CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN

Introduccin
1. Proceso Cromatografico
1.1Clasificacin de la Cromatografa lquida
2. Instrumentacin para cromatografa de lquidos
2.1. Caractersticas de las fases mviles y sistemas de
elucin.
2.2. Sistemas de bombeo.
2.3. Introduccin de la muestra.
2.4. Detectores.
2.4.1. Ultravioleta.
2.4.2. Arreglo de diodos.
2.4.3. Fluorescencia.
2.4.4. Electroqumicos.
2.4.5. ndice de refraccin
2.4.6. Conductividad.
INTRODUCCIN
En sus etapas iniciales, la cromatografa de lquidos se
desarrollaba en columnas de vidrio con dimetros de 1 a 5
cm, longitudes de 50 a 500 cm y dimetros de las partculas
de la fase estacionaria de 150 a 200 m. Los caudales de la
fase mvil eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de
mililitro por minuto. Esto traa como consecuencia que los
tiempos de separacin fueran largos (a menudo de varias
horas).
Se intent aplicar vaco pero los resultados no fueron
efectivos: Se aumentaba la altura del plato debido al aumento
del caudal, trayendo como consecuencia una menor eficacia.
Despus
de
muchas
investigaciones
los
cientficos
descubrieron que podan conseguir grandes aumentos en la
eficacia de la columna disminuyendo el tamao de las
partculas de los rellenos. Sin embargo, tuvieron que esperar
a que se desarrollara la tecnologa adecuada para producir y
utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10
m. Esta tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada
a la que en conjunto se le dio el nombre de cromatografa
de lquidos de alta resolucin (HPLC).
La cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) es la
tcnica de separacin ms utilizada. Las razones de su
extenso uso son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las
determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la
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separacin de especies no voltiles o termolbiles y,

sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de
primordial inters en la industria e investigaciones. Algunos
ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos,
protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,
drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides,
especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias
inorgnicas.
1. PROCESO CROMATOGRAFICO
La Cromatografa liquida de alta eficiencia es una tcnica de
elucin donde un lquido (fase mvil) entra en contacto con
un slido u otro liquido inmiscible (fase estacionaria) que se
encuentra en una columna. Al introducir la muestra problema
con las analitos que queremos separar en la fase mvil, cada
analito se desplazara a lo largo de la columna con una
velocidad diferente que depender de su afinidad por la fase
mvil o la fase estacionaria. Al final cuando la muestra
problema ha pasado por la columna, cada uno de los analitos
eluira con un tiempo diferente (separacin).
1.1. Clasificacin de la Cromatografa lquida
La Cromatografa lquida se clasifica en cuatro tipos con base
en la naturaleza de la fase estacionaria:
1) Cromatografa de adsorcin (liquido-solido): La fase
estacionaria es un adsorbente y la separacin se basa en
repetidas etapas de adsorcin-desorcin.
2) Cromatografa de reparto/adsorcin (fases ligadas
qumicamente): La separacin se basa en un reparto
del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
3) Cromatografa de intercambio inico: Se da cuando
la fase estacionaria presenta en su superficie grupos
ionizados capaces de retener selectivamente a iones de
signo opuesto que circulan en la fase mvil.
4) Cromatografa de exclusin molecular: La fase
estacionaria es un material poroso de tamao de poro
controlado, que permite la entrada de ciertas molculas
de manera selectiva dejando fuera otras de mayor
tamao.
5) Cromatografa de fase normal: La fase estacionaria
presenta puntos activos de alta polaridad y las
interacciones que se producen con el soluto son
especficas del grupo activo. La fase estacionaria puede
ser un slido adsorbente (slice o almina), o bien, un
soporte al que se unen qumicamente molculas
orgnicas que presentan grupos funcionales de lata
polaridad (Ciano, Amino).
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6) Cromatografa de fase reversa (inversa): La fase

estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas
hidrocarbonada, grupos fenilo) y las interacciones que se
producen son inespecficas (efecto solvofobo)
2. INSTRUMENTACIN PARA HPLC
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC se
presentan en la Fig 1 y son:
- Depsitos para la fase mvil.
- Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase
mvil.
- Dispositivo para la introduccin de la muestra.
- Columna cromatografa.
- Detector.
- Sistema para el tratamiento de datos y registrador.

