Centro de Bachillerato Tecnologico

Industrial y de servicion N°134

PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS

Manual de Técnicas de Identificación de
Enterobacterias.

1

OBJETIVO
GENERAL:
Conocer las diferentes pruebas que son realizadas para el
diagnostico de enterobacterias que afectan al ser humano.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Conocer las formas de identificar a las entero bacterias
de interés medico.

Realizar e interpretar métodos de identificación de
bacterias gramnegativas.

Conocer los medios de cultivo mas empleados en la
identificación de enterobacterias patógenas del ser
humano.

Índice
1. introducción……………………………………………………..1
2

2. Medios de cultivo ……………………………………………...3
Agar Mc Conkey……………………………………………………3
Agar Eosina azul de metileno…………………………………….7
Agar salmonella-Shigella………………………………………….9
Agar Hektoen Enterico……………………………………………11
Agar xiosa lisina desoxicolato…………………………………..13
Agar Sangre………………………………………………………...15
Agar chocolate……………………………………………………18
Agar Cassman………………………………………………….....20
Agar Thayer Martín………………………………………………..22
Agar Biggy………………………………………………………..…24
Agar Mueller-Hinton……………………………………….…….26
Agar Soya tripticasa………………..……………………………..27
Agar Verde Brillante……………………………………………….29
Agar Lowenstein-Jensen (medio base)……………………….31
3. Pruebas
Bioquímicas…………………………………………..32
Medio MIO………………………………………………………….32
Agar Kligler Hierro………………………………………………….35
Agar Simmons Citrato……………………………………………38
Caldo rojo de fenol y sacarosa………………………………..41
Agar lisina-Hierro………………………………………..………...42
Medio SIM………………………………………….........................45
Urea…………………………………………………………………..48
Agar TSI………………………………………………………………49
3

4. Pruebas automatizadas………………….
…………………..51
API20E………………………………………………………………..51
5. Tinciones………………………………………………………....5
6
Tinción de Gram.
………………………………...........................56
Tinción de Ziehl-Neelsen………………………………………….58
6. Pruebas
serológicas…………………………………………...59
Inmunofluorescencia directa…………………………...………59
Prueba PCR…………………………………………………………61
Inmunofluorescencia indirecta………………........................63
Prueba ELISA………………………………………………………..64
Pruebas serológicas según cada bacteria…………………67
7. Pruebas de
aglutinación……………………………………..77
8. Electroforesis………………………………………………….…
79
Técnica de electroforesis en gel de Agarosa……………….79
electroforesis capilar……………………………………………...81

9. Conclusión………………………………………………...........8
3
10.
Bibliografía……………………………………………………...84

4

se analiza la acción de la bacteria sobre los hidratos de carbono. además. la liberación de enzimas y metabolitos al medio de cultivo etc. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes. Algunas especies pueden vivir en tierra. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros órganos del ser humano y de otras especies animales. identificación y control de los microorganismo que van desde técnicas sencillas y rutinarias. Hoy en día se dispone de una amplia variedad de tinciones microbiológicas que constituyen herramientas muy importantes para la detección. alcoholes. fabricación de agentes antivirales de la industria farmacéutica. etc. A partir del conocimiento del metabolismo.Introducción: Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene más de 30 géneros y más de 100 especies que pueden tener morfología de bacilos o cocos. Entre otros aspectos. producción de toxinas en el uso de cosméticos. en plantas o en animales acuáticos. Las pruebas bioquímicas son un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos que generalmente se realizan en sistemas miniaturizados y automáticos. Hay que tener en cuenta. permiten determinar la fermentación de la lactosa e inhiben la motilidad del Proteus. las pruebas bioquímicas nos permiten determinar el género y la especie de la bacteria en estudio. tratamientos médicos. hasta tinciones altamente sofisticadas para el diagnostico y la investigación. Toma de muestra y aislamiento en cultivo en medios selectivos como el McConkey o en medio de Levine (desarrollo selectivo de enterobacterias frente a GRAM +). incluido el cloro. que las características metabólicas de los microorganismos pueden variar en 5 . Con frecuencia se encuentran especies de Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentación de quesos y productos lácteos.

de inmunodifusión. cultivos. serológicas.función de distintos factores de manera que para realizar una caracterización fiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas. 6 . El manual de técnicas para la identificación de las enterobacterias es una recopilación de conocimientos que pueden ser utilizadas con un fin futuro en donde está registrado técnicas como son tinciones. entre otros. pruebas bioquímica.

Las bacterias fermentadoras de lactosa producen bacterias que producen distintos tonos de rojos.13. Las colonias de bacterias no fermentadoras de la lactosa aparecen sin color y transparentes.. Interpretación: Los fermentadores fuertes de lactosa típicos como especies de escherichia.5g Cloruro de sodio…………………. debido a la conversión del colorante indicador neutro (rojo con pH de 6.p 1 L pH…………………………………………7.0.3g Lactosa……………………………….5g Agar………………………………….001 g Agua destilada……………c...1..MEDIOS DE CULTIVO Agar Mc Conkey Formula Peptona……………………………….s. 17g Polipeptona………………………….0..5g Rojo neutro…………………….1 Fundamento: El Agar MC es un medio de plaqueo diferencial para la selección y recuperación de bacterias de Enterobacteriaceae y bacilos gramnegativos entéricos relacionados.8) por la producción de ácidos mixtos. 7 . Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias gran positivas y de algunas gramnegativas.10g Sales Biliares……………………. La sacarosa es el único hidrato de carbono.03g Cristal violeta……………. klebsiella y enterobacter producen colonias rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada.

providencia. Las especies de Proteus. ESPECIAL PARA: Klebsiella Enterobacter Citrobacter. Providencia Serratia Hafnia Proteus Edwadsiella Salmonella Shigella E. coli 8 . como sitrobacter. salmonella y shigella. serratia y hafnia pueden aparecer sin color después de 24 horas o rosa pálido de 24 a 48 horas.Los fermentadores lentos o débiles de lactosa. con raras excepciones producen colonias con poco color o transparentes.

Escherichia Shigella Salmonella Klebsiella Proteus 9 .

10 .

g 0. serratia y hafnia. de ese modo. enterobacter.S.5g Dipotasico.5g Eosina………………………………………. 0.. Los fermentadores débiles incluidos klebsiella. 11 . Interpretación: Las colonias de los fermentadores fuertes típicos notablemente E.065 g Agua destilada C. Los colorantes analíticos (eosina y azul de metileno) inhiben a las bacterias grampositivas.PO4 …………………………………………………2g Agar ………………………………………13. EMB levine.5 Azul de metileno……………………. son negro verdoso o con brillo metálico. con solo lactosa.P 1 L pH final 7. Se combinan para formar un precipitado a un pH acido y. producen colonias purpuras en 24-48 horas. sirven también como indicadores de la producción de acido.Agar Eosina Azul De Metileno (EMB) Formula: Peptona……………………………………………… 10g Lactosa…………………………………………………5g Sacarosa ……………………………………. la formula modificada también detecta fermentadores de la lactosa. da reacciones más paralelo con las del Agar MC. coli.2 Fundamento El Agar EMB es un medio de plaqueo diferencial que puede ser usado en lugar del Agar MC en el aislamiento de Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes de muestras con bacterias mixtas.

salmonella y shigella. Yersinia enterocolitica. ESPECIAL PARA: Klebsiella E. coli Proteus Salmonella shigella Yersenia Enterobacter serratia Hafnia Agar Salmonella Shigella 12 .Los no fermentadores de lactosa. producen colonias transparentes en EMB levine en colonias purpura a negro en la formula modificada. un fermentador de sacarosa no fermentador de lactosa. que incluyen proteus. producen colonias transparentes.

acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH.1 L pH ……………………………………………………………….025g Verde brillante………………………………………………..S. y producen colonias transparentes. de la mayoría de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp.………………………… 1 g Agar…………………………………………………………….………………………8.033 g Agua destilada C.7. esta dada por la sales biliares y el verde brillante. que inhiben el desarrollo de bacterias Grampositivas.P ……………………………………….. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar.5g Tiosulfato de sodio……………….………….5 g Lactosa…………………………………………………….8.0.5 g Citrato de sodio……………………….12.…………………. Salmonella.. crecen bien en el medio de cultivo. obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. La producción de ácido sulfhídrico se evidencia como 13 .10 g Sales biliares …………………………………………8. Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa.5g Citrato férrico……………………..Formula Extracto de carne……………………………………… 5g Peptona………………………………………………………...…………………….. y a la formación de ácido Sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio.4 Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial La selectividad.0.5 g Rojo neutro…………………….

