTENIDO xi dos en alimentos. Accidente de Chernobil. Caracteristicas toxicolégi- cas de las aquas potables Capitulo 8 M¢ Luisa Soria, Guillermo Repetio y Manuel Repetto Revisidn general de la toxicologia de los metales. Primera parte. Generalidades. Toxicocinética. Influencias de la espe- ciacién quimica. Mecanismos de acci6n t6xica. Toxicidad comparada. Interrelaciones metélicas. Monitorizacién. Segunda parte. Caracteris- ticas fisicas, quimicas, fisiolégicas y toxicolégicas de: litio, magnesio, aluminio, cromo, manganeso, hierro, cobalto, niquel, cobre, cine, ar- sénico, estroncio, cadmio, estafio, bario, mercurio, talio, plomo ...... Capitulo 9 M? Luisa Soria y Manuel Repetto Estado actual de la toxicologia del mercurio. Historia. Propiedades fisico-quimicas. Produccién y usos. Contamina- cién ambiental. Grupos de riesgo. Toxicocinética. Transporte y distri- bucién. Efectos téxicos. Valores de referencia e indicadores de la ex- posicién. Dosis-efecto y dosis-respuesta. Factores que modifican la toxicidad . Capitulo 10 Miguel Lépez-Artiguez y Manuel Repetto Estado actual de la toxicologia del cadmio. Quimica del elemento. Fuentes de exposicién ambiental. Ecotoxicolo- gia del cadmio. Exposicién ambiental y ocupacional. Toxicocinética y metabolismo. Efectos téxicos. Anilisis toxicolégico. Perspectivas de futuro Capitulo 11 Manuel Repetto Toxicologia del alcohol etilico. Las bebidas. Toxicocinética del etanol. Metabolismo del etanol. Ejem- plos de cdlculos. Factores influyentes. Fisiopatologia por etanol. In- 293 359 393,XIV. CONTENIDO teraccién del alcohol con otros frmacos. Determinacién de la alco- holemia y del alcohol en el aliento x .. 425 Capitulo 12 M-° Carmen Rodriguez-Vicente, Pilar Sanz y Manuel Repetto Estado actual de la toxicologia del cannabis. Introduccién. Antecedentes histéricos. Botanica. Quimica. Toxicoci- nética. Diagnédstico del consumo. Toxicodindmica. Potencial aplicacién PAtAPEUHER: scscancccerarcciranimanenrenmameNscR aaa cmaINa ere NS ROT REE 477 Capitulo 13 Manuel Menéndez y M.° Teresa Soriano Neurotoxicidad de los disolventes hexacarbonados. Introduccién. Efectos neurotéxicos. Toxicocinética. Relacién estruc- tura-actividad. Mecanismos de toxicidad ......... 6.620600 eeeee eee 517 Capitulo 14 Manuel Repetto, Domingo Martinez y Pilar Sanz Actualizacion de la toxicologia de los plaguicidas. Toxicidad general de los plaguicidas. Clasificacién. Plaguicidas orga- noclorados. Plaguicidas organofosforados. Plaguicidas carbamicos. Pi- retrinas y piretroides. Sales de bipiridilo. Compuestos ureicos y hete- rociclicos. Atrayentes y repelentes. Diagnéstico de las intoxicaciones por plaguicidas: scevesisciuncua mr maisree a uaaiTaaw ors 603capitulo 1 Metodologia de la investigacion toxicolégica MANUEL REPETTO Concepto de ciencia « La experimentaci6n cientifica « Método cientifico « Etapas del proceso de investigacion » Estructura de "a ¢ Guia para la evaluacion critica de un trabajo ¢ Seguimiento de un articulo « Factores de impacto » Bibliografia toxicolégica « Fuentes de informacion en toxicologia Segin el Comité de Educacién de la Sociedad Europea de Toxicologia (1978), el toxicélogo debe ser, antes que nada, un cientifico, capaz de elabo- rar informacién especifica relacionada con la Toxicologia y las ciencias afines. Se ha discutido mucho si la Toxicologia es o no una ciencia. En este sentido, anotemos que en el catalogo de Nomenclatura Internacional para los campos de la Ciencia y la Tecnologia de la UNESCO, la Toxicologia figura como ciencia independiente, con el cédigo 3214, dentro del grupo 32, de Ciencias Médicas. Ahora bien, como veremos ms adelante, no ha sido facil definir la Cien- cia en general, ni clasificar sus diversas modalidades; cuando menos, se trata de distinguir las ciencias positivas, materiales o experimentales frente a las ciencias filosficas, que procuran un conocimiento de la realidad total, y no slo de lo material; sin embargo, el cientifico debe atender a las dos. Al decir de Julién Marias, la distincién entre la filosofia y la ciencia ha llegado a ser demasiado tajante en el mundo moderno. Si se compara la fi- sica de Aristoteles con la de Galileo o de Newton, por ejemplo, se ve que, para nosotros, la primera es filoséfica y la segunda cientifica. El hombre de ciencia actual no pretende conocer las sustancias 0 causas, sino los hechos, los fenémenos y las leyes que lo regulan, a ser posible, mediante expresién matemética. Lord Kelvin lleg6 a afirmar que sélo es ciencia lo que puede ser2 TOXICOLOGIA AVANZADA expresado con nGmeros. Posiblemente esta actitud reduce nuestro campo de perspectiva intelectual. Por ello, el toxicolégo no puede sentirse simplemente como cientifico po- sitivo, sino que debiera dedicar un cierto grado de su atencién a conceptos y términos filoséficos que, en definitiva, enriqueceran su formacién integral y su rendimiento. De ahi la conveniencia de reflexionar sobre la relacién con la toxicologia y la aplicacion a ésta de los principios filoséficos que mejor pue- dan contribuir a la investigacion toxicolégica. Intentaremos, por tanto, introducirnos en la epistemologia (teoria parti- cular del conocimiento cientifico) o doctrina de los fundamentos y métodos del conocimiento cientifico, aunque procuraremos huir del habitual lenguaje arcaico y criptico frecuente en estos temas, con la pretensién de interesar al futuro investigador en Toxicologia. La investigaci6n es un largo proceso que requiere una estrategia y una tactica, tanto te6rica como practica; esto es lo que conocemos como método, objeto de la metodologia La palabra método procede de las griegas meta, que significa a lo largo, y odos, equivalente a camino. Por ello, se define, etimolégicamente, a mé: todo como el iter, camino, trayectoria o modo de proceder; en definitiva, sig- nifica el modo de realizar ordenadamente una cosa. A pesar de lo que mu- chos creen, el término no es sinénimo de técnica, que se concreta a los medios, instrumentos o reglas practicas de proceder (filtracion, extraccién, cromato- grafia, necropsia, tincién histolégica, etc.); una segunda acepci6n alude a la pericia o habilidad del experimentador. La idea de la demostracion es genuinamente griega (Vega, 1990) y su- pone una actitud metédica con una exposicion de una prueba concluyente de que algo es o no es. Aristételes, los estoicos y Euclides elaboraron la teoria de la ciencia demostrativa Se tenia por admitido que el método cientifico es el camino o procedi- miento a seguir para aproximarse al conocimiento mediante el empleo légico de unos instrumentos eficaces. La afirmacién de Bernaldez (1966) de que «el conocimiento cientifico es consecuencia de un modo de aplicar la intzligencia al objeto que se quiere conocer», lo complement6 Bunge (1983) al decir que el «método es el proce- dimiento para tratar un problema, aunque cada clase de problema requiera una diversidad de métodos y técnicas». CONCEPTO DE CIENCIA La Ciencia es dificil de definir; Pelseneer lleg6 a decir que es una nocién confusa, pero que esté clara su finalidad: un mejor conocimiento de lo queMETODOLOGIA DE LA INVESTIGACION TOXICOLOGICA 3. existe, tanto con fines espirituales como de provecho material. Por ello, se ha escrito que ciencia es un «conjunto ordenado de conocimientos, obtenidos de forma sistematicas. Para Rosemblueth es un conocimiento ordenado de los fenémenos natu- rales y de sus relaciones mutuas. Pretende sistematizar la experiencia pasada (expresandola como leyes) y predecir la futura. Bunge (1983) la entiende como una disciplina que utiliza el método con la finalidad de hallar estructuras generales, es decir, leyes 0 teorias. Entonces, el objetivo de la ciencia es producir teorias o sistemas de hipétesis especula- tivas 0 leyes con relaciones mutuas; en otras palabras, deducir asociaciones de causa y efecto. La ley cientifica se define como la expresion que establece relaciones en- tre dos o més variables (por ejemplo, la ley de accion y reaccidn). Sino buscamos estas estructuras o leyes y sélo realizamos la mera obser- vaci6n, aunque lleguemos a la experimentacién, nos quedamos en una cien- cia embrionaria 0 protociencia. Pero si nos limitamos a justificar una obser- vaci6n, sin llegar a criticarla y contrastarla, practicamos una pseudociencia. Para Claude Bernard (1813-1878) hay tres ramas fundamentales en los conocimientos humanos: 1. La ciencia de las creencias, es decir, la religion. 2. La ciencia del razonamiento: la filosofia. 3. La ciencia de las demostraciones, de las pruebas, es decir, las ciencias experimentales La Ciencia y la Metafisica (0 Religion) no son incompatibles; pueden mar- char asint6ticamente (paralelamente). El creyente podra dar un sentido reli- gioso a su ciencia, un significado mistico a sus investigaciones. Pero nunca debe permitir que se inmiscuya la metafisica en el metodo; este debe ser po- sitivista, objetivo: s6lo vale lo visto y comprobado. Caracteristicas de la Ciencia 1. Busca conocer el qué, el cémo y el porqué de los fenémenos. Aun- que persigue la verdad y trata de responder a porqués cada vez més inquisi- tives, no pretende alcanzar el conocimiento absoluto, como la filosofia. La verdad cientifica es siempre compleja; sdlo las aproximaciones pueden sim- plicarse, pero a medida que se afina aparecen matices e incertidumbres. Ya Pasteur afirmé que la ciencia proporciona sucesivas soluciones a los porqués, que continuamente son més sutiles y mas préximos a la esencia de los fend- menos. 2. Las afirmaciones cientificas tienen que ser demostrables o verifica- bles, es decir objetivas (Rosas-Rivero); y la objetivided implica que:image not availableimage not available6 TOXICOLOGIA AVANZADA (Egipto) y el Ayurveda (India), coetaneos (hacia 1500 a. de C.), contienen las referencias escritas més antiguas sobre medicamentos y venenos, iniciando la bibliografia y la historia de la Toxicologia (Repetto, 1988). Hacia el 50 d. de C., en Grecia, con el desarrollo de las ciencias de la naturaleza, Dioscérides publica su famoso libro de botanica y medicina titu- lado De materia médica. Numerosos autores han filosofado, a lo largo de la historia, acerca de los modos de obtener conocimiento. Se considera como el mas grande sistematizador de la antiguedad a Aris- toteles (384-322 a. de C.), filésofo y naturalista griego, discipulo de Platon, preceptor de Alejandro Magno, autor de 129 libros y durante dos milenios principal orientador del pensamiento europeo occidental, de los filésofos ara- bes y judios, y, en el siglo xm, de la Escolastica, surgida en las escuelas de la Edad Media. Con su Metafisica estudia los principios dltimos o mas altas cau- sas a través de los sentidos. Cre6 el empirismo y defini como principio de la ciencia la observacién de los fenémenos naturales (conocer hechos singu- lares a través de los sentidos) y traducirlos a leyes de cantidad y medida, sen- tando las bases de las ciencias biologicas modernas. Mas tarde, en el siglo 1 d. de C. se siguen desarrollando en la India las ciencias, especialmente la medicina, el cdlculo y la trigonometria; después de haber inventado los nimeros, més tarde llamados arabigos, en el siglo V in- troducen las letras para simbolizar las incégnitas y también calculan con nd- meros negativos. En Espajia, el obispo de Sevilla, Isidoro (560-636) en sus Etimologias, retine conocimientos de toda clase en una clasificacién de caracter religioso. E] término elemento tiene su origen en las letras L, M, N del alfabeto y significa «las letras entendidas como partes (elementos) de las palabras. Pos- teriormente también, «elemento» significa una afirmacién que desempefia un cometido esencial en la obtencién de otros resultados (Vega, 1990). El segundo gran instrumento del trabajo cientifico es el experimento (Max Weber, 1967); se habian efectuado experimentos psicolégicos en la India, dentro de la ascética del yoga (introspeccién), y experimentos mateméticos en Grecia, con finalidad militar, y en la Europa medieval, para