Fig 1. Componentes de un equipo de HPLC

Algunas fases mviles usadas en HPLC son activas, como

cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los
componentes del sistema estn fabricados con materiales
resistentes a esos posibles ataques. La mayora de las partes
del cromatgrafo en contacto con la fase mvil suelen estar
fabricadas con acero inoxidable, previamente pasivado con
cido ntrico 6 M, de forma que en esas condiciones, su
superficie sea resistente al ataque de la mayora de los
disolventes, con excepcin del cido clorhdrico. Las mayores
ventajas del acero residen en su coste relativamente bajo, la
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facilidad para construir con l los distintos componentes y la

resistencia mecnica, lo que permite operar a presiones muy
elevadas.
En cromatografa de gases se haca necesario un control
bastante estricto de la temperatura de trabajo. Sin embargo,
en cromatografa lquida, este control no suele ser tan
necesario, debido a que la transmisin de calor del soluto
entre las fases mvil y estacionaria es mucho ms pequea.
Por ello, los cambios en la temperatura ejercen menos
influencia sobre el grado de retencin y la resolucin. Esto
hace que en muchas aplicaciones no sea necesario un control
estricto de esta variable y las columnas trabajen a
temperatura ambiente. De cualquier forma, es posible el
control de la temperatura mediante el empleo de hornos que
la regulan desde la del ambiente hasta 150 C.
2.1. Caractersticas de las fases mviles y sistemas de
elucin
Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil (y
las tuberas que la conduzcan) son inertes. Generalmente se
usan botellas de vidrio y tubos de tefln, provistos stos
ltimos de un sistema de filtros para eliminar cualquier
partcula que pueda contener la fase mvil.
Los disolventes ms utilizados en HPLC suelen ser agua,
disoluciones tampn acuosas y disolventes orgnicos tales
como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. Todos los
disolventes debern ser puros, exentos de partculas slidas y
desgasificados. Esto puede llevarse a cabo por filtracin a
vaco a travs de filtros de 0.220.45 m, o mediante el
burbujeo con un gas inerte muy poco soluble, como nitrgeno
o helio (ver Fig 2)

Fig2. Sistemas de desgasificacin y eliminacin de partculas

La des-gasificacin reduce la posibilidad de formacin de

burbujas en la vlvulas de las bombas y en los detectores.
Tambin reduce el ruido de fondo cuando se utiliza un
detector ultravioleta, y porque se evita la interferencia del
oxgeno disuelto en la deteccin fluorimtrica. Aunque la
separacin de muchas mezclas se lleva a cabo utilizando un
disolvente de composicin constante (elucin isocrtica), en
ocasiones se usa la elucin por gradiente, en la cual se
cambia la composicin de la fase mvil durante el
desarrollo del cromatograma. Con ello se consigue
aumentar la eficiencia de la separacin, con unos efectos
similares a los producidos por la programacin de
temperatura en cromatografa de gases.
2.2. Sistemas de bombeo
Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo,
debido al pequeo tamao de las partculas de la fase
estacionaria, es necesario utilizar bombas que proporcionen
un flujo aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo
usados en HPLC debern reunir las siguientes caractersticas:
- Estar construidos con materiales inertes a los
disolventes.
- Suministrar un flujo de eluyente libre de pulsaciones, en
el margen
comprendido entre 0.1 y 10 mL/min.
- Generar presiones superiores a 6000 psi (lb/in2)
- La mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan las
denominadas bombas recprocas, cuyo principio de
funcionamiento se ilustra en la fig 3. Estas bombas consisten
en un pistn de zafiro situado en el interior de una cmara de
volumen reducido (35400 L) que, alternativamente succiona
eluyente contenido en un depsito a baja presin y lo impulsa
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hacia la columna a presin alta, mediante un sistema de

vlvulas como el representado esquemticamente en la fig 3.
Con este dispositivo se consiguen presiones elevadas y se
suministra un caudal constante, pudindose adaptar
fcilmente a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su
pequeo volumen interno. Sin embargo, producen un flujo
pulsante que se ha de amortiguar convenientemente, para lo
cual se utiliza en ocasiones un sistema constituido por dos
pistones.

Fig. 3. Sistema de bombas reciprocas

2.3. Introduccin de la muestra
La introduccin de las muestras en la columna cromatogrfica
es frecuentemente el factor controlante de la reproducibilidad
de las medidas. Los volmenes a inyectar debern ser
pequeos, para evitar la sobrecarga de la columna y se ha de
introducir la muestra sin despresurizar el sistema. La forma
ms simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("
septum ") anlogo al utilizado en cromatografa de gases, si
bien este sistema est limitado a una presin mxima de
operacin de 1500 psi. El mtodo ms utilizado en HPLC
consiste en usar vlvulas de inyeccin con bucles de volumen
conocido, como el representado en la fig 4.