Las especies de shigella muestran inhibición variada y colonias sin color y sin ennegrecimiento. Ciertas cepas poco frecuentes de salmonella arizonae son fermentadores de lactosa pueden parecerse a Escherichia coli. Interpretación Cualquier colonia fermentadora que aparezca se coloreara de rojo por rojo neutro. Las cepas móviles de Proteus que aparecen en el agra SS no se dispersan. y las colonias aparecen sin color con centro negro. ESPECIAL PARA: Salmonella Shigella Shigella 14 .colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. debido a la producción de sulfuro de hidrogeno. El crecimiento de especies de salmonella no es inhibido.

1..0.04 g Agar………………………………….……………………12g Sacarosa……………………………...……………………… 12 g Extracto de levadura…………………………….7...6 FUNDAMENTO: El agar HE es una formulación reciente diseñada como un medio de plaqueo indirecto para muestras fecales para incrementar el rendimiento de especies de salmonella y shigella a partir de flora normal numerosa.P…………….……………………. 5 g Citrato férrico de amonio……………………….0.S.5 g Fucsina acida ……………………………………….. La alta concentración de sales biliares inhibe el crecimiento de todas las bacterias grampositivas y retarda el de muchas cepas coliformes.………. 15 . 3 g Sales biliares………………………………………….1 L PH ………………………………………………………….………………...1 g Azul de timón……………………………. 9 g Lactosa…………………………..…………………12g Salicina…………………………………………………..Agar Hektoen Entérico (HE) Formula: Peptona……………………….2 g Cloruro de sodio ……………………………………5g Tiosulfato de sodio………………………………..14 g Agua destilada C.

y la fucsina acida. Agar entérico Hektoen (HE) con un desarrollo de 24 horas es E. Shigella aparece más verde que salmonella. al reaccionar con el azul de timol. Las cepas de proteus son inhibidas en cierta forma las colonias que desarrollan son péquelas y trasparentes. y las colonias palidecen hacia la periferia. y de aspectos más brillantes o acuosos . Las colonias de salmonella son azul verdosas típicamente con centros negros de gas de sulfuro de hidrogeno.Pueden producirse ácidos a través de hidratos de carbono. Interpretación Los fermentadores rápidos de lactosa (E. 16 . coli) son inhibidos moderadamente y producen colonias naranja brillante a roja salmón. El tiosulfato de sodio es una fuente de sulfuro. produce un color amarillo cuando baja el pH. el color amarillo del medio indica producción de acido por fermentación de lactosa o sacarosa.coli. y el gas sulfuro de hidrogeno se detecta mediante el citrato férrico de amonio (relativamente sensible).

5 g Lactosa………………………………………………………….6.0.5 g Tiosulfato de sodio……………………………………………. producen colonias inicialmente amarillas debido a la utilización de xilosa y 17 ... y el rojo fenol es un indicador de pH.……5 g Rojo fenol……………………………………………………….P.……. como especies de shigella..Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Formula Xilosa………………………………………………………….…………………………….13.7.7..……3.….…2. Tres hidratos de carbono están disponibles para la producción de acido.0.4 Fundamento El Agar XLD es menos inhibidor del crecimiento de bacilos coliformes que el Agar HE y fue diseñado para detectar shigellae en heces después de enriquecimiento en caldo para gramnegativos.5 g Cloruro de sodio…………….…………………………….8g Citrato férrico de amonio…………………………………….S.008 g Agar…………………………………. Los microorganismos lisina positivos.5 g Lisina…………………………………………………………. ………………………………………………1 L pH……………………………………………………………………….………………………………….5 g Extracto de levadura…………………………………….8 Agua destilada C.5 g Deoxicolato de sodio……………………………………….…….5 g Sacarosa……………………….7....

Shigella. con centros negros de gas sulfuro de hidrogeno. Providencia y muchas especies de Proteus no usan ninguno de los hidratos de carbono y producen colonias transparentes. Enterobacter pueden usar más de un hidrato de carbono y producir colonias amarillo brillante. La mayoría de las especies de salmonella producen colonias rojas. El sistema de detección de sulfuro de hidrogeno es similar al del Agar HE.colonias rojas retardadas por la descarboxilacion de la lisina. muchas especies de Proteus son amarillas o transparentes con centros negros. las de salmonella son rojas con centro negro. Las colonias en muchas especies de Proteus son también amarillas. Colonias de Citrobacter son amarillas con centros negros. ESPECIAL PARA: Shigella Salmonella Klebsiella Proteus 18 . coli y especies de Klebsiella. Interpretación Los microorganismos como E.

adicionado de sangre es útil para el cultivo de microorganismos fastidiosos. El extracto de levadura provee vitaminas y aminoácidos esenciales.. carbono.7..0g Peptona de caseína …………………………………….0g pH Final……………………………………………….0g Infusión de músculo cardiaco …………………………. La Base de Agar Sangre generalmente es suplementada con sangre de carnero.5.3 ± 0. Este medio está relativamente libre de azúcares reductores los cuales interfieren en las reacciones hemolíticas de Estreptococos. El patrón de las reacciones hemolíticas puede variar dependiendo del tipo de sangre utilizada.5.2. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es usado como agente solidificante.5.0g Cloruro de sodio…………………………………………. Formula aproximada para 1000ml de agua Extractó de levadura ……………………………………..2 interpretación: 19 . conejo o caballo al 5-10% para aislar cultivar y estudiar reacciones hemolíticas de una amplia variedad de microorganismos fastidiosos patógenos. La infusión de músculo de corazón y la peptona de caseína proporcionan la fuente de nitrógeno. Aminoácidos y proteínas.Agar Sangre FUNDAMENTO: La Base de Agar Sangre es un medio utilizado para el aislamiento y cultivo de una amplia variedad de microorganismos.0g Agar ………………………………………………………..13.

pequeñas y mucoides con una zona de hemólisis. estafilococcos hemolíticos. de color blanco a amarillo y rodeadas de una zona clara por la beta hemólisis. lisas.Los estreptococos hemolíticos presentan colonias translúcidas u opacas. Las colonias de estafilococcos tienen una apariencia opaca. ESPECIAL PARA: Escherichia Brucella Neumococos Estafilococos Listeria Escherichia hermannii Escherichia vulneris 20 . coli y Pseudomonas. grisáceas y algunas veces mucoides rodeadas por una pequeña zona verdosa de alfa hemólisis. Otros organismos que pueden producir hemólisis incluyen a Listeria. grises. varias conirebacterias. translúcidas. E. Las colonias de neumococcos aparecen planas.

Klebsiella abortus Brucella 21 .