la explotacién de minas. En el Renacimiento, los artistas como Leonardo transmitieron la experimentacién a la ciencia por obra de Galileo y de Bacon, pero eso no puede entenderse sin considerar el papel transmisor de los arabes. La alquimia (quimica) drabe se nutrié de miltiples fuentes (Egipto, Me- sopotamia, China), pero fundamentalmente de los alquimistas de Alejandro Magno, que aceptaban las ideas de Aristételes. Este habia propuesto los cua- tro términos (lo caliente, lo frio, lo seco y lo hiimedo) que se combinan (segtin la idea oriental) en los cuatro elementos o cuerpos simples: el fuego (caliente y seco), el aire o vapor (caliente y htimedo), el agua (frfa y hameda) y la tierraimage not availableimage not availableimage not availableimage not availableimage not availableimage not availableimage not available14 TOXICOLOGIA AVANZADA profesi6n, y la aficion, sin llegar a convertirse en obsesion, debe ocuparle mas alla de la jornada de trabajo; si quiere superarse, su agenda diaria debe con: tener periodos para la previsi6n (calendarios de trabajo a corto y largo plazo; cuando llega al laboratorio, debe tener decidido su programa del dia y no improvisar cada majiana) y periodos para el trabajo, el estudio y la medita- cién, Debe tenderse a la «polarizacién mental». Ademas de la autodisciplina y el estudio, el investigador debe practicar la meditaci6n solitaria, la tenacidad y la flexibilidad de pensamiento, la imagi- naci6n descabellada y el anticonformismo, la audacia y la prudencia, un enorme espiritu critico y exigencia hacia los dems y hacia si mismo, y des pués de todo ello, no tener reparo en consultar y someter a critica sus ideas y manuscritos, agradeciendo sinceramente la discusién y las sugerencias. No debe perder el tiempo, pero tampoco puede correr; aunque sea ale- gre, requiere silencio, paz y tranquilidad en su ambiente y en su interior. Pero en modo alguno debe dejarse esclavizar por el trabajo. El investigador actual no se concibe como caricatura de sabio aislado, tiene que estar integrado en un equipo que incluye desde el jefe o maestro a la secretaria administrativa. Y resulta que el reconocimiento de un investigador, la consecucién de ayudas o becas, las facilidades para publicar en buenas re vistas, etc., dependerdn del prestigio del equipo en que se integre, pues se vera afectado por el denominado por Merton (1985) efecto Mateo, aludiendo al pasaje de este evangelista en el que dice que «al que tenga se le dara.. pero al que no tenga se le quitard...». La evolucién normal es que el alumno pase a discipulo, éste a colabora: dor y finalmente a maestro y que transmita directamente y a través de publi- caciones sus conocimientos a otros. Pueden encontrarse varias clases de investigador: a) El docente que ademas de ensefiar, dedica parte de su tiempo a in- vestigar. b) Becarios, contratados o investigadores fijos de Organismos o Centros de investigacién cientifica. ¢) Idéntico personal de organismos pablicos de servicios (centros de cien- cia aplicada o tecnologia) que dedican algin tiempo a investigacién, frecuen temente por propia iniciativa y esfuerzo, no reconocido ni recompensado. d) Investigadores de la industria, dedicados a buscar innovaciones, en ocasiones paralelamente al ejercicio de controles de calidad. Al revisar la bibliografia encontramos publicaciones de investigacion to: xicolégica realizadas por personas que, ademas de corresponder a cualquiera de los grupos anteriores, pueden también clasificarse en: 1. Investigadores que trabajan en laboratorios de Toxicologia; son los que més propiamente deberian denominarse toxicdlogos.image not availableimage not availableimage not available18 TOXICOLOGIA AVANZADA les son los resultados. De aqui pueden deducirse ideas sobre incégnitas por resolver, para trabajar sobre ellas, y no sobre lo ya conocido. 2.2. Conocer cuando se realiz6; es frecuente que los temas se investi- guen por ciclos. 2.3. Discernir qué grupos o escuelas han trabajado sobre el tema, para dar fiabilidad a los que hayan trabajado y publicado mas y en mejores revis- tas y resulten mas convincentes. 2.4. Resumir los resultados de las investigaciones precedentes, 2.5. Buscar indicaciones para nuestras hipdtesis. 2.6. Buscar fundamento para ellas. 2.7. Obtener indicaciones sobre métodos e instrumentos, es decir, ver cuales se utilizaron, cuales no, y por qué razones. 3.° Extraer argumentos que apoyen la necesidad de nuestro estudio, pro- babilidad de éxito y su significaci6n, para encontrar las ayudas necesarias. Una bisqueda bibliografica correcta debe ser exhaustiva y hay que ha- cerla con exactitud, constancia y método; son de gran ayuda los bancos de datos informatizados, pero el investigador no debe limitarse a ellos. Las revistas de resiimenes son muy ittiles para los rastreos iniciales, en- trando en sus indices por las palabras clave, las formulas de las sustancias 0 sus ntimeros CAS, o bien por los autores, pero no podemos conformarnos con consultar unos pocos ni un sélo banco de datos. Algunos aprendices de investigador, con ms sentido de la comodidad que de la responsabilidad, se conforman con encargar a firmas comerciales la bis- queda bibliografica, que suele resultar deficiente a causa de incorrecta orien- tacién de la prospeccién. Las revistas deben comenzar a revisarse por las mas recientes, e ir retro- cediendo en el tiempo, hasta los trabajos mas antiguos. Los contenidos se deben recoger en fichas, anotando todo lo esencial con exactitud y siempre de la misma forma (existen modelos de ficha), copiando el resumen. Conviene afiadir unas palabras criticas sobre la impresion que nos produce el trabajo (convincente, insuficiente, bueno, regular, etc.). Las fr chas deben clasificarse segin el contenido (palabra clave), mejor que por el autor. Debe tenerse presente que, més importante que saber cosas, es cono- cer dénde pueden consultarse: la buena organizacién del fichero propio con: tribuye a organizar la mente. Después de madurar la idea se debe hacer una segunda revisién biblio- grafica, que no puede limitarse a la lectura de los restimenes, especialmente de los trabajos que parezcan fundamentales, sino que se debe conseguir el original. Frecuentemente, las referencias bibliograficas en un trabajo nos per- mitirén buscar otras citadas en aquel, y que suelen proporcionar mayor infor- macién (ramificacion de la bisqueda). La lectura de los trabajos ha de serimage not availableimage not availableimage not available22 TOXICOLOGIA AVANZADA IL1 Diseno El disefio del experimento incluye la seleccién de métodos, técnicas e ins trumentos y el tratamiento de los datos. Légicamente depende de las dispo- nibilidades del laboratorio o al alcance del investigador; con arreglo a las re- ferencias bibliograficas y nuestra experiencia, evaluaremos las disponibilidades materiales, econémicas, de personal colaborador y las propias del equipo in- vestigador, para decidir previamente si podra abordarse la experiencia 0 no. El disefio debe conducir a la redaccion de protocolos de trabajo, preferi- blemente en forma de tablas en que, por ejemplo, cada columna vertical se dedica a un tubo, muestra o animal, y cada linea horizontal corresponda a un reactivo o variable (tiempo, temperatura, agitaci6én, etc.); es una representa- cién grfica de la receta. Es conveniente comprobar precozmente que el disefio funciona, que el método, los instrumentos y la muestra prevista seran suficientes, y que pro- bablemente se obtendran datos fiables y vélidos; para ello se realizan ensayos previos 0 pilotos, que permiten afinar la receia o los procedimientos norma- lizados de trabajo (PNT). De esta manera se ahorra mucho tiempo, esfuerzo y dinero, y se incrementan las posibilidades de éxito. Prevaloracién estadistica. En todo trabajo experimental hace falta que los resultados tengan significacién estadistica, es decir, que se haga el suficiente nimero de ensayos para que los datos sean representativos; conviene prever esto en el disefio, para evitar que al final no nos sirva de nada el experi. mento. Como minimo, cada determinacién (punto) debe realizarse de 3 a 5 veces, y el nimero minimo de muestras de cada tipo debe ser 6. Lo mejor es realizar un tanteo estadistico con los ensayos previos 0 con los primeros resultados para, segtin sea la dispersion de los datos, asi deter: minar cual debe ser el tamafio de la muestra. También hay que decidir cual sera el método estadistico que se utilizar& posteriormente para el tratamiento de los datos En definitiva, el disefio debe pretender el establecimiento de unas condi- ciones experimentales que permitan una experimentaci6n realizable, que sea sencilla pero suficiente, y objetivable (mensurable, cuantificable), con inclusién de ensayos en blanco 0 controles en nimero suficiente. También debe ser repetible y representativa, es decir, que los datos posean significacion esta- distica. IL2. Desarrollo experimental El desarrollo practico de los experimentos requiere unas cualidades, ca: pacidades y disposicién del experimentador para obtener el fin perseguido;image not availableimage not availableimage not available26 —TOXICOLOGIA AVANZADA Vancouver (Columbia Britanica) en 1978, y terminé en 1981, unas Normas de preparaci6n de originales (dltima revisién de 1992), que han sido adopta- das por mas de 400 revistas (ver mAs adelante). En lineas generales se pro- pone la siguiente estructura: — Titulo — Autores, centro — Resumen — Palabras clave — Introduccién — Antecedentes — Material y métodos — Resultados y discusién — Conclusiones (deben contestar a las preguntas de la hipétesis) — Referencias bibliograficas, con estricto cumplimiento de las normas Al elegir una revista para publicar un trabajo conviene tener en cuenta la calidad 0 categoria de ambos, y el encaje del trabajo en la tematica de la re- vista. Existen unos baremos que califican los trabajos segiin la revista en que estén publicados; las mejores revistas disponen de censores rigurosos que, con anonimato de los autores, deciden la aceptacién de los trabajos. Hay clasifi- caciones internacionales de revistas que atienden al llamado «indice de im- pacto» y a la vida media o tiempo en que los trabajos publicados en ellas son citados posteriormente en otros trabajos (coeficiente de citaci6n). Puede ser recomendable (Metcalf, 1975) comenzar a escribir el trabajo cuando se llevan realizados unos 2/3 de éste. Se tiene asi mejor vision de los limites, se detectan defectos y se sugieren repeticiones o introduccién de in- novaciones, ete., antes de que caduquen los reactivos, se terminen las mues- tras o los animales, etc. Los resultados deben pasarse cuanto antes a tablas y a figuras, que pro- porcionan la mejor perspectiva y no deben dejarse para el final, porque son lentas de preparar. También aconseja Metcalf al autor de publicaciones cientificas que «sea honesto, imparcial y critico», y que cuando alguien haya hecho observaciones similares, se reconozca; pero si no se esté de acuerdo con otro, decirlo ama- blemente, (en alguna ocasién puede ocurrir al contrario). Se debe «evitar la tendencia a no citar (ignorar) a los competidores». Por otra parte, aludir a trabajos no publicados o en preparacién es des- considerado para el lector que no puede consultarlos, y en ocasiones resulta sospechoso de invencin. Una decision importante, cuando en el trabajo intervienen varios investi- gadores, es la firma de la publicacion. Entendemos que el autor principal, que normalmente firma en primer o en Gltimo lugar, debe ser generoso (dejar queimage not availableimage not availableimage not available30 TOXICOLOGIA AVANZADA Las letras deben ser grandes, pues en las reproducciones se reducen. Sélo se deben destacar las observaciones importantes. Discusién Interpretacion de resultados, respaldando las opiniones con la bibliografia (ver lo ya expuesto). Incluye, de forma claramente diferenciada, las aportacio- nes, tanto de la bibliografia (hasta donde llega