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GRUPO:

JUAN MANUEL RODRIGUEZ TAFUR DAVILA


JAIME DURAND PALACIOS
FRANKLIN JULI QUIROGA

Transferencia adoptiva de esplenocitos para estudiar las


respuestas celulares inmunes en la hepatitis C infeccin usando
ratones transgnicos HCV

Turaya Naas,, Masoud Ghorbani, Catalina Soare, Nicole Scherling, Rudy Muller,
Peyman Ghorbani, Francisco Diaz-Mitoma.
Comparative Hepatology 2010, 9:7
http://www.comparative-hepatology.com/content/9/1/7
Abstracto.
Antecedentes: El virus de la hepatitis C (VHC) es una causa importante de hepatitis
crnica y un problema de salud que afectan a ms de 170 millones de personas alrededor
del mundo.
Anteriormente estudiamos ratones transgnicos que expresan HCV Core, protena de
envoltura 1 y 2 predominantemente en el hgado, resultando en esteatosis del hgado y
tumores linfoides y carcinoma hepatocelular.
Aqu, la respuesta celular inmunitaria a los antgenos de la hepatitis C fue evaluada por
transferencia adoptiva de esplenocitos etiquetados con el ster de succinimidyl
carboxyfluorescein (CFSE) de ratones inmunizados con HCV en HCV ratones
transgnicos.
Resultados: En comparacin con los ratones no transgnicos, hubo una disminucin
significativa en el porcentaje de clulas en sangre perifrica marcadas con CFSE en
celulas T CD4+ y CD8+.
En el ratn transgnico que recibe transferencia adoptiva de clulas de ratones donantes
inmunizados.
Por otra parte, el porcentaje de clulas CD4 y CD8 marcados con CFSE + fueron
significativamente mayores en el bazo deratones transgnicos y no transgnicos cuando
reciban esplenocitos de ratones no-inmunizados que de ratones inmunizados;

Por otra parte, los porcentajes de clulas T CD4+ y CD8+ en los ganglios linfativos de los
ratones receptores no transgnicas fueron significativamente mayores que los ratones
transgnicos cuando recibieron la transferencia adoptiva de donantes inmunizados.
Los hgados de los ratones transgnicos que recibieron transferencias celulares de
ratones inmunizados tenan de manera significativa un mayor porcentaje de clulas T
etiquetadas con CFSE que los hgados de los ratones no transgnicos que recibieron
clulas de ratones no inmunizados.
Conclusiones: Estos resultados sugieren que las clulas T de los ratones inmunizados
con VHC reconocen las protenas del VHC en el hgado del modelo de ratn transgnico y
van a los sitios de expresin de antgenos de VHC.
Proponemos el uso de este modelo animal para estudiar las respuestas activas de la
clula de T en la infeccin por el VHC.

Introduccin.
El virus de la hepatitis C (HCV) es una causa importante de la enfermedad heptica
crnica en todo el mundo. El virus produce infeccin crnica en el 80% de pacientes
agudo infectado con HCV. Un subconjunto de estos individuos desarrollan una lesin
heptica progresiva que lleva a carcinoma del hgado, cirrosis o cncer hepatocelular.
La respuesta inmune al VHC desempea un papel importante en las distintas etapas de
la infeccin. Est emergiendo evidencia de la capacidad de los pacientes agudos
infectados con HCV en tener control de la infeccin primaria de HCV dependiendo de la
vigorosa reaccin inmune celular del virus.
En la fase crnica de la infeccin, la respuesta inmune determina la tasa de progresin de
la enfermedad, tanto al limitar la replicacin viral como contribuyendo al proiceso
inmunopatologico.
Los hgados de personas infectadas crnicamente por VHC. Estn infiltrados con clulas
T; sin embargo, estas clulas no son especficas para VHC y son incapaces de erradicar
el virus.
Estos linfocitos infiltrantes de hgado se asocian con dao heptico en infeccin crnica
por VHC a travs de mecanismos no son bien entendidas.
Hay varios mecanismos de evasin inmune, que podran explicar la capacidad del virus
de escapar de la respuesta inmune y establecer una infeccin persistente.
La estrategia de evasin inmune incluyen: mutacin del virus, falla primaria de respuesta
de la clula de T, pobre presentacin del antgeno, supresin de la funcin de la clula de
T por las protenas del VHC.