5g Almidón de Maíz ……………………………………………. todos ellos necesarios para el mejor desarrollo de Haemophylus y Neisseria. 22 . perladas con característico olor húmedo.5g Fosfato Monopotásico………………………………………. glutamina.2 + 0. COMPOSICION DEL MEDIO: Peptona de caseína…………………………………………7.. dextrosa y otros factores de crecimiento. así como suplementos (disponibles comercialmente) que Proveen glutamina. Streptococcus pneumoniae presenta Colonias pequeñas. de color azul grisáceo. húmedas.5g Peptona de carne……………………………………………7.0g Agar …………………………………………………………. hemina. La Base de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa Chocolate cuando es suplementada con hemoglobina al 2% que provee la hemina (Factor X) requerida para el crecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de Neisseria.0g Cloruro de Sodio……………………………………………. levadura.Agar Chocolate FUNDAMENTO: La Base de Agar Chocolate es un medio utilizado con varios suplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria gonorrhoeae y otros microorganismos fastidiosos..2 Interpretación: Haemophylus influenzae presenta Colonias pequeñas.5.1. 4.1. vitaminas. Neisseria meningitidis presenta Colonias medianas a grandes.10.. coenzimas. mucoides.0g Fosfato Dipotásico…………………………………………. mucoides. cocarboxilasa.. Neisseria gonorrhoeae presenta Colonias pequeñas grisáceas incoloras.0g pH final……………………………………………………. aminoácidos. 7.

pueden aparecer verdes por la decoloración del medio ESPECIAL PARA: Haemophylus influenzae Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Haemophylus 23 .planas.

vitaminas y aminoácidos.1.0. 5 Nicotinamida……………………………………………………….10.0 Extracto de carne………………………………………………….3.0 Dextrosa……………………………………………………………….. El agar bacteriológico es el agente gelificante. 0 Cloruro Sódico………………………………………………………5. neutralizar la inhibición de beta-hemólisis por la glucosa y favorecer el crecimientode Neisseria.0 Almidón………………………………………………………………. La nicotinamida favorece el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus influenzae impidiendo la Liberación de la coenzima (factor V) por medio de nucleotidasas procendentes del enriquecimiento con sangre. Formula aproximada a 1000 ml Proteosa Peptona nº 3 10.0 Triptona……………………………………………………………….Agar Cassman FUNDAMENTO: Agar CASMAN es utilizado para el aislamiento de microorganismos exigentes. El Cloruro sódico mantiene el balance osmótico en el medio.. La dextrosa se añade para favorecer el crecimiento de cocos patógenos.0 5 Ácido p- 24 . El almidón tiene como función asegurar que cualquier metabolito tóxico producido sea absorbido. triptona y extracto de carne proporcionan nitrógeno. La proteasa peptona nº 3..0.

0 pH ………………………………………………………………7.2 ESPECIAL PARA: Neisseria Gonorrhoeae Crecimiento satisfactorio. Agar Thayer Martin 25 .05 Agar Bacteriológico…………………………………………….14. Haemophilus influenzae Crecimiento satisfactorio.Aminobenzoico………………………………………...3 ± 0.0.

.+ + + + V V Moraxella spp .2 Interpretación: Las colonias de gonococos y meningococos obtenidas en este medio selectivo son usualmente opacas..+ V V + . meningitidis + + ... de 1-4 mm de diámetro. de la Mezcla de antibióticos VCNT (Vancomicina. grisáceas. medio Thayer Martin (CO2).M. A.: agar o caldo nutritivo.N.0 Agar……………………………………………………………….2 ± 0.0 pH final…………………………………………………………. GLU: fermentación 26 . C22°C: desarrollo a 22°C. Coloración de Gram: diplococos Gram negativos. Se sugiere proseguir con este esquema de identificación. Nistatina.0 Fosfato dipotásico……………………………………………………………. .1.5. OXI: oxidasa.-* .N C22°C OXI GLU MAL N. Luego de 48 h de incubación pueden transformarse en colonias mucoides.0 Fosfato monopotásico………………………………………………………. Cho: Agar chocolate (CO2).M. . Microorganismos T. A.7. gonorrhoeae + + . Formula aproximada a 1000 ml Pluripeptona……………………………………………………. A.15.+ + + .+ + + + . Colistina.M.0 Almidón soluble………………………………………………………………. Trimetoprim) y de Enriquecimiento GC.1. El Medio de Thayer Martin es preparado a partir de la Base de Agar GC adicionada de Hemoglobina.Moraxella (Branhamella) catarrhalis ..4.+ + + Acinetobacter spp.T..FUNDAMENTO: El medio de Thayer Martin es utilizado principalmente para el aislamiento y desarrollo de especies de Neisseria.Neisseria spp.15. T.+ + -N. convexas.0 Cloruro de sodio……………………………………………………………….

Moraxella spp Moraxella (Branhamella) catarrhalis neisseria AGAR BIGGY El Agar Biggy (por sus siglas en inglés Bismuth-GlucoseGlycine-Yeast) es utilizado para el aislamiento y 27 . Neisseria spp. gonorrhoeae N. meningitidis Acinetobacter spp.de glucosa.= reacción negativa. ESPECIAL PARA: N. V = reacción variable. MAL: fermentación de maltosa. . * La mayoría de las especies de Acinetobacter pueden usar glucosa por la vía oxidativa. + = reacción positiva.

0 pH 6. albicans Colonias de color café oscuro o negro sin difusión en el medio. La glicina es utilizada para estimular el crecimiento. C. Interpretación: La morfología colonial típica se describe: C. tropicallis Colonias ligeramente oscuras con centro negro y brillante.8 ± 0. rugosas de color negro con brillo metálico. La dextrosa es la fuente de carbono. 28 . La diferenciación está basada en la morfología colonial y la pigmentación típica que se presenta en este medio. También es conocido como Agar de Nickerson. El indicador sulfito de bismuto actúa también como un inhibidor del desarrollo bacteriano. El agar es adicionado como agente solidificante. planas.0 Agar Bacteriológico 16.diferenciación de especies de Candida. El pigmento difunde en el medio. con ligera presencia de micelio y tamaño mediano. C. borde café y halo amarillo.0 Extracto de Levadura 1. En este medio el extracto de levadura proporciona vitaminas y aminoácidos. krusei Colonias grandes. FORMULA Citrato de Amonio y Bismuto………………………………5.0 g Glicina………………………………………………………………10. La reducción del sulfito de bismuto se manifiesta en una pigmentación de la colonia que en ocasiones difunde en el medio. de tamaño mediano.g Sulfito de Sodio 3.0 Dextrosa 10.2 FUNDAMENTO El Agar Biggy es una modificación de la fórmula desarrollada por Nickerson quién realizó estudios sobre la reducción de sulfito por especies de Candida. Después de 72 hrs.

ESPECIAL PARA: C. café-rojizas. con muy pequeña presencia de micelio. pseudotropicalis Colonias grandes de color rojo oscuro. planas rugosas. planas con ligero crecimiento micelial. con crecimiento micelial amarillo. C.C. C. stellatoidea Colonias de tamaño mediano. krusei C. tropicallis C. planas. parakruzei Colonias de tamaño mediano. albicans C. parakruzei Candida Agar Muller Hinton Fundamento: 29 . de color café oscuro.

carbón y aminoácidos.7. vitaminas.El Agar Mueller Hinton es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Bauer-Kirby.17. Formula por litro de agua destilada Agar ……………………………………………………………. El almidón es agregado para absorber cualquier metabolito tóxico y el agar es adicionado como agente solidificante.0 g Almidón…………………………………………………………1.5 g pH…………………………………………………………….1 Interpretación: es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Bauer-Kirby ESPECIAL PARA: Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Bacillus subtilis Neisseria Agar Soya Tripticasa 30 . Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana..3 + 0.3. En este medio la infusión de carne y la peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno.0 g Peptona de caseína acida………………………………17.5 g Infusión de carne de res………………………………….