ésta), como del autor (lo ori- ginal del trabajo). Conclusiones Pocas y sdlo las aportaciones reales. Huir de tentaciones. Evitar afirma- ciones sin matizar y las conclusiones no apoyadas sélidamente en los datos. Bibliografia Al final del trabajo se incluye una relacién, preferentemente alfabética o por orden de citaci6n en el texto, de autores, con el titulo y datos del trabajo, segtin las normas de cada revista, actualmente en vias de normalizacién de acuerdo con el Comité Internacional de Editores. Puede ser de tres clases: a) citada en el texto (referencias), b) consultada (no citada expresamente) y c) aconsejada para ampliacion. Debe ser suficiente, pero no necesariamente ilimitada y s6lo la revisada personalmente (excluir los articulos de revision) para: a) respaldar opiniones b) cortesia profesional No deben incluirse «comunicaciones personales» u « a ; para que se mantenga el poli morfismo 1/V tiene que encontrarse entre 1/100 y 99/100). Por dltimo, y como ocurre en la ceguera para los colores, el polimorfismo persiste por lo que se llama erelajacin de la selecciéns al dejar de ser el mutante periudicial por un cambio del medio ambiente (en las sociedades modernas es indife- rente la presencia de un gen que era perjudicial en las primitivas sociedades cazadoras 0 recolectoras). Los polimorfismos genéticos se pueden detectar con facilidad en el labo: ratorio por técnicas inmunolégicas que ponen de manifiesto una distinta ca- pacidad antigénica; por técnicas electroforéticas, que separan las proteinas por diferencias con respecto a ligeras variaciones de su carga eléctrica; por técnicas bioquimicas que distinguen distintas capacidades cataliticas en la ac- tividad de las proteinas; u otras como ocurre con la diferente caracteristica organoléptica en el sabor de la feniltiocarbamida, y hoy dia, con las técnicas de secuenciacién de proteinas y de clonaci6n, secuenciacién y amplificacion de genes. Son perfectamente conocidos los polimorfismos de los grupos sangui- neos, enzimas eritrocitarias, proteinas plasmaticas y antigenos de histocom- patibilidad, ampliamente utilizados en la identificacién de individuos, en el es- tudio de la compatibilidad entre tejidos para transplantes y transfusiones, en estudios antropolégicos, etcétera. La existencia de polimorfismos genéticos en las enzimas implicadas en el metabolismo de xenobiéticos significa que la poblacién contiene subgrupos (fenotipos) que difieren grandemente en su capacidad de llevar a cabo un buen nimero de reacciones bioquimicas. Desde el punto de vista toxicolégico es importante la repercusién de es- tas diferencias en variaciones interindividuales toxicocinéticas y toxicodina- micas. Es curioso observar que en muchos casos estan mejor establecidos los po- limorfismos humanos que los de los animales de laboratorio. No obstante los datos disponibles indican que son también frecuentes en las distintas espe- cies, y su conocimiento puede orientar sobre lo que ocurre en los humanos, aunque la extrapolacién es, si cabe, mas complicada que en otro tipo de es- tudios de toxicidad (Tablas 4.1 y 4.2). Se estima que aproximadamente el 30% de los genes humanos presentan polimorfismos. La influencia de la variacién de la estructura de las proteinas repercute en la respuesta a las sustancias t6xicas de tres formas principales. En primer lugar pueden influir en los fendmenos toxicocinéticos de absorcién, distribucion, metabolismo y excrecién. En segundo lugar pueden afectar a losLOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 91 Tabla 4.1. Polimorfismos en animales de experimentacién Via metabélica Sustrato afectado Especie/Cepa N-oxidacion Trimetilamina Pollo (Rhode Island) C-oxidacion Debrisoquina-esparteina —_—Rata (DA, O) Epéxido hidratacion Estireno 7,8-6xido Rata (F 344) Glucuronacién Bilirrubina Rata (Wistar) Androsterona Ardilla boliviena Mono Sulfatacion prnitrofenol Ratén Estrona 1-hidroxisafrot (Smith, 1986) receptores y a la secuencia de reacciones bioquimicas desencadenadas por su unién al xenobidtico. En tercer lugar son de especial importancia las que afec- tan a los mecanismos de reparaci6n, particularmente en la susceptibilidad al cancer. Tanto en farmaco como en toxicogenética se consideran estos procesos de una forma un tanto sesgada, ya que el centro de su interés son las reac- ciones adversas y las deficiencias que conducen a ellas. Pero existe un amplio rango en la variabilidad genética con interesantes combinaciones ventajosas Tabla 4.2. Proteinas sanguineas humanas polimérficas N- de Proteina variantes Catalasa 3 Ceruloplasmina 3 Amilasa 4 Pseudocolinesterasa 5 Fosfatasa dcida 5 Anhidrasa carbonica 5 6 fosfogluconato deshidrogenasa 7 Hemoglobina: cadena alfa 26 cadena beta 46 (Riche et al., 1980)aa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.aa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.94 TOXICOLOGIA AVANZADA Fenotipo acetilador De acuerdo con Evans (1965), respecto a la actividad N-acetil-transferasa hepatica, los individuos pueden ser acetiladores lentos (homozigéticos rece- sivos) 0 rapidos (heterozigéticos y homozigéticos dominantes) de una serie importante de sustancias: isoniazida (antituberculoso), hidrazina (antihiperten- sivo), procainimida (antiarritmico), sulfoderivados como el dapsone (antile- proso), fenelzina (inhibidor de la monoaminooxidasa, antidepresivo), fenace- tina (analgésico). Los distintos fenotipos se producen por herencia mendeliana de un gen ‘Gnico NAT2. Se han identificado varias mutaciones que suponen fallo en la expresién de la enzima. Existen grandes variaciones raciales en la distribucion de fenotipos. Asi, la frecuencia del alelo responsable de la acetilacién lenta es maxima en Oriente Medio, llegando al 90 % en algunas poblaciones arabes, y minima en esquimales y japoneses (5-10 %). Ademas de los dos fenotipos descritos por Evans, se ha demostrado la existencia de un tercer fenotipo que manifiesta una velocidad de acetilacién intermedia. E] anélisis genético de los RFLPs generados por digestién con las restrictasas KpnI o Asp718 mas BamHI ha puesto de manifiesto 4 alelos di- ferentes que generan 6 genotipos. Los homozigotos respecto al alelo 1 son acetiladores rapidos; los homozigotos 1-2 y 13 son intermedios y los restan- tes homozigotos o heterozigotos son acetiladores lentos (Mashino et al., 1992). Una interaccién farmacolégica importante, que ocurre solamente en ace- tiladores lentos es la de la isoniazida y la fenitoina, con la que aparecen los efectos colaterales debidos a la fenitoina: nistagmus, ataxia y somnolencia, En estos individuos la isoniazida alcanza concentraciones lo suficientemente altas como para inhibir a las enzimas metabolizantes hepiticas, incluidas las que hidroxilan la fenitoina; como consecuencia, las concentraciones de fenitoina incambiada aumentan y aparecen los sintomas de neurotoxicidad caracteris- ticos. tra interacci6n importante es la de metropolol y propafenona, que in- hibe el metabolismo del metropolol con lo que éste se acumula, ejerce un efecto antagonista de B-receptores y aparece fallo cardiaco, pesadillas y vi- sién bortosa. Los acetiladores rapidos sufren el fenomeno de fenocopiado an- tes descrito. Entre un 30 y un 50 % del metropolol administrado se metaboliza por una via secundaria que es inhibida por diltiazem. En los acetiladores rapidos la asociacion de ambos {armacos no tiene ningiin efecto adverso porque com- pensan la enzima inhibida con la de acetilacién. Sin embargo, en los acetila- dores lentos el metropolol se acumula y produce una toxicidad cardiovascu- lar que mimetiza un infarto de miocardio. La procainimida esta asociada a alta incidencia de formaci6n de anticuer-LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 95 pos antinucleares y desarrollo de lupus sistémico eritematoso y de agranulo- citosis. La via principal de destoxicacién es la N-acetilacién. Parece ser que no hay diferencia entre acetiladores rapidos y lentos en cuanto a la incidencia de la enfermedad en pacientes con arritmia tratados crénicamente con este farmaco. Sin embargo, la aparicién de anticuerpos antinucleares requiere 2.9 meses y una dosis total media de 1.5 g/kg en acetiladores lentos y 7.3 meses y 6.1 g/kg en los rapidos Son contradictorias las conclusiones sobre el desarrollo de hepatotoxici- dad en la terapia tuberculostatica con isoniazida. Mientras la mayoria de los autores indican que los acetiladores lentos presentan un riesgo mucho mayor que los rapidos, y ésta parece ser la opinion de Eichelbaum et al. (1992), otros estudios indican que son los acetiladores rapidos los mas susceptibles (Mit- chel et al., 1975). La isoniazida no es hepatot6xica pero los productos de su hidrGlisis, acetilhidrazina e hidrazina si lo son. La acetilhidrazina se metabo- liza posteriormente por dos vias metabdlicas diferentes, N-acetilacion que da lugar a diacetilhidrazina inactiva, y oxidacién microsémica dependiente de cit P450, que forma al intermediario de mayor potencia hepatotéxica. La mayor susceptibilidad de los acetiladores lentos parece evidente por tener deterio: rada la via de destoxicacién, mientras que la de los rapidos resulta dificil de explicar. En nuestra opini6n, es posible que no se pueda atribuir la mayor o menor toxicidad de la isoniazida al fenotipo acetilador exclusivamente. Puesto que también la hidrélisis y la oxidacién microsémica son sistemas enzimaticos potencialmente polimérficos, puede ser necesario establecer un grupo de riesgo a partir de la consideracién conjunta de todos aquéllos, N-acetilacién, hidrélisis y oxidaci6n. En un estudio realizado con 50 acetiladores lentos y 50 rapidos, expues tos a anilina, se vio que ninguno de éstos dltimos desarrollan niveles de me- tahemoglobina por encima del 30%, mientras que 12 de los primeros lo ha: cian. La N-acetiltransferasa es la enzima encargada de la inactivacion por acetilacién de arilaminas como f-naftilamina, bencidina, 4-aminobifenilo, 4- nitrofenilo, que se utilizan como antioxidantes en la industria. De 92 trabaja:- dores expuestos a bencidina que habian desarrollado tumor de vejiga, el 81.5% resultaron ser acetiladores lentos. Pero se ha observado en acetiladores répidos una mayor incidencia de cncer colorectal. La explicacién de esta aparente paradoja seria la impor. tancia relativa de la N-acetilacién por la NAT2 frente a la O-acetilaci6n. Se ha demostrado ademis la existencia de una acetiltransferasa citosélica, mo- nomérfica, NAT1. La NAT2 de colon cataliza répidamente la activacién me- tabélica de las N-hidroxilaminas en los acetiladores rapidos, desencadenando el cancer colorrectal. La afinidad de las arilaminas es significativamente ma- yor para la NAT2 que para la NAT196 TOXICOLOGIA AVANZADA La transformacién metabélica de las arilaminas se desarrolla segin el si- guiente esquema (Hein et al., 1992): ~\=nch Acton, —yck = SH (NAT? y NAT2) T= CHa ° hone N-oxidacién cot AcCoA _yooH SH N-acotilacion ae CHs Oo AcCoA N, O-acetiitransferencia O-aceiilacion intramolecular (NAT1 y NAT2) NATIT Oo i Wyte — CH — | SH Y \ ny + dueto Aritamina-ADN | ee H Colinesterasa plasmatica La existencia de una variante atipica de la colinesterasa (ChE) sérica hu- mana se reconoci6 por primera vez cuando al administrar bajo anestesia el relajante muscular suxametonio (succinilcolina), se produjo apnea severa en algunos pacientes. Al contrario de lo que ocurre con la ChE normal, la forma atipica es incapaz de hidrolizar la succinilcolina o lo hace muy lentamente y es anormalmente resistente a inhibidores como la dibucaina. La ChE atipica puede detectarse en el suero de estos pacientes utilizando benzoilcolina como sustrato en presencia de dibucaina. De forma similar se ha descubierto un tipo de ChE resistente a fluoruro. En este caso la ChE no se inhibe con fluoruro sédico, pero si con dibucaina. Se ha sefialado una tercera variante en la cual los individuos que la pre- sentan carecen aparentemente de ChE sérica. Esta variante se debe a la