GASTROENTEROLOGIA

TITULO : Apoptosis Versus Necrosis Oncótica en Isquemia Hepática
y Daño por Reperfusión
AUTOR : Jaeschke H y Lemasters JJ
TITULO ORIGINAL: [Apoptosis Versus Oncotic Necrosis in Hepatic
Ischemia/Reperfusion Injury]
CITA: Gastroenterology 125(4):1246-1257, Oct 2003
MICRO : La isquemia hepática fría y caliente seguida de reperfusión
induce muerte celular. Aunque el proceso involucra esencialmente
necrosis, la investigación reciente también encontró evidencia de
apoptosis en esta situación.

Introducción

La isquemia hepática y el daño por reperfusión ocurren en
numerosas situaciones patológicas, entre ellas cirugía de hígado,
preservación del órgano para posterior trasplante, enfermedad
venooclusiva e insuficiencia cardíaca. En la fisiopatología del
trastorno intervienen diversos mecanismos. Aunque el daño
isquémico es per se causa de muerte celular, la lesión no se
manifiesta hasta que el órgano sufre reperfusión.
La producción de radicales libres de oxígeno -superóxido, peróxido
de hidrógeno y radicales hidroxilo- se involucra en la lesión desde
hace largo tiempo pero también se sabe que otros mecanismos que
no dependen del oxígeno, por ejemplo el pH, contribuyen a la
aparición de daño tisular. Las respuestas inflamatorias y los
problemas en la microcirculación agravan aun más la situación luego
de la reperfusión. La isquemia se asocia con activación de las células

Justo antes de la muerte celular. Las células activadas luego de la reperfusión generan especies reactivas de oxígeno. fenómeno que prolonga la isquemia en ciertas áreas del órgano luego de la reperfusión. Los cambios histológicos se . redondeamiento de las mitocondrias y formación de protrusiones en la membrana (burbujas). proteasas y otras enzimas de degradación tisular. Estas últimas son consecuencia de la falta de ATP y es probable que representen la respuesta a alteraciones del volumen celular y del citoesqueleto. edema y liberación de solutos aniónicos. unión de las burbujas.de Kupffer. la vasoconstricción de sinusoides inducida por endotelina-1 promueve el cierre heterogéneo de múltiples vasos. la muerte por necrosis persiste durante bastante tiempo. Los mediadores inflamatorios. La muerte ocurre porque se altera la función de barrera de la membrana celular y se liberan enzimas y otros elementos. quemoquinas y otros mediadores que contribuyen a la lesión tisular posterior a la isquemia. la formación de protrusiones revierte rápidamente luego de la reoxigenación. alteración de los lisosomas. Necrosis oncótica (oncosis) en el daño por isquemia y reperfusión La primera consecuencia de la isquemia del hígado y de la mayoría de los órganos sólidos es la pérdida de la síntesis mitocondrial de adenosín trifosfato (ATP). Además. dilatación del retículo endoplásmico. Cuando hubo isquemia de corta duración. citoquinas proinflamatorias. los hepatocitos y las células sinusoidales presentan un estado metaestable caracterizado por la permeabilización de las mitocondrias. entre ellos factores de complemento activado. Muchos de los mecanismos mencionados son causa de necrosis oncótica. reclutan neutrófilos en el hígado que producen más radicales libres. pero los trabajos recientes indican que en tejidos dañados por isquemia y reperfusión las células también mueren por apoptosis. La depleción de ATP se asocia con edema celular. con la respuesta sistémica y con la falla de múltiples órganos. macrófagos residentes en el hígado. En cambio. La abertura de los canales aniónicos sensibles a glicina que transportan cloro y otros aniones orgánicos inician el estado metaestable y la fase de edema osmótico.