0g Cloruro de Sodio ……………………………………. Fundamento El Agar de Soya Tripticaseína provee un excelente soporte de crecimiento para organismo aerobio y anaerobios. según lo demostró Leavit en 1955.0g Peptona de Soya……………………………………. El azúcar de la Peptona de Soya provee la fuente de carbohidratos.5. El Cloruro de Sodio tiene su función en el balance osmótico y el Agar es incorporado como agente solidificante. De acuerdo con la Farmacopea. cosméticos y en la industria farmacéutica.3 ± 0.. Este medio es recomendado en los procedimientos microbiológicos de control de aguas.2 ESPECIAL PARA: Especies de Haemophylus 31 .El Agar Soya Tripticasa es un medio utilizado para promover el crecimiento de microorganismos fastidiosos y adicionado de sangre para observa reacciones hemolíticas. Clínicamente se utiliza para diferenciar especies de Haemophylus debido a que no contiene los factores X y V requeridos para su crecimiento. Así mismo este medio puede ser utilizado como base para preparar medios suplementados como el Agar Sangre y Agar Glosa Chocolate.5.0g Agar Bacteriológico…………………………….0g pH………………………………………………………… 7. Formula Peptona de Caseína……………………………….15. En este medio las peptonas proveen la fuente de nitrógeno y minerales.15.

que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares.2 Interpretación: Las colonias de Escherichia coli presentan un color Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento en Salmonella enteritidis las colonias son Rosas.5. blancas o transparentes sobre fondo rojo.0.0g Sacarosa………………………………………………………….0. constituyen la fuente de nitrógeno. orina. Formula aproximada a 1000 ml: Peptona de carne…………………………………………………5.9 ± 0. producto lácteos y otros alimentos de importancia sanitaria.20. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables.0g Peptona de caseína………………………………………………. Salmonella typhi con crecimiento inhibido mientras que las colonias de Salmonella typhimurium son Rosas. En el medio de cultivo.Agar Verde Brillante Características del medio Medio preparado: verde.0g Rojo fenol………………………………………………………….3.0g Extracto de levadura……………………………………………. blancas o transparentes sobre fondo rojo. y el verde brillante actúa como agente selectivo. el rojo fenol es el indicador de pH.0g pH final…………………………………………………………6.0g Lactosa……………………………………………………………10.. 32 .0125g Agar……………………………………………………………….08g Verde brillante………………………………………………. la pluripeptona y el extracto de levadura. leche.. el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.5. vitaminas y minerales.0g Cloruro de sodio…………………………………………………..10. FUNDAMENTO: Es un medio altamente selectivo empleado para aislar la Salmonella (excepto styphi y shigellas) de haces.

ESPECIAL PARA: Escherichia coli Salmonella (excepto styphi y shigellas) Agar Lowenstein-Jensen Medio Base 33 .

El verde de malaquita inhibe a gran parte de la flora acompañante.0.1 Fundamento: Los nutrientes de este medio basal. amarillentas.2..5 Sulfato de magnesio…………………..6 Harina de papa……………………. Con el agregado de glicerina se estimula el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis.. Interpretación: Observar las características morfológicas y la presencia o ausencia de pigmento en las colonias.3. más los aportados por el agregado de la mezcla de huevos. como es el caso de M.Formula: Fosfato monopotasico………………. granulares Lisas..24 Citrato de magnesio…………………... MICROORGANISM OS Mycobacterium tuberculosis CRECIMIEN TO Excelente Mycobacterium avium Mycobacterium gordonae Excelente CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS Grandes.0.4 pH final………………………………4. aunque gran parte de M. se pueden seleccionar micobacterias tolerantes a la sal. Agregando un 5% de NaCl. constituyen un rico soporte para el crecimiento de una gran variedad de micobacterias. sin pigmentos Excelente Lisas 34 .6 Asparragina…………………………. smegmatis.30.8≠ 0.0. secas.0 Verde de malaquita…………………... bovis es inhibido.

0.0 Clorhidrato de L-ornitina………. altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura. Fundamento: Medio de cultivo semisólido.1.0 Agar………………………….0 Tripteína……………………….PRUEBAS BIOQUIMICAS MEDIO MIO Formula (Gramos Por Litro): Dextrosa…………………………. para la 35 .2. Además. la Tripteína aporta grandes cantidades de triptófano.0 Púrpura de bromocresol……………. sustrato de la enzima triptofanasa.10..5≠ 0.02 pH final…………………………………………. peptona y Tripteína..3...2 Características Del Medio Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente.5.6.……..0 Extracto de levadura………….10.0 Peptona……………………….

la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa. Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. 36 .  Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra. se alcaliniza el medio. con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura. La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable.realización de la prueba del indol. la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilación. presencia de ornitina decarboxilasa e indol. que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. es producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. Por su composición. indica un resultado positivo. el púrpura de bromocresol es el indicador de pH. La presencia de acidez. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación. Ornitina decarboxilasa:  Resultado positivo: color púrpura. otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa.  Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio. INTERPRETACIÓN: Movilidad:  Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de la línea de siembra. El indol. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac ´s o de Erlich.

37 . Microorganis mo Crecimien to Movilid ad Indo l K. pneumoniae ATCC 700603 P. Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. mirabilis ATCC 43071 Bueno - - Ornitina decarboxila sa - Bueno + - +  Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

5 Tiosulfato de sodio……………………………………….0 Tripteína………………………………………………………10. El Tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico.……………………... es la fuente de iones Fe 3+. en base a la fermentación de glucosa y lactosa. de 38 ..13.3 ± 0.15.0 Citrato de hierro y amonio………………………….AGAR KLIGLER HIERRO Formula (Gramos Por Litro): Peptona de carne………………….0 Lactosa……………………………………………………….3 Rojo de fenol……………………………………………….0 Glucosa…………………………………………………………. En el medio de cultivo.025 Agar…………………………………………………………….0.0..1. aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. el citrato de hierro y amonio.2 Características Del Medio Medio preparado: rojo / naranja Fundamento: Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables.0 pH final: ……………………………………………………7.0 Cloruro de sodio ……………………………………………5. y a la producción de ácido sulfhídrico. la peptona de carne y la Tripteína.10.0. los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro.

INTERPRETACIÓN:  Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. que se detectan por medio del indicador rojo de fenol. indica que el microorganismo produce gas. y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.color negro. 39 . o ruptura del medio de cultivo.  El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico. El rojo de fenol es el indicador de pH.  La presencia de burbujas. Por fermentación de azúcares. el cual vira al color amarillo en medio ácido.  Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa. y lactosa. El Agar es el agente solidificante. se producen ácidos.  Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares. El Tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

coli ATCC 25922 K. flexneri ATCC 12022 P. mirabilis ATCC 43071 S. typhimurium ATCC 14028 S. pneumoniae ATCC700603 P. enteritidis ATCC 13076 S. aeruginosa ATCC 27853 A/A + Producción de ácido sulfhídrico - A/A + - K/A + + K/A - + K/A + + K/A - - K/K - - A: ácido K: alcalino 40 .Microorganism o Pico/Fondo Producción de gas E.

FUNDAMENTO: En el medio de cultivo. en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa. a través del ciclo del ácido 41 . Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.0 Fosfato dipotásico………………………………………………. que vira al color azul en medio alcalino.1.08 Agar…………………………………………………………………… 15.0 Sulfato de magnesio…………………………………………….0 Fosfato monoamónico…………………………………………1.6. y el azul de bromotimol es el indicador de pH.2 Características Del Medio Medio preparado: verde. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El metabolismo del citrato se realiza. Las sales de fosfato forman un sistema buffer. el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. con la consiguiente producción de alcalinidad.0 Cloruro de sodio……………………………………………………5.0.2.0 pH final: ……………………………………………………….AGAR SIMMONS CITRATO FORMULA (Gramos Por Litro): Citrato de sodio…………………………………………………….9 ± 0.2 Azul de bromotimol……………………………………………. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono.0. usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. el magnesio es cofactor enzimático.

al ser utilizados como fuente de carbono.  Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.  Inóculos muy densos. Este último. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa. oxalacetato y piruvato. El desdoblamiento del citrato da progresivamente. alcalinidad. da origen a ácidos orgánicos que. producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. Microorganismo Citrato permeasa Color del medio Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Positivo Azul 42 .  Si se usa un inoculo denso para sembrar el medio de cultivo. INTERPRETACIÓN:  Positivo: crecimiento y color azul en el pico. pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo.tricarboxílico. en presencia de un medio alcalino. puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado. pueden originar resultados falsos positivos. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo.