pre- sencia de un alelo «silente». Se encontré que el suero de los individuos por-LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 97 Tabla 4.4. Efectos t6xicos relacionados con polimorfismo de ChE Respuesta a dosis usuales de Tipo de enzima Alelos (locus E1) succinilcolina Normal Ey Hidrélisis répida Atipica E ‘Apnea prolongada Gen siente & Apnea prolongada Resistente a fluoruro & Apnea prolongada (Richtio ot at, 1980) tadores de este alelo contiene una proteina semejante a la ChE normal, pero desposeida de actividad. Parece ser que existen dos variantes genéticas del gen silente: en el tipo I no hay actividad, ni se detecta la proteina, en el tipo Il la proteina esta presente, y es inmunolégicamente detectable, pero la acti- vidad es solamente residual. Los cuatro alelos dan lugar a 10 genotipos con diferente susceptiblidad a la succinilcolina. Las distintas variantes genéticas de la ChE pueden detectarse por técni- cas electroforéticas, por datos cinéticos de inhibicién con organofosforados o con propranolol, o por diferencias en la absorcién a 340 nm. Estan regulados por un gen (E1) que se ha aislado y codificado a partir de tejidos fetales hu- manos. La secuencia de aminoacidos del sitio activo parece ser idéntica en los distintos genotipos. Asi pues, existen cuatro variantes de la ChE: normal, resistente a dibu- caina, resistente a fluoruro y silente, todas ellas dependientes de un tinico lo- cus (Tabla 4.4). Su conocimiento es particularmente importante por sus re- percusiones clinicas, por la posibilidad de predecir la sensibilidad a farmacos en los individuos portadores, especialmente en lo que se refiere a pacientes que hayan de recibir suxametonio durante la anestesia y requieran por lo tanto la aportacién de proteccién adecuada (ver Capitulos 5 y 14). Paraoxonasa y otras enzimas relacionadas con la toxicidad de organofosforados La paraoxonasa es una arilesterasa del suero que hidroliza al paraox6én (metabolito activo del paratién) formando p-nitrofenol y dietilfosfato, con lo que se inactiva (Aldridge, 1953); también hidroliza al fenilacetato y a ésteres aromaticos. Aproximadamente la mitad de la poblacién blanca y negra del98 TOXICOLOGIA AVANZADA Reino Unido y de Seattle, presentan una actividad enzimatica baja que co- rresponde a un tercio o incluso un sexto de la actividad considerada normal. Estas diferencias son suficientes para provocar modificaciones significativas en los niveles sanguineos y en la velocidad de inactivaci6n del paratién y pro- bablemente de su congénere malatién. Los individuos con actividad baja de paraoxonasa estan mas predispues- tos a desarrollar los sintomas de la intoxicacién, lo que tiene gran importancia en aquellos ocupacionalmente expuestos a parati6n, sobre todo aplicadores y mezcladores del insecticida. Es por tanto una enzima polimérfica, regida por dos alelos, que presenta una distribucién bimodal o trimodal. La funci6n fisiol6gica se desconoce, ya que los individuos que muestran total ausencia de actividad no manifiestan ninguna afectacién aparente en ausencia de exposicién. Su actividad parece estar relacionada con la ingesta, ya que se ha observado una cierta asociacién con lipoproteinas de alta densidad (HLD); se reduce en el infarto de miocar- dio. Ambos alelos muestran diferencias cuantitativas y cualitativas, el de acti- vidad alta puede estimularse con CINa o CIK, mientras que el de actividad baja no, lo que se utiliza para la deteccién analitica de los distintos fenotipos. La frecuencia génica del alelo de baja actividad es 0.716-0.777 y se ma- nifiesta en el grupo homozigético recesivo de actividad baja. La frecuencia del alelo de actividad alta es 0.223-0.284 y se manifiesta en el grupo de he- terozig6ticos y de homozigéticos dominantes. Aproximadamente el 50% de la poblacion europea presenta actividad alta. En las poblaciones mongoloides y negroides, menos del 10% pueden incluirse en el grupo de baja actividad, y no se ha encontrado esta caracteristica en los aborigenes australianos. Relacionada también con las intoxicaciones por plaguicidas organofosfo- rados se encuentra la carboxilesterasa, enzima presente tanto en higado como en plasma, inducible por fenobarbital, y que protege frente a los efectos té- xicos de estas sustancias. Las carboxilesterasas de rata, tanto en higado como en otros tejidos, son unas enzimas muy polimdrficas, codificadas por genes pertenecientes al grupo de ligamiento V de esta especie. Algunos organofosforados, triortocresil fosfato (TOCP), mipafox, etc., pueden producir neurotoxicidad retardada, OPIDN, no necesariamente pre- cedida de sintomas colinérgicos. El desarrollo de la enfermedad, cuyos sinto- mas aparecen a las 2 6 3 semanas de la exposicién, parece estar mas 0 me- nos ligado a la inhibicién temprana en sistema nervioso de una proteina con actividad esterdsica, denominada esterasa diana de neuropatia (NTE, John- son 1982). El descubrimiento de actividad NTE en linfocitos, plaquetas y eri- trocitos ha promovido su uso como marcador de OPIDN. Se han observado individuos con actividad alta y baja, y los datos esta- disticos sugieren la existencia de distintos subgrupos (Mutch et al., 1992). Noaa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.aa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 101 cién con oligonuclestides especificos de alelos en secuencias de ADN ampli: ficadas por la técnica de «amplificacion en cadena de la polimerasa» (PCR). Se conocen 4 isoenzimas de la ALDH humana, I, Il, Ill y IV. De ellas, la I, mitocondrial, y la Il citosélica son las que contribuyen de forma mis efi. ciente a la oxidacién del acetaldehido, por poseer unos valores de Km mas bajos, inferior ademas en la I respecto a la Il. Se conoce la localizacion cro: mosémica de estas dos ALDH en el cromosoma 9 y en el 12, respectiva- mente, y sus polimorfismos de restriccién para varias restrictasas. Asimismo, se han desarrollado sondas especificas de alelos que permiten el genotipado del exon 12 de la ALDH I normal y mutada de la ALDH1 (Goedde et al., 1989). Los japoneses y otras poblaciones mongoloides son deficientes en la ALDH I, por lo que la ingestién de alcohol les produce, rapidamente, enro- jecimiento facial, incremento de pulso y de la temperatura de la piel. Tam- bién se ha demostrado que la deficiencia de la ALDHI es menos frecuente en alcohélicos que en individuos sanos. De todo ello cabe deducir que la d ficiencia de ALDH I, debida a una mutaci6n estructural que da lugar a la si tesis de una proteina inactiva, provoca un retardo en la oxidaci6n del acetal- dehido y se desencadena una reaccién molesta e incluso de aversién al alcohol. Por tanto, los individuos deficientes de ALDH I quedarian protegidos frente al alcoholismo. No obstante el establecimiento de un patr6n genético de riesgo debe tomar en consideracién el polimorfismo de la ADH y quizds también las de la transferrina y la GGT (gammaglutamiltranspeptidasa), am- bas polimérficas y afectadas por la ingesta cronica de alcohol. Superéxido dismutasa y catalasa Los radicales superéxido se producen intracelularmente como consecuen- cia del metabolismo aerobio normal y son eliminados por la superoxido dis- mutasa (SOD) que los convierte en peréxido de hidrégeno y oxigeno. La ca- talasa inactiva al per6xido de hidrégeno formando agua y oxigeno. Los aniones superéxido contribuyen a la fisiopatologia de enfermedades como la artritis reumatoide y la ateroesclerosis y del envejecimiento. Producen, de forma ms 0 menos directa, dafio al ADN, inactivan enzimas como la 3-hi- droxi-esteroide deshidrogenasa y a la bomba de Na’-K*, son mutagénicos y afectan al transporte de fosfato inorgdnico. Estan ademas implicados en el mecanismo de accién téxica de numerosos xenobiéticos productores de es- trés oxidativo, de los que el herbicida paraquat y el tetracloruro de carbono son los ejempos mas representativos, y de farmacos como el acetaminofeno. Dada la importancia que estén adquiriendo los mecanismos radicalarios en el esclarecimiento de los procesos téxicos, pueden revestir especial interés102 TOXICOLOGIA AVANZADA los polimorfismos que afectan a dos de las enzimas claves en la destoxicacion de los radicales libres superéxido. Existen distintas formas de SOD, la Cu-Zn SOD se localiza en citosol y la Mn-SOD en mitocondrias Se ha descubierto una variante electroforética de la Cu-2n SOD en algu- nas poblaciones humanas, cuya frecuencia es baja en la raza caucasica, del 0,62 %, que se incrementa en determinadas subpoblaciones, por ejemplo, de Suecia. El gen de esta enzima se ha localizado en humanos en el cromosoma 21, por lo que los individuos con sindrome de Down presentan una actividad 50 % mayor, y se esta investigando si este exceso puede ser responsable de algunas de las patologias asociadas (Canadé y Calabrese, 1992) La catalasa, ademas de inactivar el peréxido de hidrégeno procedente de la descomposicién del superéxido por la SOD, es una enzima destoxicante del metabolismo oxidativo de acidos grasos y otros compuestos. Depende de un Gnico gen localizado en el cromosoma 11. La acatalasemia es un trastorno recesivo caracterizado por un déficit grave de catalasa cuya actividad no al- canza el 10 % del nivel normal. Los individuos portadores no presentan nin- guna sintomatologia, probablemente por exacerbacion de mecanismos anti- oxidativos compensatorios, aunque en japoneses se ha citado un incremento en la incidencia de ulceraciones bucales. La pérdida de actividad enzimatica no parece deberse a disminucién de sintesis proteica sino a una alteracién estructural que afecta al sitio activo. En la aniridia, enfermedad genética de- bida a una delecién en el locus 13p del cromosoma 11 donde se localiza el gen de la catalasa, su actividad esta reducida a un 30 % y se observa una incidencia alta de tumor de Wilm y retraso mental, aunque se desconoce el papel que desempefia el deficit en las manifestaciones clinicas (Calabrese y Canada, 1992). Sistema oxidativo microsémico Gran parte de las oxidaciones metabélicas forman parte del sistema de moncoxigenasas microsémicas dependientes del cit P-450. Los genes de la superfamilia del cit P450 codifican un grupo de enzimas que comparten las siguientes caracteristicas: poseen un grupo hemo, son en zimas de membrana unidas firmemente a la porcién intracelular y utilizan para oxidar los sustratos los equivalentes reductores del NADPH (0 del NADH) y un tomo de oxigeno derivado del oxigeno atmosférico. Los hidrogeniones se transfieren al cit P-450 via una segunda enzima, la NADPH-cit P-450 re- ductasa. Existen dos clases principales de cit P-450, una de ellas esta ligada a la membrana interna de mitocondrias, entre las que se encuentran las 11 B-hi-LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 103, Tabla 4.6. Familias de! cit P-450 en humanos P-450 N.