Fig. 4. Sistema de inyeccin de la muestra

En la posicin de llenado (figura 4 a.), la fase mvil pasa

directamente a la columna, y la muestra se introduce en el
bucle mediante una micro-jeringa. Una vez lleno el bucle, se
gira la vlvula a la posicin de inyeccin (fig 4 b.) en la que la
fase mvil impulsa la muestra hasta la columna. Un
inconveniente que presenta este sistema es que la precisin
de la inyeccin vara con el tamao del bucle.
2.4. DETECTORES

En HPLC los sistemas de deteccin se clasifican de la forma

siguiente:

Los detectores basados en una propiedad del soluto

responden a una propiedad fsica o fsico-qumica del soluto, y
que generalmente no la presenta la fase mvil. Estos
detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por
su parte, los detectores basados en una propiedad de la
disolucin comparan el cambio global de alguna propiedad
fsica de la fase mvil con y sin soluto eluido. Estos detectores
responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser
poco sensibles. Un detector ideal en HPLC deber reunir las
siguientes caractersticas:
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* Sensibilidad elevada.
* Buena estabilidad y reproducibilidad.
* Amplio margen de respuesta lineal.
* Pequeo tiempo de respuesta, independiente de la
velocidad de flujo.
* Pequeo volumen muerto, para minimizar el
ensanchamiento de las
bandas cromatogrficas.
* Insensible a cambios en la presin y la temperatura.
* Respuesta independiente de la composicin de la fase
mvil.
* No destructivo.
Los detectores que seguidamente se resean no cumplen
todas las caractersticas anteriores, pero, sin embargo,
resultan adecuados para la mayora de las aplicaciones
rutinarias en HPLC.
2.4.1.
Detectores de absorbancia ultravioleta
Los detectores de absorbancia ultravioleta (tambin visible)
son los ms utilizados en HPLC. Su fundamento es la
espectrofotometra
de
absorcin.
Para
adaptar
un
espectrofotmetro convencional a medidas en HPLC, la
modificacin ms importante es disear adecuadamente la
clula de flujo. Esta deber contener un volumen mnimo
(entre 1 y 10 L) y ser capaz de soportar presiones de varias
atmsferas. En la fig 5,se muestra esquemticamente una de
estas clulas, diseada en forma de Z.

Fig7. Detector UV.VIS

El detector ultravioleta ms sencillo utiliza la emisin intensa

a 254 nm de una lmpara de mercurio y la deteccin a una
sola longitud de onda. Se estima que casi las dos terceras
partes de los solutos orgnicos analizados por HPLC presentan
absorcin a esa longitud de onda, especialmente los
compuestos aromticos, los cuales tienen absortividades
molares del orden de 104.

En instrumentos ms verstiles se utiliza una lmpara de

deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de
onda variable. Cuando los picos estn suficientemente
separados, se puede elegir una longitud de onda para cada
pico, si bien, cuando se desean obtener los espectros
completos con fines de identificacin, puede pararse el flujo
durante el tiempo necesario para efectuar el barrido de
longitudes de onda, o bien, utilizar algn sistema de barrido
rpido, como el que se menciona seguidamente.
2.4.2.

Arreglo de diodos

Los detectores espectrofotomtricos ms potentes son los que

utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el espectro
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completo de cada soluto que pasa por el detector. En estos

dispositivos, toda la radiacin procedente de la fuente
(lmpara de deuterio) se hace pasar a travs de la muestra,
en lugar de seleccionar previamente una radiacin
determinada
con
un
monocromador
como
en
espectrofotometra convencional. La radiacin emergente de
la clula de flujo se dispersa por una red de difraccin
hologrfica en radiaciones monocromticas que se focalizan
simultneamente sobre un conjunto de fotodiodos constituido
por varios centenares de elementos fotosensibles y dispuestos
linealmente. Cuando la radiacin transmitida incide sobre los
fotodiodos, se genera una seal elctrica que se procesa para
dar datos de absorbancia, que representados en funcin de la
longitud de onda detectada por cada uno de los fotodiodos
origina el correspondiente espectro de absorcin. Este proceso
puede repetirse muchas veces por segundo, por lo que
pueden generarse una gran cantidad de datos experimentales
durante el tiempo que la muestra pasa por la clula.

Fig 8. Arreglo de diodos

Los datos de absorbancia se representan en funcin de la

longitud de onda y del tiempo, con lo que se obtienen grficos
como el representado en la fig 9, donde se muestra el mapa
espectral correspondiente a la separacin de los compuestos
1, 2 por HPLC.

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Fig9. Grafica espectro HPLC

2.4.3.

Fluorescencia

Algunos compuestos qumicos presentan propiedades

fluorescentes: absorben radiacin electromagntica de una
determinada longitud de onda y emiten radiacin fluorescente
a longitud de onda ms larga. Los sistemas cclicos de alto
grado de conjugacin
son fluorescentes. Ejemplo los
hidrocarburos
aromticos
polinucleares,
quinolenas,
esteroides, alcaloides, etc.
Para detectar las analitos
fluorescentes en HPLC se utilizan dispositivos semejantes en
diseo a los fluormetros y espectrofluormetros.