S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul E. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde 43 . coli ATCC 25922 Negativo Verde S.

La peptona provee la fuente de nitrógeno para el buen desarrollo de los microorganismos.0 Sacarosa………………………………………………5. 44 .CALDO ROJO DE FENOL Y SACAROSA Formula (Gramos Por Litro): Peptona de Caseína……………………………10. La capacidad de las bacterias de fermentar carbohidratos es utilizada como un criterio para su identificación. el Cloruro de Sodio mantiene el balance osmótico del medio y el Rojo de Fenol actúa como indicador.7. El medio provee los requerimientos nutricionales para el crecimiento de los microorganismos y contiene Rojo de Fenol como indicador de pH. Este indicador fue utilizado por Vera obteniéndose resultados altamente confiables.5.018 pH final………………………………………….4 ±0.2 Fundamento: El Caldo Rojo de Fenol y Sacarosa es utilizado para la diferenciación de cultivos puros. virando de color rojo-naranja a amarillo en presencia del ácido producido por la fermentación del azúcar.0 Cloruro de Sodio………………………………….0 Rojo de Fenol………………………………………. en base a su capacidad para fermentar la sacarosa..0.

3..1. y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. y de color violeta a pH igual o mayor a 6.. El purpura de bromocresol.6.02 Agar…………………………………………………………………15.2.8.5 Tiosulfato de sodio……………………………………………….2 Características Del Medio Medio preparado: color violeta. Fundamento: En el medio de cultivo. El citrato de hierro y amonio. es el indicador de pH. la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano.0 Extracto de levadura …………………………………….0.0 Citrato de hierro y amonio…………………………………….0 pH final………………………………………………………….0 Glucosa……………………………………………………………….7 ± 0. son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico.0 Lisina………………………………………………………………… 10..5.. 45 . y el Tiosulfato de sodio. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable.0.0.04 Púrpura de bromocresol………………………………………. el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5..AGAR LISINA HIERRO Formula gramos por litro): Peptona de gelatina…………………………………………….

Providencia y alguna cepas de Morganella spp. desaminan la lisina. que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa. Providencia y algunas cepas de Morganella. con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio. INTERPRETACIÓN: Decarboxilación De La Lisina:  Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. y el fondo amarillo. Esto sucede con cepas del género Proteus. tiene lugar en medio ácido. se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro. por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada. La decarboxilación de la lisina. esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico. pero a las 24 hs de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas. Desaminación De La Lisina:  Pico rojizo/fondo amarillo. producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo.  Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo. pero que son fermentadores de la glucosa. Producción De Ácido Sulfhídrico:  Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el límite del pico y fondo) 46 . La producción de sulfuro de hidrógeno. el cual. Las cepas de los géneros Proteus. se produce la amina cadaverina.Por decarboxilación de la lisina.

especialmente Salmonella spp. Rojo Amarillo Negativo Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo Morganella spp. basado en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídri 47 . Púrpura Púrpura Positivo Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Púrpura Púrpura Negativo Escherichia coli ATCC Púrpura Púrpura Negativo 25922 Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos..Microorganismos Color en el pico de flauta Color en la base del tubo Ennegrecimient o del medio Proteus mirabilis ATCC 43071 Rojo Amarillo Negativo Salmonella typhimurium ATCC 14028 Púrpura Púrpura Positivo Salmonella enteritidis ATCC 13076 Púrpura Púrpura Positivo Providencia spp.* Rojo Amarillo Negativo Edwarsiella spp.

48 .……7.2 Tiosulfato de sodio…………………………………. por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra.3 ± 0.0. que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol.2 Características Del Medio Medio preparado: ámbar.5 pH final……………………………………………. para originar un compuesto de color rojo.2. y particularmente de la Tripteína.. Fundamento: El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas.20.  Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. INTERPRETACIÓN:  Cepas móviles: producen turbidez del medio. que se extiende mas allá de la línea de siembra.0.2 Agar…………………………………………………………3.1 Sulfato de hierro y amonio……………………. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac´s o de Erlich..0 Peptona………………………………………………….6.SIM Medio Formula (gramos por litro): Tripteína………………………………………………. mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del Tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa.. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio.

Limitaciones En las bacterias aerobias estrictas. morganii. Algunas bacterias productoras de melanina como M. que sólo crecen en superficie. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio. la movilidad puede ser difícil de observar.  Cepas indol negativas: sin cambio de color. Microorganis mo Movilidad Indol Producción de ácido sulfhídrico E.  Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. coli ATCC 25922 + + - 49 . que no debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido sulfhídrico. pueden dar un color parduzco.  Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.

flexneri ATCC 12022 - - - Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad. producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae. pneumoniae ATCC 700603 - - - P. mirabilis ATCC 43071 + - + S. enteritidis ATCC 13076 + - + S.K. typhimurium ATCC 14028 + - + S. 50 .

nitrógeno..1 Rojo fenol…………………………………………………………0. Fórmula (en gramos por litro) Urea………………………………………………………………20.9. Es particularmente útil para diferenciar Proteus spp.0 Fosfato monopotásico…………………………………………….01 pH final: ………………………………………………………. Su uso. Estos productos metabólicos alcalinizan el medio. presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. de otros géneros 51 . vitaminas y cofactores.1 Fosfato disódico……………………………………………………. haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea.5 Extracto de levadura ……………………………………………… 0.. El extracto de levadura es la única fuente de carbono. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. en base a la actividad ureásica.9. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer. Fundamento: Medio de cultivo. y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. se recomienda para diferenciar Proteus spp. formulado por Rustigian y Stuart. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa. liberando amoníaco y dióxido de carbono.8 ± 0. el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa. la hidrolizan.UREA Medio utilizado para la identificación de microorganismos.6.

.........3.......1.......... de color negro..........0 pH final: ..5.........0........... 0 Sacarosa........... El rojo de fenol es el indicador de pH..13............... se producen ácidos.. 0 0......... los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro. el sulfato de hierro y amonio....0 Lactosa.... El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico... Fórmula (en gramos por litro): Extracto de carne..........................................................................................1 0.......... y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.....0..0 Pluripeptona........ Por fermentación de azúcares..2 Positivo Fundamento En el medio de cultivo......TSI Agar Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias.........3≠ 0.........................................10.. sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono Fermentables......7...2 Tiosulfato de sodio. La lactosa............ lactosa.................. aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano..el cual vira al color amarillo en medio ácido.......... el extracto de carne y la pluripeptona..... sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico..............0 Glucosa..2 Rojo de fenol......... que se detectan por medio del indicador rojo de fenol........... es la fuente de iones Fe3+ ..025 Agar.. El 52 ..2 Cloruro de sodio.................0 Sulfato de hierro y amonio. en base a la fermentación de glucosa..0............

PRUEBAS AUTOMATIZADAS “API20E” La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram-. Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes: Prueb a ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA Reacción / Enzimas Beta-galactosidasa Arginina deshidrolasa Lisina descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Utilización del citrato Producción de H 2 S Ureasa Triptófano desaminasa Producción de indol Producción de acetoína (VogesProskauer) Gelatinasa Fermentación/oxidación de glucosa Fermentación/oxidación de manitol Fermentación/oxidación de inositol Fermentación/oxidación de sorbitol Fermentación/oxidación de 53 .tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. y una base de datos. Básicamente consta de 21 tests bioquímicos estandarizados y miniaturizados. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta. la oxidasa. La prueba número 21. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido. se hace de forma independiente a la tira. eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez.