° de subfamilias —_ Reacciones cyPl 1 Metabolismo de xenobiéticos induci- bles por TCDD cyPll 8 Metabolismo de xenobidticos y este- roides constitutivos e inducibles por fenobarbital, etanol CYPIll 2 Metabolismo de xenobidticos y este- roides cyPiv 2 @y @ hidroxilaci6n de acidos grados CYPVII 1 Colesterol 7-a-hidroxilasa CYPX! 2 11-B-hidroxilaci6n de esteroides CYPXVIL 1 17-o-hidroxilaci6én de esteroides CYPXIX 1 Aromatasa CYPXXI 1 21-hidroxilacion de esteroides CYPXXVIL 1 Colesterol 27-hidrolasa droxilasas. La mayoria de los cit P-450 pertenecen a la segunda clase y se localizan en el reticulo endoplasmatico liso, formando el sistema oxidativo mi- crosémico. EI sistema isoenzimatico microsémico del cit P-450 humano esta consti- tuido por un minimo de 30 genes diferentes, probablemente 100 a 200 genes y pseudogenes, formando una superfamilia que a su vez se agrupa en distin- tas familias, de las cuales las mas importantes son las familias P-450 I y P-450 Il (Tabla 4.6). En 1987 se implanto un sistema de nomenclatura basado en la secuencia de aminodcidos (Nebert et al., 1987). Las familias se designan con nimeros romanos, las subfamilias con letras maydsculas y cada uno de los miembros con un némero arabigo. Dos cit P-450 que compartan una semejanza inferior al 40 % en su secuencia de aminodcidos se consideran miembros de una fa- milia diferente y si la semejanza excede al 59 % se asignan a la misma sub- familia de genes. Las principales isoformas de cit P-450 muestran preferencia de actuacién sobre sustratos de conformaciones especificas (Tabla 4.7). La familia P-450 | codifica la sintesis de un receptor citosdlico que inter- acta con 3-metilcolantreno, benzopireno, naftoflavona, TCDD, todas ellas moléculas de estructura planar. El complejo receptor-xenobiotico es transfe- rido al niicleo, lo que activa la sintesis de una forma de citocromo P-450, que104 TOXICOLOGIA AVANZADA Tabla 4.7. referencias de sustrato por algunas isoenzimas del cit P-450 IsoformaP-450 — Sustrato preferente 1at Hidrocarburos policiclicos (HPC) 1a2 HPC sustituidos con aminas, compuestos aromatics con heterociclos IB Moléculas con forma de V con uno 0 més anillos arométicos no fundidos. iD Similares a B pero con una base de nitrogeno a una distancia y orientacién especifica de un anillo aromatico. NE Moléculas pequefias, no necesariamente planares MA Moléculas grandes, no necesariamente planares; muestran especificidad cruzada con 1A1 y IIB. VA Acidos carboxilicos y sus ésteres, generalmente con uno o dos anillos aromaticos no fundidos a cierta distancia del grupo carboxllico. (Lewis, et al, en Bafantyne, 1993) con el CO forma un complejo que absorbe a 448 nm. El receptor citosélico esta bajo el control del locus Ah. La familia P-450 II esta constituida en parte por isoenzimas del cit P-450 constitutivo, y en parte por isoenzimas inducibles por fenobarbital, y otras moléculas de estructura globular. EI fenobarbital induce directamente la sintesis de un RNA 2 Kb y no pa- rece relacionado con ningtin receptor. A su vez, estas familias de genes estan constituidas por genes polimérfi- cos, de los cuales los mas importantes son el CYPIID6 y el CYPIIC, de la familia II, y el CYPIA1, de la familia I, que representa la actividad de la aril- hidrocarburo hidroxilasa (AHH), cuya induccién esté mediada por el receptor citosélico AH. Las frecuencias de los alelos deficientes presentan grandes diferencias ra- ciales: 7-10 % en caucésicos y 0,5-1 % en chinos y japoneses para el gen CYPIID6 y 2-5 % en caucdsicos y 15-20% en chinos y japoneses para CYPIIC8 /C 10 (Eichelbaum, 1992). Otras formas inducibles del cit P450 son las subfamilias CYPIIIA, CY- PIIB, CYPIE y CYPIVA de la cual el gen CYPIVA1 es inducible por proli- feradores de peroxisomas. Se han purificado hasta homogeneidad electrofo- rética nueve formas deficitarias del citocromo P-450; para cuatro de ellas existen anticuerpos policlonales que permiten su identificacion y, mediante sondas c-DNA especificas, es incluso posible caracterizar el defecto en el ge- noma. Las mutaciones que dan origen a los alelos deficitarios producen en geLOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 105 Tabla 4.8. Especificidad de sustrato de los cit P-450 humanos para sustancias de uso farmacolégico Isoenzima Farmaco CYPIA2 Fenacetina, Cafeina, Paracetamol, Teofilina CYPIC8/9/18 Diazepam, Fenilbutazona, Hexobarbital, Mefenitoina, Clotrimazol CYPIID6 Amitriptilina, Dextrometorfano, imipramina, Codeina, Perfenacina, Propranolol, Zuclopentixol CYPIE1 Clorzoxazona, Halotano, Isoniazida, Paracetamol CYPIIAS Ciclosporina, Eritromicina, Etiniloestradiol, Lidocaina, Nifedipina, Prednisolona, Triazolam neral disminucién de la estabilidad del m-RNA o de la protefna, o anomalias estructurales en una de estas mismas moléculas, lo que resulta, respectiva- mente, en ausencia de la proteina o en reduccién de su capacidad catalitica. Mediante técnicas altamente especificas de tipado genético se ha identi- ficado con éxito el 90 % de los metabolizadores rapidos. Se ha descrito tam- bién un RFLP de la restrictasa msp I para el gen humano CYPIA1, en la re- gién no codificante. El alelo mutante est4 asociado a mayor actividad metabélica. Los individuos homozigéticos para este alelo mutante parecen ser susceptibles a c4ncer de pulmén con exposiciones globales a humo de ciga- rrillo mas cortas que los heterozigotos o los homozigotos para el alelo normal (Boobis, 1992). Las implicaciones toxicolgicas de los polimorfismos del cit P-450 mejor conocidas son las que afectan al uso terapéutico de farmacos (Tabla 4.8). Se han realizado estudios sobre la asociacién de algunos de ellos con enferme- dades surgidas de exposicién ambiental, sobre todo de tipo canceroso, pero, en conjunto, las conclusiones son atin poco definitivas. Polimorfismos del metabolismo oxidativo El primer polimorfismo del metabolismo oxidativo en el hombre se puso de manifiesto con el farmaco hipertensivo debrisoquina (Mahgoub et al., 1977). La oxidacién defectuosa de la N-esparteina fue descrita en el hombre por Ei- chelbaum et al., en 1979, como defecto farmacogenttico regulado por dos genes alélicos en un mismo locus. En estudios poblacionales se observé que la 4-hidroxilacion de la debri- soquina y la oxidaci6n de la N-esparteina, procesos metabélicos implicados en la eliminacién de la mayoria de los medicamentos, estaba muy deteriorada © practicamente ausente en algunos individuos. Estos sujetos se denominaronaa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.aa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.108 TOXICOLOGIA AVANZADA bolizadores deficitarios son proclives a desarrollar neuropatia periférica y he- patopatia con la administracién crénica de ese farmaco. Los valores de vida media de eliminacién plasmatica son largos para los is6meros D y L de la perhexilina: — en metabolizadores normales, 66 y 280 h, respectivamente; — en metabolizadores deficitarios, 157 y 427 h. Una situacion andloga ocurre con el farmaco antirreumatico D-penicila- mina, con el que los efectos adversos son mas evidentes en pacientes con sulfooxidacién deficitaria. La incidencia de reacciones t6xicas fue del 51% en un grupo de 56 pacientes con sulfooxidacién deficiente y sdlo del 17% en un grupo de 34 pacientes con sulfooxidacién normal. Las respuestas t6xicas ob- servadas fueron proteinuria, hematuria, trombocitopenia y rash cutdneo. Otras consecuencias de estados de oxidacién deficitarios estan atin poco estudiadas. Puede ocurrir que en las personas afectadas se utilice como via metabélica alternativa una via minoritaria que acaba por adquirir gran impor- tancia. Esto es lo que parece suceder con la fenacetina en los metabolizadores pobres de debrisoquina. La via habitual oxidativa de O-desetilacion esta po- bremente regulada y prevalecen vias de hidroxilacion aromitica y desaceti- lacion que generan niveles hematotoxicos de hidroxifenetidinas. Por esta ra- zon la fenacetina puede inducir rapidamente la aparicion de metahemoglobina en individuos con fenotipo metabolizador pobre. También pueden sobrevenir fallos terapéuticos si la actividad del farmaco depende de activacién metabélica. Asi el farmaco antiarritmico ecainida ca- rece de actividad en los metabolizadores pobres, porque no forman el meta- bolito activo O-desmetilado. Por iiltimo, se sabe que el gen polimérfico responsable de la oxidaci6én de la debrisoquina regula también el metabolismo oxidativo de otras muchas sustancias, particularmente las basicas. Como consecuencia,con terapia mal- tiple y si los férmacos utilizados son sustrato del mismo sistema metabslico polimérfico, pueden ocurrir interacciones insospechadas. Variaciones interindividuales del metabolismo de carcinégenos Numerosos fenotipos genéticamente bien controlados se han asociado con la susceptibilidad frente a distintos tipos de cancer, pero las conclusiones son, a menudo, poco convincentes y presentan hasta la fecha escaso poder pre- dictivo 0 diagnéstico. Esto se debe a que, en muchos tipos de cancer no it terviene un sdlo fenotipo, sino varios y cada uno de ellos contribuye a incre- mentar el riesgo en mayor o menor grado. Ademés, otros fenotipos pueden desempefar, simultaneamente, un papel opuesto aportando resistencia. Asi, para estimar la probabilidad global de que un individuo desarrolle un cancerLOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 109 determinado seria necesario realizar el balance entre los fenotipos que le pre- disponen al mismo y los que le protegen (Vessel, 1991). En los c&nceres inducidos por sustancias quimicas, el primer paso del proceso carcinogénico es, frecuentemente, la biotransformacié6n a la forma activa y reaccién subsiguiente con el ADN. La susceptibilidad al cAncer di- fiere de unos individuos a otros, expuestos a la misma cantidad de determi- nados carcinégenos (benzopireno, aflatoxina B1, 2-acetaminofluoreno, etc.), por variabilidad en cualquiera de los dos procesos mencionados. Existen dos aproximaciones diferentes para identificar individuos con alto riesgo de cAncer frente a la exposicion a carcindgenos. 1. Realizar el estudio del fenotipo in vivo respecto a un téxico en parti- cular 0 in vitro, utilizando anticuerpos monoclonales frente a cit P-450 espe- cificos, 2. Valorar la formacion de aductos en cultivos de tejidos o utilizando anticuerpos contra modificaciones del carcinégeno-ADN en tejidos asequibles del individuo expuesto. O también determinar la formacién de aductos con la hemoglobina. El polimorfismo de la arilhidrocarburo hidroxilasa puede estudiarse en cultivos de linfocitos, estimulados con mitégenos, de individuos sanos. El 42% presenta actividad baja, el 47% una actividad media y el 11% alta. El estudio de pacientes con carcinoma bronquial mostré que el 95% pertenecia al grupo con actividad media (64%) 0 alta (31%) de AHH, aunque se discute si esta suficientemente justificada la prediccién de riesgo de cancer basada en esta determinaci6n. EI sistema AHH esta implicado en la activacién de muchos arilhidrocar- buros promutagénicos 0 procarcinogénicos de los que el benzopireno es el prototipo. Se han demostrado en ratones diferencias en la susceptibilidad a factores ambientales atribuidas al locus Ah. Un producto del locus Ah parece ser una proteina citosélica receptora de gran afinidad (Kd = 1 nM) por los inductores aromiticos policiclicos. Esta proteina receptora esta ausente en ratones no susceptibles. Comparando los ratones Ah(d)/Ah(d) con los Ah(b) homozigotos y hete- rozigotos, los dos diltimos tienen: 1. Mayor respuesta inflamatoria a la aplicacin tépica de 7,12-dimetil- benzantraceno. 2. Gran susceptibilidad a sarcoma cutdneo inducido por metilcolantreno y benzopireno, y a tumores pulmonares inducidos por metilcolantreno. 