los macrófagos eliminan gradualmente los restos de tejido necrótico. Sin embargo. En la descripción original de apoptosis. marginación de la cromatina y fragmentación del núcleo y del citoplasma en cuerpos apoptóticos que son fagocitados. Sin embargo. Las caspasas son esenciales en este evento. En la apoptosis clásica no hay liberación del contenido intracelular ni respuesta inflamatoria. Hallazgos morfológicos de la apoptosis Las características morfológicas típicas incluyen condensación del núcleo. El mecanismo por el cual se liberan estas proteínas . Entre estos factores. Una amplia variedad de mediadores. las organelas permanecen morfológicamente normales. Estos factores proapoptσticos se unen a los receptores respectivos. cambios en el retículo endoplásmico y otras modificaciones citoplasmáticas. ocurre necrosis en forma secundaria. cabe recordar la enzima citocromo c y el factor inductor de apoptosis que se ubican en el espacio entre las membranas interna y externa de las mitocondrias. por ende.conocen como necrosis. entre ellos factor de necrosis tumoral (TNF)-α y ligando del Fas. activan la llamada vνa extrνnseca de apoptosis. En forma típica. a diferencia de lo que se registra en la necrosis. este tipo de muerte celular afecta células individuales en un determinado órgano. En ciertas condiciones la apoptosis no se completa y. en los hepatocitos la señal proveniente del receptor requiere amplificación mitocondrial con la liberación de factores solubles con capacidad de activación de caspasas. fenómeno que en definitiva inicia las señales intracelulares necesarias para que comience el proceso de muerte celular. La liberación de contenidos celulares también inicia una respuesta inflamatoria durante la reperfusión. Mecanismos de señalización en la apoptosis hepatocelular Durante la última década se produjo un notable avance en la comprensión de los mecanismos de señalización intracelular. estudios más recientes indican que durante la apoptosis también hay edema mitocondrial. Con el tiempo. que es reemplazado por tejido cicatrizal.

En general la vía 2 de señalización apoptótica a través de los cambios mitocondriales. ruptura de la membrana externa y liberación de proteínas del espacio entre ambas membranas. inicia el proceso final de la apoptosis: contracción celular. Esta enzima. Este complejo.aún está en discusión. con ATP y con la procaspasa 9. como se observa en hepatocitos. Como consecuencia de este proceso se produce edema de mitocondrias. Esta última. marcación con anexina B (por la exposición de la fosfatidil . forma un complejo con el factor 1 activador de apoptosis. externalización de la fosfatidilserina. denominado apoptosoma. al actuar sobre varios sustratos. marginación de cromatina y lobulación nuclear. luego de ser liberada. En los hepatocitos. Una tercera vía de apoptosis es la denominada intrínseca que puede o no involucrar la expresión del gen de p53. afirman los autores. hidrólisis internucleosomal del ADN. La proteína Bcl-2 y otros miembros antiapoptóticos de esta familia bloquean la liberación de citocromo c. el TNF-α y el Fas promueven el inicio de lamitochondrial permeability transition (MPT) a partir de la apertura de un poro de alta conducción para solutos con peso molecular de aproximadamente 1 500 daltons. burbujas superficiales. aunque en forma más lenta que por la vía 1. En este caso no se observa despolarización mitocondrial. todavía ocurre activación de la caspasa 3 y de la apoptosis. Western blot. fragmenta enzimáticamente la caspasa 9 que. La apoptosis puede detectarse in vitro e in vivo mediante ensayos enzimáticos. es más rápida que la vía 1 y está mejor regulada. MTP o liberación de citocromo c. transforma la procaspasa 3 en caspasa 3. cuando la vía 2 se bloquea por inhibición de la MPT mediante ciclosporina A. en definitiva. Valoración de apoptosis celular En la medida que se comprenden mejor los mecanismos que intervienen en este tipo de muerte celular se producen nuevos métodos para la identificación del proceso. Sin embargo.