SAC MEL AMY ARA OX ramnosa Fermentación/oxidación sacarosa Fermentación/oxidación melobiosa Fermentación/oxidación amigdalina Fermentación/oxidación arabinosa Citocromo oxidasa de de de de A patir de una colonia bien aislada del microorganismo. VP. Cubrir con parafina las cúpulas de los pocillos ADH. hacer una suspensión en 5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril. URE. H2S para obtener anaerobiosis. Llenar la cúpula de los pocillos CIT . parte aerobia). Llenar con la suspensión de bacterias los tubos. LDC. de todos los pocillos. no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una cúpula. GEL con la suspensión de bacterias. ODC. 54 .

los que no requieren ser revelados. VP Añadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del reactivo 2 (C2 H5 OH). Previamente poner agua en los alvéolos de la cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación. API OF. para el revelado se tienen que tener en cuenta dos criterios:  Si la glucosa da negativo y los tests positivos son dos o menos de dos. IND 55 . Cuando ésto ocurre se hacen otros tipos de API como el API 20NE.Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación.  Si la glucosa es positiva y/o tres o más tests son positivos se revelan los test que requieren reactivos: TDA Añadir una gota de FeCl3 10 %. es decir. no hay que añadir reactivos. Determinadas pruebas requieren ser reveladas. Tras la incubación se anotan los resultados inmediatos. el API M o el API 10S para ver determinados metabolismos especiales. Incubar a 37 °C durante 18-24 h.

INTERPRETACIÓN: La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con los de las tablas de lectura. Prueb a ONPG ADH Reacción / Enzimas Negativo Positivo Beta-galactosidasa Arginina deshidrolasa sin color amarillo LDC Lisina descarboxilasa amarillo ODC Ornitina descarboxilasa amarillo CIT Utilización del citrato verde H2S Producción de H 2 S URE Ureasa sin precipitado negro amarillo amarillo rojo o naranja rojo o naranja rojo o naranja azul oscuro o turquesa precipitado negro TDA IND Triptófano desaminasa Producción de indol amarillo amarillo VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer) Gelatinasa sin color sin difusión Fermentación/oxidación de glucosa Fermentación/oxidación de manitol azul o verde azul o verde GEL GLU MAN rojo o naranja marrón-rojo color rosa o anillo rosarojo rosa-rojo difusión de pigmento amarillo amarillo 56 . Oxidasa Añadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recién preparado.Añadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilaminocinamaldehido. y anotando el resultado como positivo o negativo (más adelante se explicará con detalle).

Para obtener el perfil númerico de 7 cifras. 2 ó 4. 1.  Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete. 4 si es el tercero. 2 si es el segundo. 57 . de acuerdo a los siguientes criterios:  Si la reacción es negativa se pone 0.INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX Fermentación/oxidación de inositol Fermentación/oxidación de sorbitol Fermentación/oxidación de ramnosa Fermentación/oxidación de sacarosa Fermentación/oxidación de melobiosa Fermentación/oxidación de amigdalina Fermentación/oxidación de arabinosa Citocromo oxidasa azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde azul o verde amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo amarillo Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. a cada pocillo se le dará el valor 0. Los pocillos están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test número 21 corresponde al test de la oxidasa).

con las sumas de los siete tripletes se obtiene un código de 7 cifras. Se suman los valores de cada triplete. para realizar esta operación hay programas informáticos. 58 . Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.

el cual sirve como solvente de lípidos y agente deshidratante de proteínas. considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. 59 . coli Salmonella. Agente Decolorizante: Alcohol acetona o alcohol. Neisseria. decoloración y tinción de contraste. Vibrio. sobre todo en muestras clínicas. La técnica incluye tinción primaria. Haemophylus. tiñe la bacteria de color violeta Agente Mordiente: Lugol. Las especies de enterobacterias que pueden ser identificadas son: E. Contra tinté: Safranina que tiñe de rojo a la bacteria. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana. Ayuda a adherir el tiente a la célula. Ayuda a resistir la decoloración. Fundamento: Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias.TINCIONES Tinción GRAM Tinte Primario: Cristal violeta. ETC…. forma un complejo insoluble con cristal violeta.

Método de realización: 1) Colocar la muestra en un portaobjetos y este en un puente de tinción. Se lava una ves transcurrido el tiempo. ya pasado el minuto se lava con agua corriente. y posteriormente se vuelve a lavar. 2) Cubrir la muestra con cristal violeta y dejar actuar 1 min. 4) Decolorar con alcohol acetona gota a gota dejándose actuar 30 seg. 6) Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de decolorantes 7) Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra para posteriormente ser observada en el microscopio. 5) Cubrir con safranina al 95% por 1 min. INTERPRETACION: Bacterias Gram positivas Bacterias Gram negativas 60 . 3) Cubrir con lugol y dejar actuar durante 1 min. 8) Identificar las bacterias Gram positivas y negativas identificándolas con e color característico.

Azul de metileno por 2 minutos y lavar con agua.Tinción de Ziehl-Neelsen Fundamento: Esta tinción sirve para teñir bacterias del género Mycobacterium. y las células restantes del espécimen. causante de la tuberculosis y M. que la retienen debido a su superficie cérea. Una tinción ácidoalcohol resistente se realiza según los siguientes pasos: ° Tinción primaria con fucsina básica. aún teñidas de rojo. 2. tuberculosis. se identifican mediante esta tinción. Utilizar unpapel toalla bien impregnado delreactivo. Las micobacterias permanecen teñidas de rojo. el resto de las bacterias se tiñen de azul por el colorante de contraste. Este decolorante elimina la fucsina de todas las células excepto de las micobacterias. 5. Preparar un frotis. mientras que el resto de las bacterias toman el color azul del colorante de contraste Preparación de la tinción ácido -resistente 1. leprae. 61 . Las micobacterias son ácido-alcohol resistentes porque poseen en sus cubiertas lípidos de ácidos grasos complejos que forman en su pared celular un material de tipo céreo resistente a la decoloración. Lavar con agua. Lavar con agua. causante de la lepra o enfermedad de Hansen. ° Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la célula. M. Decolorizar con alcohol etílico.Carbol fucsina (3 minutos). 4. lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum. Se tiñen de azul todas las células previamente decoloradas. 3. que tiñe todas las células de rojo. ° Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. ° Coloración de contraste con azul de metileno.

Lavamos en PBS-Tween 2 veces durante 5 minutos. se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se elimina con un lavado del portaobjetos. Escurrimos y dejamos secar. Cubrimos las otras extensiones con 10ml de cada dilución de los sueros problemas y los sueros testigos.  Clamydia trachomatis.  Helicobacter. Enjuagamos rápidamente en un baño de agua destilada. Método de realización: 1) Cubrimos dos de las extensiones con 10ml de tampón BABS (testigo conjugado). . Las enterobacterias que se pueden observar con esta prueba son: Salmonella. coli.  E. Añadimos un suero específico del antígeno problema marcado con isotiocinato de fluoresceína (conjugado). Si el antígeno problema se encuentra presente en la muestra. otros dos con 10ml de sorbente (testigo sorbente). 2) Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda.Pruebas serológicas Inmunofluorescencia Directa: Fundamento: Sobre un portaobjetos depositamos una muestra en la que buscamos la presencia de un determinado antígeno. 62 .

se unirá a los anticuerpos. 4) Incubamos 30 minutos a 37° C en una cámara húmeda. y al añadir el complejo antiinmunoglobulina G marcado. Dejamos secar. Al mirar en el microscopio de campo oscuro. 63 . Pasamos rápidamente por un baño de agua destilada. INTERPRETACION: Los anticuerpos de la bacteria a estudiar se unirán contra los que son específicos.3) Cubrimos cada extensión de 10ml de globulina antihumana diluida en tampón BABS. Se observará fluorescencia. Lavamos los portas en PBS-Tween 2 veces durante 5 minutos. 5) Observación de los resultados en microscopio de campo oscuro.