El deterioro de la maduracin de la clula de T y un medio ambiente tolerogenico en el


hgado. Sin embargo, la base inmunolgica de la ineficiencia de la respuesta inmune
celular en las personas crnicamente infectadas no est bien entendido.
La respuesta inmune celular juega un papel crtico en hgado causando dao durante el
curso clnico de la infeccin por hepatitis C.
Las clulas CD 4 HCV especificas participan en la erradicacin de del virus en la infeccin
aguda pero sus respuestas son dbiles e insuficientes en la hepatitis crnica.
Sin embargo, no existe clara evidencia de que clulas T, CD 4 juegan un papel directo en
el dao heptico observado en la infeccin crnica por el VHC.
Las clulas T CD 4 activan a las celualas CD8+ cuya respuesta citotxica linfocitaria
(CTL), elimina las clulas infectadas por el virus ya sea mediante la induccin de
apoptosis (mecanismo citoltica) o mediante la produccin de interfern gamma (IFN -g),
que suprime la replicacin viral (mecanismo no citoltica). La apoptosis del hepatocito
produce dao al hgado en las infecciones crnicas por VHC. Las respuestas CTL con
Celulas CD8 VHC especficas se compromete en la mayora de los pacientes que no
logran borrar la infeccin.
Adems, esas clulas tienen una disminucin en la capacidad para proliferar y producen
menos IFN- gama en respuesta a los antgenos del VHC.
Las respuestas de clulas CD8 ineficiente producen el dao heptico relacionado con el
VHC y es insuficiente en despejar la infeccin crnica.
Los mecanismos responsables inmune-mediada dao heptico asociado a VHC son poco
conocidos.
Uno de los mecanismos de dao heptico es el que los linfocitos T activados por VHC
expresan el ligando de Fas en la superficie de la clula, que se unir con el receptor Fas
en el hepatocitos, iniciando una sealizacin mediada por Fas, que
puede conducir a la muerte celular.
La proteina CORE del VHC aumenta la expresin del ligando de Fas en la superficie de
las clulas T infiltradas en el hgado induciendo inflamacin y dao del hgado [12,13].
Otra mecanismo importante de la respuesta nociva al hgado es mediada por la respuesta
inmune a travs de clulas CD8 + Citliticas.
Estudios anteriores de hepatitis inducida por concanavalina-A han demostr que celulas
T CD8 + pueden matar a las clulas blanco en vivo por mecanismos citolticos mediados
por perforina o que requieren IFN gama o TNF.

Por lo tanto, el nivel de actividad citoltica o expresin de mediadores de la citlisis de los


linfocitos de la infiltracin en el hgado puede ser un factor determinante para la induccin
del dao heptico mediado por el sistema inmune.
Es todava polmico si el dao heptico asociado a la infeccion por hepatitis C es debido
a la actividad citopatica del virus o el dao es mediado por los efectos de la respuesta
inmune.
Previamente, hemos demostrado el efecto directo de protenas virales en la patogenia de
la infeccin por el VHC en un modelo de ratn transgnico con VHC que expresa las
protenas estructurales de HCV, Core, E1 y E2 predominantemente en el hgado. Este
modelo mostro hepatopata, incluyendo la esteatosis heptica y tumores hepticos.
En este estudio, describimos un modelo para examinar el dao al higado mediado por
clulas inmunes utilizando la adopcin de esplenocitos de ratones inmunizados con VHC
transferidos a ratones transgnicos de VHC.
Nuestros resultados mostraron que la clulas Tde los ratones inmunizados con VHC
marcados con el ester de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) se alojaban en los
hgados de los ratones transgnicos de VHC lo que indica que estas clulas T activadas
contra VHC reconocen el transgn HCV y atacan a los hepatocito que expresan este
transgen , y que pueden producir dao heptico.

Mtodos:
-

Ratones

Todos los ratones utilizados en el estudio fueron adquiridos de la Charles River


Laboratories (Senneville, QC, Canad) y eran de un fondo gentico B6C 3F1. Ratones
fueron criados en condiciones libres de patgenos especficas en el centro de atencin
animal en la Universidad de Ottawa. Los animales fueron utilizados de acuerdo con las
directrices del Comit de cuidado animal de la Universidad de Ottawa. Los ratones
donantes fueron de 6 a 8 semanas de edad; los ratones de tipo salvaje y el raton
destinatario ambos fueron VHC transgnicos y no transgnicos, fueron 3 a 6 meses de
edad. El establecimiento y caracterizacin de estos ratones HCV transgnicos fueron
descritos en nuestro estudio anterior.
-

Plsmidos y protenas

Construccin del vector de expresin de Core, E1 y E2 pVAX fue descrito en nuestro


estudio anterior [17]. Brevemente, ARN total extrado del plasma de un paciente
infectados con el genotipo del VHC 1a fue utilizado como una plantilla para amplificar
genes Core, E1 y E2. El fragmento de VHC que contiene el Core, E1, y genes E2
truncados se construy a travs de RT-PCR usando la cartilla hacia adelante 5 ' ACC