3. Mayor resistencia a la paralisis inducida por zoxazolamina, a la toxi- cidad del lindano y a la toxicidad para médula 6sea y leucemia inducidas por benzopireno.110 TOXICOLOGIA AVANZADA 4. Mayor susceptibilidad a necrosis hepatica y formacién de cataratas in- ducidas por acetaminofeno y a los defectos congénitos producidos por hidro- carburos policiclicos. Para el funcionamiento del receptor AH se requiere el concurso de varias proteinas diferentes: una ligante, un factor de traslocacién y al menos otra proteina més. El inductor se une al receptor en el citosol y este complejo es traslocado al niicleo donde el receptor, 0 uno de sus componentes, se une a elementos reguladores tipo cit del gen CYPIA1, para estimular la transcrip- cion. Por tanto, la induccién implica a productos de varios genes y una mu- tacién en cualquiera de ellos puede alterar la respuesta al inductor. Este pro- ceso se ha demostrado tanto en ratones como en lineas celulares mutantes. En la Agencia Internacional de Investigacién sobre el Cancer de Lyon (Francia) se ha realizado un estudio en preparaciones de parénquima pulmo: nar y/o bronquial procedentes de pacientes con cancer de pulmén y con dis: tintos tipos de enfermedad pulmonar no neoplasica, Concluyen que si no se considera el habito de fumar no se aprecian diferencias entre ambos grupos de pacientes en una serie de actividades enzimAticas relacionadas con el CYPIA1 (AHH, BP, 3-hidroxilasa, etoxicumarina-0-desetilasa), en la glutation transferasa, en la UDP-glucuronil transferasa y en la identificacién de aductos de ADN con compuestos aromaticos. Sin embargo, la diferente inducibilidad de las enzimas pulmonares relacionadas con CYPIA1, en fumadores, esta asociada con el riesgo de cancer de pulmén (Bartsch et al., 1992). Por otra parte, estudios epidemiolégicos, tipo cohorte, realizados en Ja- pon, han puesto de manifiesto que el genotipo susceptible del CYPIA1 pre- senta un elevado riesgo de carcinoma pulmonar de células escamosas, incluso con un consumo bajo de cigarrillos (Kawajiri et al., 1990; Nakachi et al., 1991). Algunos autores han intentado demostrar asociaciones entre el gen CYPIID6 y enfermedades producidas por exposicién ambiental, entre ellas la relacién humo de cigarrillo-cancer de pulmén, pero en conjunto las conclusio- nes son equivocas. Unas veces aparece una clara correlaci6n y otras ha sido imposible demostrarla. Varios factores pueden dar origen a esta confusion; el hecho de no haber encontrado diferencias en la frecuencia de uno de los ale- los deficitarios entre poblacién afectada y normal no quiere decir que no sea otro alelo de los menos frecuentes el que presenta la asociacion. Por otra parte también puede concurrir un alelo, ligado o no al primero, que acttie como protector. En el apartado dedicado al fenotipo acetilador ya se ha hecho referencia a la reaccién de la enzima N-acetiltransferasa con la incidencia de céncer de vejiga 0 colorrectal por exposici6n a arilaminas.LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 111 PREDISPOSICIONES DEBIDAS A DIFERENCIAS GENETICAS EN SENSIBILIDAD DEL TEJIDO Hemilisis debida a deficiencia de G6PD Esta anormalidad por déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, ligada al cromosoma X, predispone a los varones afectados a crisis hemoliticas por fragilidad del hematie, frente a sustancias oxidantes (medicamentos 0 conta- minantes nitroaromaticos 0 nitroamino derivados), naftaleno o consumo de habas. Hay grandes diferencias en la frecuencia del gen en distintas poblacio- nes, con variantes genéticas diferentes en individuos de raza blanca proceden- tes del drea mediterranea y negra de Africa. En ambos casos la frecuencia del gen aument6 porque conferia supervivencia frente a malaria en la infancia, porque el déficit consecuente de glutatién (GSH) impide el desarrollo del Plasmodium. La frecuencia en los varones de dichos grupos étnicos es del 10 al 30%, aunque no se han hecho suficientes estudios retrospectivos al res- pecto. Las sustancias oxidantes pueden también precipitar la aparicién de me- tahemoglobinemia y cianosis en personas deficientes de metahemoglobina re- ductasa. Los homocigotos padecen una metahemoglobinemia moderada con cianosis que se exacerba tras la exposicién. Los heterozigotos, mucho mas frecuentes, también son susceptibles. Alfa-1-antitripsina Otro factor implicado en el desarrollo de enfermedades pulmonares y qui- 24s del cncer pulmonar es la enzima alfa-1-antitripsina (AAT), que protege al tejido frente a la liberacin de elastasa por linfocitos y macrofagos durante la lesi6n pulmonar. La AAT es una proteina plasmatica de actividad proteolitica que consti- tuye el 90% de la fraccién a1 -globulina. La deficiencia total de esta proteina est& asociada con riesgo marcadamente alto de enfisema pulmonar por des- trucci6n de los espacios alveolares. El 0,8% de la poblacién occidental es homozigética para el alelo PiZ de- ficitario de la AAT; de ellos el 90% desarrolla enfisema pulmonar antes de los 50 afios y antes atin si ademas son fumadores. Los heterozigaticos, que constituyen un 3-5% de la poblacién son asintomaticos a no ser que sean fu- madores. Parece ser que la combinacion del genotipo heterozigotico y el ha- bito de furnar incrementa el riesgo, ya que incluso la inhalacién del humo de tabaco inhibe la acci6n de la enzima proteolitica en pulmén, dejandolo des- protegido ante la elastasa.112 TOXICOLOGIA AVANZADA Los portadores del gen deficitario pueden identificarse con un anticuerpo monoclonal de la forma Z de la AAT, lo que tiene una importante repercu- sién en medicina laboral, para poder excluir de trabajos en areas muy con- taminadas a los individuos homozigéticos para ese gen. Anemia falciforme Se debe a la presencia en el organismo de hemoglobina S, en la que en posicion 6 de la cadena B, la glutamina de la hemoglobina A es sustituida por una valina. Es el Gnico polimorfismo del que se sabe con seguridad que en la actua- lidad se encuentra en equilibrio estable. La situacién heterozigotica confiere resistencia frente a la malaria, pero existe controversia sobre si los individuos portadores de este rasgo presentan algiin tipo de predisposicién a la exposi- cién de sustancias quimicas, aunque se ha sospechado para nitro y amino- derivados, benceno, cadmio, plomo, CO, CN. También existe controversia respecto al riesgo que supone la baja tensién de oxigeno a altitudes elevadas. Reacciones de hipersensibilidad cutanea La diversa susceptibilidad para el desarrollo de reacciones de hipersensi- bilidad frente a sustancias como los diisocianatos, puede explicarse por con- sideraciones de determinaci6én genética de la respuesta inmune. En resumen, los conocimientos aportados por la Toxicogenética no sola- mente permiten profundizar en el esclarecimiento de los mecanismos que mo- dulan la toxicidad, sino que aportan nuevas bases para el establecimiento de los grupos de riesgo, la elaboracién de medidas preventivas y terapéuticas individualizadas y la reduccién de la incidencia de enfermedades en trabaja- dores y consumidores. GLOSARIO DE ALGUNOS TERMINOS GENETICOS UTILIZADOS — Alelo: Cada una de las formas que puede preentar un gen en un locus determinado. — Caracter dominante/recesivo: el fenémeno por el cual en el individuo heterozigoto s6lo se manifiesta uno de los caracteres se denomina do- minancia. El caracter es entonces dominante respecto del otro, rece- sivo. — Distribucién unimodal: un caracter poligénico presenta en la poblacién una distribucion continua de fenotipos cuantitativamente distintos.LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 113, — Distribucion polimodal: Un caracter monogénico presenta en la pobla- cién una distribucién discontinua, con tantos fenotipos cualitativa- mente distintos como alelos diferentes presente el gen. — Fenotipo: Manifestacién externa de la expresién del genotipo. — Gen: Factor heredado que determina una caracteristica biolégica de un organismo. Es un segmento de ADN implicado en la produccién de una cadena polipeptidica; incluye regiones que preceden y que si- guen a la regién codificante (intrones) y segmentos codificantes (exo- nes). — Gen autosémico: gen cuyo locus se encuentra en un cromosoma no sexual (autosoma). — Genoma: Conjunto de los genes de un individuo. — Genotipo: Constitucién genética especifica de un individuo. — Heterozigético: Individuo portador de alelos distintos en los corres pondientes loci de los cromosomas homélagos — Homozigético: Individuo portador del mismo alelo en los correspon- dientes loci de los cromosomas homélogos. — Isoenzimas: variante de una misma enzima que coexisten en un mismo individuo debido a la existencia en el genoma de genes diferentes, que codifican cada una de ellas. — Ligamiento: Tendencia de los genes a heredarse juntos, como resul- tado de su localizacién en el mismo cromosoma. — Locus, loci: Posicién dentro del cromosoma en el que reside un gen determinado. — Monogénico: Se refiere a aquellos caracteres cuya manifestacién esté regida por un solo gen. — Poligénico: Se refiere a aquellos caracteres cuya manifestacién de- pende de la expresion combinada de varios gene: — Polimorfismo: Aparicién simultanea en la poblacién de genomas que muestran las distintas variantes alélicas de un mismo gen. — Zigoto: Se produce por la fusién de dos gametos. BIBLIOGRAFIA Autrup H, Grafstrém R, Vahakangas K, Harris CC. Interindividual variations in carcinogen metabolism. Arch Toxicol Suppl, 1986. 9, 147-153 Agarwal DP, Goedde HW. Pharmacogenetics of alcohol dehydrogenase. En: Ka- low W (ed.), Pharmecogenetics of drug metabolism, Oxford, Pergamon Press, 1992. Bartsch H, Castegnaro M, Rojas M, Camus AM, Alexandrov K, Lang M. Expres- sion of pulmonary cytochrome P-450 1A1 and carcinogen DNA adduct for-114 TOXICOLOGIA AVANZADA. mation in high risk subject for tobaccorelated lung cancer. Tox Letters, 1992, 64/65, 477-483. Boobis AR. Molecular basis for differences in susceptibility to toxicants: introduc: tion, Tox Letters, 1992, 64/65, 193-113, Calabrese EJ, Canada AT. Catalase: its role in xenobiotic detoxication. En: Kalow W (ed.), Pharmatogenetics of drug metabolism. Oxford, Pergamon Press, 1992. Canada AT, Calabrese EJ. Superoxide dismutase: its role in xenobiotic detoxica tion. En: Kalow W (ed.) Pharmacogenetics of drug metabolism. Oxford, Perga: mon Press, 1992. Cavalli-Sforza LL, Bodmer WF. En: The genetics of human populations. WH Free- man & Co. San Francisco, 1971 Diepgen TL, Geldmacher M, Mallinckrodt T. Interethnic differences in the detoxi- fication of organophosphates: The human serum paraoxonase polymorphism. Arch Toxicol Suppl, 1986, 9, 154-158. Eichelbaum M, Spannbrucker N, Steincke B, Dengler HJ. Defective N-oxidation of sparteine in man: A new pharmacogenetic defect. Eur J Clin Pharmacol, 1979, 16, 183-187. Eichelbaum M. Defective oxidation of drugs: Pharmacokinetic and therapeutic im- plications. Clinical Pharmacokinetics, 1982, 7, 1-22. Eichelbaum M, Kroemer HK, Mikus G. Genetically determined differences in drug metabolism as a risk factor in drug toxicity. Tox Letters, 1992, 64/65, 115: 122 Fonne R, Meyer UA. Mechanisms of phenobarbital-type induction of cytochrome P-450 isozymes. Pharmac Ther, 1987, 33, 19-22 Ford EB. Polymorphism and taxonomy. En: Huxley J (ed.), The new systematics Oxford, Clarendon Press, 1940. Ford EB. Polymorphism. Biol Rev, 1945, 20, 73-88. Garrod AE. Inborn errors of metabolism. Oxford, University Press, 1909. Geldmacher M, Mallinckrodt V, Diepgen TL, Duhme C, Hommel G. A study of the polymorphism and ethnic distribution differences of human serum paraoxo- nase. Am J Phys Anthropol, 1983, 62, 235-241 Gennari K, Wermuth B, Muellener D, Ehrig T, von Wartburg J-P. Genotyping of human class | alcohol dehydrogenase. FEBS leeters 1988, 228(1), 305-309. Goedde HW, Singh S, Agarval DP, Fritze G, Stapel K, Paik YK. Genotyping of mitocondrial aldehyde dehydrogenase in blood samples using allete-especific oligonucleotides: comparison with phenotyping of hair roots. Hum-Genet, 1989, 81, 305-307. Grandjean P. Individual susceptibility to toxicity. Tox Letters, 1992, 64/65, 43- 51 Guengerich FP, Distlerath LM, Reilly PEB, Wolff T, Shimada T, Umbenhauer DR, Martin MV. Human-liver cytochrome P-450 involved in polymorphisms of drug oxidation. Xenobiotica, 1986, 16, 5, 367-378. Guengerich FP, Umbenhauer DR, Churchill PF, Baume PH, Bécker R, Knodell RG, Martin MV, Lloyd RS. Polimorphism of human cytochrome P-450. Xenobio- tica, 1987, 17, 3, 311-316.LOS POLIMORFISMOS GENETICOS COMO CAUSA DE VARIABILIDAD INDIVIDUAL... 