Fig.10. Detector fluorescencia

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En ellos, el detector se coloca perpendicularmente a la

direccin del haz de radiacin de excitacin (fig), la cual suele
originarse por una lmpara de xenn o deuterio y seleccionar
la longitud de onda adecuada mediante los correspondientes
filtros.

Los detectores de fluorescencia son sensibles, si bien,

responden solo a los analitos que tengan propiedades
fluorescentes. Con objeto de incrementar su aplicabilidad, es
posible comunicar fluorescencia a determinados analitos
mediante el uso de reactivos apropiados. Esta derivatizacin
puede realizarse en la muestra antes o despus
de la
columna. El proceso postcolumna
se lleva cabo en un
dispositivo donde el reactivo derivatizante se aade
continuamente al flujo que sale de la columna. Con
frecuencia, la reaccin qumica entre el reactivo y el analito
necesita un cierto tiempo para que ocurra, por lo cual suele
colocarse un bucle entre el punto de insercin del reactivo y el
detector.

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2.5. Electroqumicos
Los detectores electroqumicos son mejores que otros
mtodos de deteccin, debido a su especificidad, sensibilidad
y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos
orgnicos. Cualquier especie capaz de ser oxidada o reducida
sobre un electrodo es susceptible de deteccin por va
electroqumica. Por ejemplo, fenoles, aminas, perxidos y
mercaptanos pueden detectarse por oxidacin, mientras que
hidrocarburos
no
saturados,
cetonas,
aldehidos
y
nitrocompuestos aromticos pueden ponerse de manifiesto
mediante procesos de reduccin. Las tcnicas electroqumicas
ms utilizadas con esta finalidad son la amperometra,
voltamperometra y culombimetra.

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Fig 11. Electrodos electroqumicos

La configuracin bsica de un detector electroqumico se

representa en la fig 11, y consta de un dispositivo en el que se
incluyen un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y
uno auxiliar. En el detector amperomtrico se aplica un
determinado potencial al electrodo de trabajo y se mide la
intensidad de la corriente resultante de la reaccin
electroqumica que ocurra en dicho electrodo. La superficie de
este electrodo suele ser muy pequea (menor de 0.5 cm 2), por
lo que la electrlisis del analito es incompleta. Cuando se usan
electrodos de gran rea superficial, puede tener lugar una
reaccin cuantitativa sobre el electrodo, y entonces se tiene la
deteccin culombimtrica. Por su parte, la deteccin
voltamperomtrica (incluida la polarogrfica) implica la
aplicacin de un potencial variable al electrodo de trabajo
seguida de la medida de la intensidad de la corriente
resultante de la reaccin electrdica.
2.6. ndice de refraccin
El detector de ndice de refraccin es el que ms se aproxima
al detector universal ideal, ya que, en principio, el ndice de
refraccin (IR) de la fase mvil deber modificarse por la
presencia de cualquier soluto que tenga un ndice de
refraccin diferente de ella. Por ello, la comparacin del IR de
la fase mvil pura con el de los efluentes que salen de la
columna cromatogrfica, indicar la presencia de cualquier
soluto eluido. El principal inconveniente de este tipo de
detectores es que son muy sensibles a los cambios de
temperatura, la cual debe ser controlada con fluctuaciones de
0.0001 C. Por otra parte, no resultan adecuados para
trabajar con la modalidad de elucin por gradiente.
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2.7. Conductividad
Los detectores de conductividad son los ms utilizados
cuando los solutos eluidos son inicos, como, por ejemplo,
cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos
despus de su separacin por cromatografa de cambio inico.
La medida de la conductividad de los lquidos se lleva a cabo
normalmente aplicando un potencial elctrico entre dos
electrodos, lo cual origina un movimiento de los aniones y
cationes presentes en el seno de la disolucin. La resistencia
(o la conductividad) de la disolucin contenida entre los dos
electrodos depende de la naturaleza y concentracin de las
especies inicas presentes. Generalmente se opera con
corriente alterna, con un dispositivo experimental como el que
se muestra esquemticamente en la fig 12.., donde la clula
de conductividad se coloca en una de las ramas de un puente
de Wheatstone.

Fig 12.Conductividad

Los detectores de conductividad son simples, baratos,

robustos y de prolongada duracin. Asimismo, pueden tener
una sensibilidad elevada y responden proporcionalmente a los
cambios de concentracin de especies inicas. Sin embargo,
su principal limitacin proviene de que la elevada
conductividad de los componentes de las fases mviles
usadas en cromatografa inica tiende a enmascarar la de los
analitos, reduciendo la sensibilidad. Este inconveniente se
resolvi mediante el uso de columnas supresoras colocadas
inmediatamente despus de la columna cromatogrfica. En
ellas, se transforman los iones del disolvente en especies
moleculares poco disociadas, sin alterar los iones del analito.

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