Todo el proceso de PCR esta automatizado mediante un aparato llamado termociclador. que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. que se mantiene durante 1-9 min. Paso de recocido La temperatura de reacción se reduce a 50 – 65 °C durante 20-40 segundos. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina. Paso de desnaturalización Este paso es el de regular el evento de ciclismo primero y consiste en calentar la reacción a 94-98°C durante 20 a 30 segundos. lo que favorece una buena conductividad térmica. Una de las bacterias que puede ser identificada con esta prueba es Chlamydia tranchomatis Procedimiento Paso de inicialización Este paso consiste en calentar la reacción a una temperatura de 94 a 96°C. permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. para lo cual emplea ciclos de alta y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre si tras cada fase de replicación y . dejando de recocido de los iniciadores de ADN de cadena única. 64 . dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.Prueba PCR Fundamento: Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN.

INTERPRETACION: 65 . Taq polimerasa tiene su optima actividad de temperatura a 75. Alargamiento final Este paso solo se puede realizar ocasionalmente a una temperatura de 70 – 74°C durante 5 – 15 min.Extensión / alargamiento La temperatura en este paso depende de la polimerasa de ADN utilizados.80 °C.

2) Luego se agregan anticuerpos específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. por la aparición de fluorescencia de color verde manzana. 3) La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia. Si éste contiene anticuerpos específicos. Interpretación: Prueba de ELISA 66 . Bordetella. El conjugado se une a los anticuerpos específicos o se elimina mediante lavado había anticuerpos específicos en el suero. Mycobacterium leprae. Las enterobacterias que se logran observar en esta prueba son: Treponema pallidum.Inmunofluorescencia indirecta: Fundamento: Sobre un portaobjetos que lleva pegado un antígeno conocido. añadimos el suero problema. Posteriormente se añade un suero anti-inmunoglobulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína (conjugado). Los anticuerpos del suero no específicos del antígeno del portaobjetos se eliminan mediante un lavado. Neisseria gonorrhoeae. se unen al antígeno. Método de realización: 1) La muestra problema es colocada sobre un portaobjetos donde se deja secar y fijar.

ELISA directo DESARROLLO: Consta de las siguientes etapas: 67 . la peroxidasa dl rábano picante y la glucosa-oxidasa. que puede prolongarse hasta 12 meses. La fracción inmunoglobúlinica de la globulina antiespecie se aísla por precipitación salina. El 4-nitrofenil fosfato o sustrato usado para la fosfatasa alcalina no es peligroso. La hidrólisis de estos sustratos da. La preparación de conjugados se consigue. Algunos métodos precisan que las placas se mantengan durante toda la noche a 4° C. que se considera carcinognético. mediante la unión covalente con glutaraldehido. Se han utilizado toda una variedad de enzimas. entre los que citaremos la fosfatasa alcalina. En segundo lugar. los antígenos o anticuerpos se pueden conjugar al enzima sin pérdida de actividad. respectivamente. temperatura y pH. a diferencia del ácido 5-aminosalicílico o sustrato de la peroxidasa del rábano. La adsorción depende también dl tiempo. Se debe añadir un estabilizante enzimático antes de proceder a su conservación a 4°C. que los anticuerpos o antígenos soluble se pueden hacer insolubles por adsorción a una fase sólida.Fundamento: Existen dos importantes variaciones en relación con ELISA. el enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable. como pueden ser las placas de microtitulación o los tubos de poliestireno. En primer lugar. La mezcla se incuba con glutaraldehído al 0. en el caso de la fosfatasa alcalina.2% durante 2-4 horas a temperatura ambiente. El glutaraldehído libre se elimina por diálisis. Ésta se combina con el enzima en la proporción 3:1. un color amarillo. en un tampón de pH elevado. por lo que es posible medir la densidad óptica de la coloración final. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia de su mayor sensibilidad ya que.

Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. 4) Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 3) Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. 2) Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima. Se puede parar la reacción si se desea. si los anticuerpos reaccionan con los antígenos.1) Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. INTERPRETACION: ELISA indirecta: DESARROLLO: 68 . el complejo quedará solubilizado.

Incubar toda la noche a 4°C con tampón para baño. Repetimos el punto 2. 6) Para la reacción añadir 50ml de NaOH 3 M. 3) Adicionar 200ml de suero diluido e incubar a temperatura ambiente. manteniendo la duración del enjuagado entre 5 y 10 minutos. bien permitiendo que la reacción tenga lugar hasta que presente el color adecuado. 5) Adicionar 200ml de sustrato con fosfato en tampón dietanolamina. durante 2 horas.1) Añadir sobre cada excavación de la placa de microtitulación 200ml de antígeno a la concentración óptima. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente. 4) Añadir 200 ml de antiglobulina fosfatasa alcalina a la concentración óptima. Este cambio de color se puede comparar con los controles y efectuar la lectura directamente o se lee en un espectrofotómetro a 405nm. 7) El nivel de hidrólisis o de cambio de color es proporcional a la cantidad de anticuerpo de la muestra problema. INTERPRETACION: 69 . bien manteniéndola a lo largo de 30 minutos. Repetir el punto 2. al compararlo con un control positivo. 2) Aclarar dos veces en tampón para lavado.

PRUEBAS SEROLOGICAS SEGÚN CADA BACTERIA Shigella Reaccion en cadena de la polimerasa (RCP) Inmunoanalisis enzimático comercial para detectar toxinas de la familia shiga 70 .

Salmonella Prueba de Widal clásica para las “aglutininas febriles” 71 .

Reaccion en cadena de la polimera (RCP) Proteus Reaccion de weil-felix Helicobacter 72 .

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP: cuenta con la ventaja de poderla utilizar también con muestras de jugo gástrico. saliva. convirtiéndola en una prueba no invasiva Prueba ELISA que detecta niveles de IgG. 73 . placa dentaria y heces.

Brucella La prueba de coombs Análisis de inmunoabsorcion ligado a enzimas 74 .

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP Haemophilus La prueba de Inmunoelectroforesis es eficaz para detectar PRP 75 .

La Prueba de aglutinación de látex y la Prueba de inmunoabsorcion ligada a enzimas son eficaces para detectar PRP Bordetella Reaccion en cadena de la polimerasa RCP 76 .

Inmunoensayo enzimático que detecta anticuerpos igA e igG contra la toxina de la tos ferina Vibrio 77 .

Reaccion en cadena de la polimerasa sobre sondas de ADN para V. cholerae O1 y O139 Mycobacterium tuberculosis Las pruebas serológicas para la mayoría de los antígenos micobacterianos tienen poco valor predictivo cuando se aplican a una población que se supone tiene pocas probabilidades de padecer la enfermedad Mycobacterium leprae En un 95% de los pacientes con lepra lepromatosa se encuentran anticuerpos igM contra el PGL-1 En los pacientes con lepra tuberculoide solo un 60% tiene un titulo significativo de de anticuerpos anti PGL-1 Por eso la serología tiene poco valor en la lepra Treponema pallidum Hay dos clases de pruebas para investigar la sífilis: No treponemicas: Prueba rápida de reaginas en plasma (RPR) y la prueba sobre portaobjetos (VDRL) Treponemicas: 78 .