Las observaciones en conjunto sugieren hidrólisis posnecrótica del ADN. De hecho. la apoptosis involucra una serie de eventos y ninguno de ellos es único a esta forma de muerte celular. La necrosis también induce fragmentación del ADN aunque no internucleosomal. Aun así. el edema y la liberación de citocromo c también se observan durante la necrosis. el método más confiable para identificar apoptosis consiste en la visualización de cambios morfológicos. cerebro y otros órganos también hay evidencia de apoptosis posisquémica. un indicador de necrosis oncótica. En la electroforesis en gel este corte se refleja en muchos fragmentos de distinto peso molecular y no con el patrón en escalera característico de la apoptosis. En particular. . no todas las formas de apoptosis requieren la activación de la caspasa 3. liberación de citocromo c y criterios morfológicos. la despolarización mitocondrial. Tal vez la activación de la caspasa 3 sea el paso más específico para distinguir entre apoptosis y necrosis. durante la apoptosis se produce fragmentación del ADN con un patrón específico en la corrida electroforética (patrón en escalera). luego de la reperfusión del hígado mantenido para trasplante. la marcación TUNEL también ocurre durante la necrosis y en la muerte celular necrótica inducida por tóxicos.serina). probablemente por la activación de endonucleasas dependientes de calcio. coloración vital. las mismas células con marcación TUNEL -presuntamente un indicador específico de apoptosis. Apoptosis durante la isquemia y reperfusión hepática El primer registro de apoptosis en este contexto es de 1996. Sin embargo. Asimismo. Otro procedimiento ampliamente usado es la detección de la fragmentación enzimática del ADN mediante la marcación de regiones de doble cadena (técnica TUNEL). En corazón. añaden los autores.también se marcan con azul trípano. En general. No obstante. en la necrosis también se ha descrito esta última forma de fragmentación. De hecho. en hígado y otros tejidos.

en definitiva. En los primeros minutos de la reperfusión también se inicia la muerte por necrosis. . La inhibición de caspasas atenúa considerablemente la apoptosis inducida por isquemia fría y caliente. durante la isquemia fría. es que la apoptosis sólo afecta células individuales. durante la apoptosis inducida por Fas y por TNF-α. la protección es sólo moderada. ocurre necrosis casi exclusivamente en las células endoteliales de las sinusoides. A pesar de que luego de la isquemia y reperfusión predomina la necrosis sobre la apoptosis. mientras que en la necrosis oncótica se comprometen áreas de células adyacentes. la actividad de la caspasa 3 aumenta 10 a 20 veces. Otro hallazgo interesante. que afecta aproximadamente entre el 15% y el 30% de los hepatocitos. fenσmenos casi ausentes en la muerte por isquemia y reperfusiσn. Luego de la isquemia fría en el contexto de la preservación del hígado para su posterior trasplante. Las células de Kupffer y las plaquetas inducen apoptosis en las células hepáticas a través de la liberación de TNF-α. el proceso se acompaña de poca liberación enzimática. Luego de la isquemia caliente. La apoptosis en un escenario patológico a menudo promueve inflamación que. varios grupos encontraron que los inhibidores de caspasas atenúan el daño. la apoptosis de células endoteliales y de hepatocitos luego de 45 a 120 minutos de isquemia caliente nunca excede el 2% de las células en riesgo. la muerte necrótica inducida por la reperfusión ocurre predominantemente en hepatocitos y se acompaña de la liberación de enzimas. amplía y acelera el daño tisular. Sin embargo. mientras que se observa necrosis en más del 90% de las células. En cambio. Asimismo.Luego de 60 minutos de isquemia caliente aumenta considerablemente el número de hepatocitos apoptóticos. añaden los autores. La magnitud de esta necrosis inducida por reperfusión se correlaciona bien con el fracaso del injerto luego del trasplante. aun cuando muchas de las células necróticas son TUNEL positivas. hay apoptosis de células endoteliales sinusoidales. Cuando se emplean criterios morfológicos estrictos en combinación con marcación TUNEL.