115 Haldane JBS. The biochemistry of genetics. London, Allan and Union, 1954. Hart RW, Fishbein L. Interespecies extrapolation of drug and genetic toxicity data. En: Clayson DB, Krewski D, Munro J (eds.), Toxicological Risk Assessment. Vol I. Florida, CRC Press, 1985. Hein DW, Rustan TD, Doll MA, Bucher KD, Gray K. Acetyltransferases and suscept 64/65, 123-130. Hinton RH, Grasso P. Hepatotoxicity. En: Ballantyne B, Marrs T, Turner P, Ge. neral and applied toxicology, Vol. 1, New York, Stockton Press, 1993, Jackson PR, Tucker GT. Pharmacokinetic-pharmacogenetic modelling in the detec- tion of polymorphisms in xenobiotic metabolism. Ann Occup Hyg, 1990, 34 (6), 653-662. Johnson MK. The target for initiation of delayed neurotoxicity by organophosp- horous esters. Biochemical studies and toxicological application. Rev Biochem Toxicol, 1982, 4: 141-212 Kalow W. The metabolism of xenobiotics in different populations. Can J Physiol Pharmacol, 1982a, 60, 1-12. Kalow W. Ethnic differences in drug metabolism. Clin Pharmacokinet, 1982b, 7, 373-400. Kawajiri K, Nakachi K, Imai K, Yoshii A. Identification of genetically high risk in- dividuals to lung cancer by DNA polymorphisms of the cytochrome P-450 1A1 gene. FEBS letters, 1990, 263, 131-133. Mahgoub A, Idel JR, Dring LG, Lancaster R, Smith RL. Polymorphic hydroxyla- tion of debrisoquine in man. Lancet, 1977, 584-586. Mashimo M, Suzuki T, Abe M, Deguchi T. Molecular genotyping of N-acetylation polymorphism to predict phenotype. Hum Genet, 1992, 90, 139-143. Mitchell JR, Throgeirsson UP, Black M. Increased incidence of isoniacid hepatitis in rapid acetylators: possible relation to hydrazine metabolites. Clin Pharmacol Ther, 1975, 70-79. Mutch E, Blain PG, Williams FM. Interindividual Variations in enzymes controlling organophosphate toxicity in man. Hum Exp Toxicol, 1992, 11, 109-116. Nakachi K, Imai K, Hayashi S, Watanabe J. Genetic susceptibylity to squamous cell carcinoma of the lung in relation to cigarette smoking rate. Cancer Res, 1991, 41, 5177-5180. Nebert DW, Jaiswal AK. Human drug metabolism polymorphism: Use of recom- binant DNA Techniques. Pharmac Ther, 1987, 33, 11-17. Nebert DW, Adesnik M, Coon Md, Estabrook RW, Gonzalez FJ, Guengerich FP, Gunsalus IC, Johnson EF, Kemper B, Levin, W, Philips IR, Sato R, Waterman MR. The P450 gene superfamily: recommended nomenclature, DNA, 1987, 6, 111. Omenn GS. Predictive identification of hypersusceptible individuals. J Occup Med, 1982, 21, 5, 369-374. Probst MR, Blum M, Fasshaner I. The role of the human acetylation polymorphism in the metabolic activation of the food carcinogen 2-amino-3 methylimidazol [4,5+f] quinoline (IQ). Carcinogenesis, 1992, 13 (10), 1713-1717 erqusson RJ, Feng Y, Furman EJ, ty to chemicals. Tox letters, 1992,118 TOXICOLOGIA AVANZADA Simon B, De Looze S, Ronai A, Von Deimling O. Identification of rat liver car- boxylesterase isozymes using polyacrylamide gel electrophoresis and isoelec: tric focusing. Electrophoresis, 1985, 6, 575-582. Smith RL. Polymorphism in drug metabolism. Implications for drug toxicity. Ach Toxicol Suppl, 1986, 9, 138-146. Vessell ES. Genetic and environmental factors causing variation in drug response. Mutation Res, 1991, 241-257. Vogel S. Moderne Probleme der Humangenetik. Ergeb Inn Med Kinderheilk, 1959, 12, 52-125.capitulo 5 Implicaciones toxicolégicas de las enzimas colinesterasas PILAR SANZ y MANUEL REPETTO Introduccion » Caracteristicas bioquimicas « Mecanismos de accion y funciones fisiologicas « Inhi de las colinesterasas « Reactivacion de la enzima inhibida ¢ Estimulaci6n de la actividad colinesterasica * Acciones de los medicamentos « Referencias fisiopatoldgicas y clinicas * Determinaci6n analitica INTRODUCCION La primera sugerencia sobre la existencia de un factor capaz de hidrolizar la acetilcolina fue realizada por Dale en 1914; su implicacién en la funcién nerviosa se debe a Loewi y Navratil (1921). Este factor que hidrolizaba los ésteres de la colina recibié el nombre de colinesterasa por Stedman et al. (1932) que encontré actividad colinesterasica en sangre; posteriormente se distinguié la existencia de al menos dos enzimas distintas, una en eritrocitos (colinesterasa verdadera o acetilcolinesterasa) y otra en suero (pseudocolines- terasa). Se ha investigado mucho desde entonces sobre las funciones de esta en- zima en situaciones fisiolégicas y patolégicas, aunque la cantidad de publica- ciones y la frecuencia de interpretaciones contradictorias revela que atin queda mucho por clarificar en el tema. En una revisién que hemos realizado a cerca de 2.500 publicaciones re- lacionadas, aparecidas en los 10 diltimos afios, 430 trabajos estan dedicados a caracteristicas bioquimicas, moleculares y genéticas; 1.147 a estudios de in- terés clinico: intoxicaciones por inhibidores, modificaciones de la actividad por farmacos o productos industriales, factores biolégicos de variacion, partici- paci6n en diferentes patologias (malnutricin, anormalidades del metabolismo lipidico, enfermedad de Alzheimer, Parkinson, algunos trastornos psiquidtri- a7aa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.aa You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing limit for this book.120 TOXICOLOGIA AVANZADA que a otros ésteres que no son de este aminoacido; difieren de otras enzimas de su grupo por una marcada afinidad por sales de amonio cuaternario; sus sustratos mas importantes son acetilcolina, butirilcolina, succinilcolina y ben- zoilcolina, entre otros. Las colinesterasas constituyen una familia de esterasas caracterizadas por contener un resto de serina en el sitio activo y se distinguen de otras colines- terasas inespecificas por su capacidad de ser inhibidas por eserina a concen- traciones de 10°°M. Distinguiremos a la acetilcolinesterasa (AChE) y a la colinesterasa (ChE), ambas se encuentran en cerebro, miisculo y sangre. En el plasma sélo se halla la ChE y en los eritrocitos exclusivamente la AChE. Las caracteristicas ciné- ticas de estas dos enzimas han servido de base para la clasificacion de las enzimas tisulares. El Gnico sustrato natural de la acetilcolinesterasa, AChE, (E.C.3.1.1.7) es la acetilcolina, a la que hidroliza mucho mas rapidamente que a la butirilco- lina, aunque también hidroliza a la propionilcolina, a la B-metilacetilcolina y a los andlogos tiocolina de los tres compuestos. La colinesterasa del plasma, ChE, (E.C.3.1.1.8) se conoce como pseudo- colinesterasa, butiril o succinilcolin esterasa, y se separa en la fraccién IV en el fraccionamiento proteico del plasma sanguineo. Esta enzima no acttia so- bre la metilacetilcolina, lo cual nos ayuda a una diferenciacién rapida de am- bas. La ChE no solamente hidroliza a la butirilcolina cuatro veces més rapi- damente que a la acetilcolina, sino que acttia ademés sobre sus tioderivados y otros ésteres de colina y de alcoholes. También la benzoilcolina es un sus- trato especifico de la ChE que no es hidrolizado por la enzima eritrocitaria. Otra forma de distinguir ambas enzimas es por sus inhibidores. La ChE es inhibida por la quinina, el atoxilo y el Iso-OMPA (tetraisopropil-pirofosfo- ramida) que no influyen sobre la AChE. Inhibidores especificos de ambas y que no afectan a otras esterasas son, en cambio, la fisostigmina y alcaloides de su grupo asi como los carbamatos y compuestos organofosforados de apli- cacion como plaquicidas y como gases de guerra de acci6n nerviosa. La ChE es mucho més sensible a la inhibicion por tetramonoisopropilfosfotetramida que la AChE, lo que también tiene interés diferencial. Hemos visto que la primera sugerencia sobre la existencia en los sueros sanguineos de una enzima hidrolitica capaz de hidrolizar los ésteres de colina y de tiocolina data de 1914, realizada por Sir Henry Dale. Loewi, en 1921, demostr6 que la estimulaci6n del vago en corazén aislado de rana produce la liberacién de una sustancia que origina el mismo efecto que la accién debida al nervio, y reconocié que esta «sustancia vagal» era un derivado de la colina. Poco después, en el mismo afio 1921, Loewi y Navratil vieron que no habia diferencia entre esta «sustancia vagal» y la acetilcolina, Es mas, ambas se inactivaban con extractos acuosos del coraz6n de la rana. Esta actividad des-122 TOXICOLOGIA AVANZADA Por xenobidticos o por distintos estados patolégicos no estan correlaciona- das. La AChE, cuya estructura, mecanismo de accién y determinacién gené- tica es muy constante en todo el reino animal, se encuentra en mamiferos y en el hombre fundamentalmente en sistema nervioso central y placa motora, asi como en eritrocitos; también en rifién, pancreas, bazo, higado, linfocitos, etc. La ChE se localiza principalmente en misculo liso, higado, adipocitos y plasma. No obstante, en algunos tejidos se pueden encontrar ambas enzimas y, como ocurre en el rifién, con distribucion algo diferente entre glomérulo y tGbulo, segiin las especies. También se ha determinado la presencia simulté- nea de actividad acetilcolinesterdsica y butirilcolinesterdsica en sistema ner- vioso tanto central como periférico; coexisten igualmente en placa motora. La AChE se localiza en sustancia gris y la ChE parece més bien ligada a la sustancia blanca. La AChE es una glucoproteina, con un 15 % de su peso en carbohidra- tos, que se distribuye de forma desigual en las distintas regiones cerebrales. Tanto en animales como en el hombre se encuentra acumulada en el locus ceruleus, donde por otra parte no hay evidencia de actividad colinérgica. La distribucion y actividad en animales son diferentes segiin la edad, aumenta tras el nacimiento y disminuye en la edad adulta. En humanos la actividad de la colinesterasa también varia con la edad del individuo, asi la ChE plasmé- tica disminuye en el hombre y aumenta en la mujer. Este hecho puede en parte estar en relacién con una diferente actividad nerviosa y por otra parte por una posible relaci6n con procesos morfogenéticos. De hecho, la actividad de la AChE disminuye en fluido amni6tico a medida que avanza la gestacién, mientras que aumenta la actividad cerebral en el feto. También es heterogénea la distribucién subcelular de la AChE, aunque en general esta ligada a fracciones de membrana, presentando un desarrollo on- togénico diferente en las distintas regiones cerebrales, mas temprano en las regiones més caudales. En el interior de las neuronas, la mayor parte se encuentra inmovilizada en la membrana y un pequefio porcentaje (15 %) sufre movimiento axonal fundamentalmente distal rapido. La diferente distribucién tanto tisular como celular, asi como a lo largo del desarrollo, esta relacionada con las distintas conformaciones en que puede encontrarse la estructura cuaternaria de la AChE. Efectivamente la AChE puede presentarse como monémero (G1, coefi- ciente de sedimentaci6n 4S), dimero (G2), o tetramero (G4, 10S), todos ellos globulares, y también como agregados asimétricos (A4, A8 o A12, 16S) cuya caractertstica principal es poseer una cola de anclaje a la lamina basal.IMPLICACIONES TOXICOLOGICAS DE LAS ENZIMAS COLINESTERASAS 121 tructora se eliminaba de los extractos por calentamiento, lo que sugeria una naturaleza quizés enzimética, demostrada de forma concluyente por Engelhardt y Loewi en 1930. Stedman et al. propusieron en 1932 el nom- bre de colinesterasa para la enzima que hidrolizaba los ésteres de colina; a partir de entonces adquirié una gran importancia en la explicacion de la transmisi6n del impulso nervioso ya que se reconocié que esta enzima, al hidrolizar la acetilcolina liberada en Ja placa motora, permitia a la fibra ner- viosa acomodarse para recibir el proximo impulso. En aquella época fue légico atribuir a esta misma enzima la capacidad del suero de hidrolizar la acetilcolina. Los primeros trabajos experimentales se realizaron con colinesterasa plas- mitica humana y de caballo. Se vid que los eritrocitos presentaban también un efecto hidrolizante de la acetilcolina, por lo que surgié la cuestién de si las actividades eritrocitaria y plasmatica eran idénticas. El conocimiento de que se trataba de enzimas diferentes data de 1940 con Alles y Hawes. Estos au- tores demostraron que la actividad eritrocitaria era mayor a bajas concentra- ciones de acetilcolina y se inhibia por un exceso de sustrato natural, mientras que la plastica aumentaba con concentraciones crecientes de sustrato y no se llegaba a inhibir. Mendel y su grupo comprobaron en 1943 que la enzima eritrocitaria es especifica para acetilcolina y no hidroliza ésteres alifaticos de tributirina y me- tilbutirato. La enzima sérica es, por otra parte, capaz de hidrolizar a otros ésteres de la colina ademés de a la acetilcolina. En 1943 Mendel y Rudney denominaron colinesterasa