La prueba fluorescente de absorción de anticuerpos antitreponemicos(FTA-ABS) y la prueba seriodia TP-AP Chlamydia trachomatis Las técnicas de enzimoinmunoanalisis(ELISA) y la prueba de la fijación del complemento(FC) con antígeno termoestable especifico de chlamydia. Neisseria gonorrhoeae 79 .

como una célula o una bolita de látex. siendo la prueba positiva. En la prueba de aglutinación el antígeno o el anticuerpo se fija a una partícula de gran tamaño. Este tipo de pruebas suele ser extremadamente sensibles pro al mismo tiempo suele padecer de falta de especificidad por el hecho de ser mayoritariamente IgM lo que se detecta.Puede que las técnicas de amplificación del ADN como la PCR terminen por resultar equivalentes o superiores a las técnicas de cultivo. Si se produce la aglutinación. Pruebas De Aglutinación Fundamento: Esta prueba determina la presencia o ausencia de un determinado anticuerpo o antígeno en una muestra problema. el anticuerpo y las partículas a las que se fijan. Por lo tanto en la prueba de aglutinación se forma un coagulo visible que esta constituido por el antígeno. la mezcla de la muestra con el reactivo dará lugar ala formación de coágulos. Se utilizan con antígenos particulados tales como una suspensión bacteriana. La prueba es negativa si no se produce aglutinación. Las enterobacterias que pueden ser identificadas es 80 . Detectan preferentemente IgM.

control positivo una gota. Incline la lamina de atrás hacia adelante suavemente por 3 minutos mientras observa la aglutinación INTERPRETACION: 81 .coloque en las divisiones separadas (celdas) de la misma lamina: una gota de suero. mycobacterium leprae.adicione una gota de reactivo latex a cada celula. 4. vibrio.lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y mezcle suavemente antes de usar..     mycobacterium tuberculosis. haemophilus. 5. control negativo una gota. 3. DESARROLLO 1. 2. treponema pallidum... Mezcle con el extremo plano de la pipeta / mezcle y esparza el fluido regularmente sobre cada celda.

ELECTROFORESIS
“Técnica De Electroforesis En Gel De Agarosa”

Fundamento:
Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de
migración adecuado, de modo que la separación sea
eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente
fuerza de rozamiento para que las moléculas de distinto
tamaño se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste
en una red compuesta por un polímero orgánico y que
aumenta considerablemente la fricción, impidiendo a la vez
la difusión de las moléculas a través del medio acuoso en
todas las direcciones.
Las enterobacterias que se pueden observar son:
Mycobacter,
E. coli,
Pseudomonas.

Método de realización:
1) El DNA plasmídico es extraído con una micropipeta
automática agregando a un tubo eppendorf con 2 ml de
Loading Buffer.
2) Mezclarlos cargando y descargando con la micropipeta.
3) Luego se cargó la pipeta con toda la muestra del tubo.
4) Se la apoya en uno de los bordes del pocillo del gel de
agarosa.
5) Descargar su contenido en el pocillo.

82

6) Se conecta la cuba que contenía al gel a un electrodo,
con el polo positivo en el lado opuesto al sitio de
siembra.
7) El buffer en que está inmerso el gel posibilita que circule
corriente eléctrica, ya que presenta iones (el agua
destilada no conduce electricidad, por eso no se puede
utilizar como medio de corrida). Se corre a voltaje
constante (3-5 V/cm) hasta que el azul de bromofenol
haya migrado aproximadamente 10 cm.
8) Se apaga la fuente y se expulsa el gel a radiación
ultavioleta (colocado en un transiluminador ultravioleta).

INTERPRETACION:

83

“Electroforesis Capilar”
Fundamento:
Es una técnica de separación utilizada en distintas áreas
para separar las diferentes moléculas presentes en una
disolución de acuerdo a la relación masa/carga de las
mismas. La separación se lleva a cabo en un tubo hueco de
diámetro muy pequeño, de ahí que reciba el nombre de
capilar. Dentro de este capilar se encuentran la disolución
que contiene los analitos o las moléculas a separar y el
tampón o medio electrolítico que es el encargado de
conducir la corriente. La separación se lleva a cabo según la
relación masa/carga de las distintas moléculas. Para que
esto sea posible es necesario aplicar una diferencia de
potencial entre los dos extremos del capilar que hará que
las moléculas se muevan hacia un extremo u otro del
capilar (movilidad electroforética) (las moléculas catiónicas
hacia el polo negativo y las aniónicas hacia el polo positivo)
y que se vayan separando entre sí. Además existe dentro
del capilar otro fenómeno denominado flujo electroosmótico
que se da debido a que la superficie interna del capilar está
cargada. El flujo electroosmótico es el mismo dentro de
todo el capilar y afecta de igual forma a todas las moléculas
arrastrándolas hacia uno de los extremos. Así, la separación
se vera afectada por el flujo electroosmótico y por la
movilidad electroforética de cada una de las moléculas.
La eficacia y la velocidad de la separación se pueden
mejorar mediante la optimización de diferentes factores
como son la temperatura, el voltaje aplicado, el medio de
separación, el disolvente en el que se encuentra disuelta la
muestra, etc. Generalmente se obtienen tiempos de análisis
bastante bajos si se compara con otras técnicas separativas
como la cromatografía de gases o la de líquidos.
Algunas de la enterobacterias que se puede diagnosticar
con esta prueba son: Pseudomonas aeruginosa, Candidas.

84

Método de realización:
1) Se introduce la muestra dentro del capilar se cambia el
vía de entrada por la vía con muestra y se aplica la
inyección durante 10-30 seg. Introduciéndose en el
capilar un volumen de muestra del orden de nanolitros.
2) El tampón de separación rellena una columna capilar.
3) El uso de capilares evita los problemas asociados al
calentamiento o degradación de los electrolitos

y

compuestos. La muestra migra hacia el otro extremo.
4) Los resultados son en aspecto similares a

la

cromatografía

aportando

información

cualitativa

y

cuantitativa.
INTERPRETACION:

85

Al seguir los procedimientos correctamente también se identificaran las bacterias que afectan al hombre. 86 . Gracias a la manera de explicar y los conocimientos bien fundamentados que nos proporciono el catedrático. ayudara al médico a proporcionar el tratamiento correcto del paciente. Los conocimientos contenidos en este manual de identificación son de vital importancia ya que la persona que efectúe las prácticas debe hacerlo con total responsabilidad y exactitud ya que en sus manos está la vida del paciente (por ejemplo si hablamos de una mala identificación de una bacteria seria fatal para una persona si se le proporciona un medicamento incorrecto. este manual nos ayudo mucho en nuestra formación no solo como técnicos laboratorista clínico sino también todas sus enseñanzas nos servirán posteriormente cuando iniciemos una carrera profesional en el área clínica. Abarca desde una tinción bacteriológica común y hasta pruebas no comunes como las sistematizadas o las de ELISA. en la materia de bacteriología.CONCLUSION La creación de este manual de técnicas de identificación concluimos que será de gran utilidad para todo aquel que lo lea ya que contiene los conocimientos básicos para realizar prácticas de laboratorio así como los procedimientos adecuados y técnicas básicas bacteriológicas.

Epidemiology  Jacobson k.santafeconicet.  Chua j.jpg 87 . epidemiology of infection Clinmicrobioirev  Flynn. wayne lg New York 1984  Reich jm Johnson re * http://www.  Falkin j. et. chan j Immune evasion Curr opin inmunol  Horsburg c. Al a tale of two lipids.ar/servicios/comunica/electroforesis.BIBLIOGRAFÍA:  Centers for disease control and prevention MMWR 49:1 51.200  Centers for disease control and prevention Guidelines for preventing opportunistic Public health service and the infectious diseases society of America.gov. Clinical and radiological features  Karakousis pc.  Center for diase control and prevention . Bishai WR DORMAN  Kubica gp.