Este mecanismo de lesión dependiente del pH involucra el inicio de MPT. Los hepatocitos en apoptosis producen.Durante la infección por Listeria. a su vez. tiene la capacidad potencial de causar mayor lesión al contribuir a la respuesta inflamatoria. . Cuando esto ocurre las mitocondrias sufren permeabilización de la membrana interna. Luego del inicio de la MPT. Es por ello que aun cuando el proceso apoptótico per se se limite a un pequeño número de células. Los inhibidores de caspasas descienden la migración de polimorfonucleares hacia el hígado y atenúan el daño por reperfusión. la glucólisis anaeróbica y la hidrólisis de ATP se asocian con descenso rápido del pH que protege contra la necrosis a pesar de la depleción sustancial de ATP. La ciclosporina A también previene el proceso apoptótico tal como lo hacen los inhibidores de caspasas. la MPT es un paso obligado en ambos tipos de muerte celular luego del daño asociado con isquemia y reperfusión. La ciclosporina A. La recuperación del pH a la normalidad favorece y precipita la muerte celular en el daño por reperfusión. Se estima que sólo un 15% a un 20% del ATP es suficiente para evitar la muerte por necrosis. la alteración mitocondrial induce una depleción marcada de ATP y muerte celular por necrosis. Sin embargo. grandes cantidades de quemoquinas CXC que atraen más neutrófilos. la apoptosis hepatocelular induce reclutamiento de neutrófilos en el hígado. un inhibidor específico de la MPT. pueden existir en forma simultánea incluso compartir algunas de las vías de señalización. Por lo tanto. despolarización y edema. un fenómeno que se inhibe cuando el pH es inferior a 7. Durante la isquemia. evita los cambios mitocondriales inducidos por la MPT. En particular. en realidad. cuando se evita la necrosis mediante el uso de fructosa ocurre apoptosis dependiente de caspasa 3. la MPT interviene en forma importante en la necrosis oncótica así como en la apoptosis. Necroapoptosis Gran parte de la confusión en relación con el tipo de muerte involucrado en una determinada situación se debe a que los mecanismos apoptóticos y de necrosis han sido considerados independientes cuando.

Cuando se inicia la MPT se producen modificaciones mitocondriales. Asimismo. por ende. activación de la cascada de caspasas. Sin embargo. y viceversa. En esta situación. Este último interactúa con el factor 1 activador de apoptosis y promueve activación de la caspasa 9 que induce activación de la caspasa 3. apoptosis y necrosis. el daño hepático desencadenado por un ligando del receptor de Fas se asocia con liberación de citocromo c. está última puede derivar en necrosis si la depleción de ATP u otro cambio se asocia con la ruptura de la permeabilidad de la membrana mitocondrial. Así. En cambio. Es por ello que la presencia o ausencia de ATP puede actuar como un determinante de necrosis o de apoptosis. durante la lesión hepatocelular inducida por anticuerpos contra el Fas. La posibilidad de que el proceso apoptótico pase a necrosis. Cuando ocurre MPT en . indica que ambos eventos no son necesariamente independientes y algunos componentes se comparten. Esta necrosis secundaria ocurre. entre ellas la liberación de citocromo c. en hepatocitos expuestos a ionóforo de calcio. De esta forma. la apoptosis dependiente de ATP se inicia por la liberación de citocromo c luego del edema mitocondrial. con predominio de uno de ellos según el medio. las señales apoptóticas se bloquean a nivel del apoptosoma. por lo que se le ha dado el nombre de necroapoptosis o aponecrosis. en forma típica. la activación de la caspasa 9 dependiente de citocromo c requiere ATP. Cuando la reperfusión induce MPT y depleción de ATP. la cantidad de ATP necesaria para evitar la necrosis es más que suficiente para permitir la activación de las caspasas 3 y 9 dependiente de ATP. si se dispone de un sustrato para glucólisis se evita la depleción de ATP y no hay necrosis. el balance entre la depleción de ATP posterior a la MPT y a la generación de ATP por glucólisis determina qué tipo de muerte ocurrirá. fragmentación del ADN y cambios morfológicos característicos de la apoptosis antes de que se inicie la necrosis secundaria. si bien la necrosis puede pasar a apoptosis. En forma similar. la necrosis se produce como consecuencia directa de la falta de regeneración de ATP. La isquemia y reperfusión inducen MPT y. se ve que un evento mitocondrial es crucial en este contexto.

Conclusiones Es común que la necrosis y la apoptosis existan en forma simultánea en el contexto de ciertas situaciones tóxicas.sólo algunas mitocondrias se estimula la autofagia y las organelas alteradas son eliminadas en los lisosomas sin que se inicie la muerte celular. La investigación futura seguramente permitirá identificar si las células mueren predominantemente por apoptosis o necrosis y con ello diseñar nuevas . entonces hay necrosis oncótica. de hipoxia y de daño inflamatorio. Con daño mayor aun. Cuando el daño es mayor y hay más MPT ocurre apoptosis por la activación de caspasas dependiente de ATP. el ATP cae a niveles que no permiten que la apoptosis continúe.