You might also like

• The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  

  From Everand

  The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  Mark Manson

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (5794)
• The 7 Habits of Highly Effective People

  

  From Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People

  Stephen R. Covey

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (353)
• The Art of War: A New Translation

  

  From Everand

  The Art of War: A New Translation

  Sun Tzu

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (3044)
• • Magazines
  • Podcasts
  • Sheet music
• The Iliad: The Fitzgerald Translation

  

  From Everand

  The Iliad: The Fitzgerald Translation

  Robert Fitzgerald

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (5341)
• The Odyssey: (The Stephen Mitchell Translation)

  

  From Everand

  The Odyssey: (The Stephen Mitchell Translation)

  Stephen Mitchell

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (7769)
• The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  

  From Everand

  The Subtle Art of Not Giving a F*ck: A Counterintuitive Approach to Living a Good Life

  Mark Manson

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (20001)
• Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  

  From Everand

  Pride and Prejudice: Bestsellers and famous Books

  Jane Austen

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (19653)
• The Handmaid's Tale

  

  From Everand

  The Handmaid's Tale

  Margaret Atwood

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (13185)
• Oscar Wilde: The Unrepentant Years

  

  From Everand

  Oscar Wilde: The Unrepentant Years

  Nicholas Frankel

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (10242)
• Art of War: The Definitive Interpretation of Sun Tzu's Classic Book of Strategy

  

  From Everand

  Art of War: The Definitive Interpretation of Sun Tzu's Classic Book of Strategy

  Stephen F. Kaufman

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (3321)
• Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  

  From Everand

  Never Split the Difference: Negotiating As If Your Life Depended On It

  Chris Voss

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (3269)
• The Picture of Dorian Gray (The Original 1890 Uncensored Edition + The Expanded and Revised 1891 Edition)

  

  From Everand

  The Picture of Dorian Gray (The Original 1890 Uncensored Edition + The Expanded and Revised 1891 Edition)

  Oscar Wilde

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (9054)
• Anna Karenina: Bestsellers and famous Books

  

  From Everand

  Anna Karenina: Bestsellers and famous Books

  Leo Tolstoy

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (7086)
• The 7 Habits of Highly Effective People

  

  From Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People

  Stephen R. Covey

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (2564)
• The Hobbit

  

  From Everand

  The Hobbit

  J. R. R. Tolkien

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (24727)
• Freakonomics Rev Ed

  

  From Everand

  Freakonomics Rev Ed

  Steven D. Levitt

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (7837)
• Habit 3 Put First Things First: The Habit of Integrity and Execution

  

  From Everand

  Habit 3 Put First Things First: The Habit of Integrity and Execution

  Stephen R. Covey

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (2506)
• American Gods: The Tenth Anniversary Edition

  

  From Everand

  American Gods: The Tenth Anniversary Edition

  Neil Gaiman

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (12942)
• Habit 6 Synergize: The Habit of Creative Cooperation

  

  From Everand

  Habit 6 Synergize: The Habit of Creative Cooperation

  Stephen R. Covey

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (2499)
• The 7 Habits of Highly Effective People: The Infographics Edition

  

  From Everand

  The 7 Habits of Highly Effective People: The Infographics Edition

  Stephen R Covey

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (2475)
• Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  

  From Everand

  Wuthering Heights (Seasons Edition -- Winter)

  Emily Brontë

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (9486)
• The Picture of Dorian Gray: Classic Tales Edition

  

  From Everand

  The Picture of Dorian Gray: Classic Tales Edition

  Oscar Wilde

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (9752)
• The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  

  From Everand

  The Iliad: A New Translation by Caroline Alexander

  Homer

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (5700)
• How To Win Friends And Influence People

  

  From Everand

  How To Win Friends And Influence People

  Dale Carnegie

  Rating: 4.5 out of 5 stars

  4.5/5 (6509)
• Life of Pi: A Novel

  

  From Everand

  Life of Pi: A Novel

  Yann Martel

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (13455)
• The Iliad of Homer

  

  From Everand

  The Iliad of Homer

  Alexander Pope

  Rating: 4 out of 5 stars

  4/5 (5143)