AGC ATG AAT ACG CCT AAA CCTC 3 ' y hacia atrs cartilla 5 ' TGG TAG GGT GAA
TGT GGA ACA CG 3 '. El fragmento amplificado fue clonado en los sitios EcoR1
del vector pCR 2.1 utilizando el kit de clonacin TA TOPO (Invitrogen, Burlington, ON).
La secuencia de nucletidos fue verificado por la secuencia en la Universidad de
de Ottawa. El Core, los fragmentos E1, E2 posteriormente fue subclonado en plsmido
pVAX-1 (Invitrogen, Burlington, ON) posterior (5) a un promotor del citomegalovirus.
El vector de expresin de la proteina recombinante de HCV Core, E1 y E2 fue tambin
descrito en nuestro estudio anterior. Brevemente, la construccin TOPOTA
HCVcore/E1/E2 fue subclonedo del vector de expresion la pEF6 Myc- (Invitrogen
Burlington, ON); este vector contiene 6 residuos de histidina que permitio la purificacin
de la poliprotena del VHC inmovilizandolo por cromatografa de afinidad metlica
(Clontech Talon Kit de resina, Palo Alto, CA). El plasmido recombinante que contiene el
inserto correctamente orientado fue transfected en las clulas de DH5, amplificados y
purificados usando el Endofree plsmido purificacin kit (Qiagen), como descrito
previamente.
Las clulas de ovario de hmster chino fueron transfectadas transitoriamente con el
recombinante pEF6/Myc- Su vector con el inserto de base/E1/E2.
La transfeccin fue realizada por 2 choques de electroporacin en 1.4- 1.6 KV utilizando
un aparato de electroporacin (BTX Inc.,San Diego, CA).
Se incubaron las clulas transfected en IMDM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que
contiene 10% FCS (laboratorios de tecnologas de la vida, Grand Island, NY) y 50 g/mL
penicilina-gentamicina.
SE cosecharon las celualas 65 horas despus de la transfeccin, estas fueron lisadas en
tampn de lisis (25 mmol/L Tris base, mercaptoetanol 2,5 mmol/L, y 1% Triton-X100),
sonicadas y sometidas a la purificacin de protenas mediante el kit de resina de afinidad
Talon como descrito antes. Se verific la pureza de la protena por espectrometra de
masas y la protena con ~ 85% de pureza fue utilizada para la inmunizacin.
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Estrategia de inmunizacin de ratones donantes

Ocho ratones donantes fueron inmunizados con una vacuna de VHC que contengan
pVAX HCV Core, E1 y E2 ADN (100 g); Protenas core, E1 y E2 (25 g) en solucin de
PBS y adyuvante montanide (50 l) fue de ISA-51 (Seppic Inc., Fairfield, NJ).
Los ratones fueron inmunizados tres veces con 100 l de la vacuna y dos veces por va
intramuscular en el cudriceps mayor con intervalos de dos semanas entre cada vacuna
booster . Ocho ratones de tipo salvaje no inmunizados fueron inyectados con solucin de
PBS y montanide ISA-51 solamente y fueron utilizados como control negativo. Despus

de cada inmunizacin, la respuesta inmunitaria humoral fue evaluados por un ELISA IgG
usando suero de ratn.
La respuesta celular inmune se evalu mediante PBMCs aislados de la sangre despus
de las primeras vacunas y se uso d PBMCs aislados de esplenocitos despus de la ltima
vacunacin. Los ratones fueron anestesiados con 50 Somnotal (productos farmacuticos
MTC, Cambridge, ON, Canad), sacrificado y su sangre y bazo recogidos.
Preparacin de los linfocitos del bazo de ratn donante Ratones de donantes fueron
sacrificados con anestesia, y El bazo se retira y se coloca en tubos con PBS estril. Los
linfocitos se prepararon como una suspensin presionando suavemente segmentos de
rganos a travs de un colador de plstico fino de la clula con una pipeta de plstico;
entonces, 10 ml de PBS es aadido al pasar las clulas a travs de la malla.
Las suspensiones de clulas de bazo se limpian de celulas rojos de la sangre (RBC) con
tampn de lisis de glbulos rojos (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO 3 y 0.1 mM EDTA). La
suspensin celular se lavan tres veces mediante la adicin de 0.1% de BSA en PBS y se
centrifugan a 1600 rpm a 4 C por 5 min, la las clulas fueron contadas y divididas en 2
partes: las clulas etiquetadas con CFSE, que fueron utilizadas para la inyeccin y
ensayo de proliferacin CFSE y clulas para ensayos de CTL y ELISASPOT para evaluar
la respuesta inmune.
-

ELISA

Para evaluar el ttulo de anticuerpos contra la vacuna contra el VHC, Ratones


inmunizados fueron sangrados en diferentes puntos despus de las vacunas y se obtuvo
el suero. Niveles sricos de anticuerpos a la hepatitis C- se midieron con la poliprotena
VHC recombinante de ncleo/E1/E2 como molcula captura y un anticuerpo monoclonal
de ratn especficos-rbano como sistema de deteccin conjugado con peroxidasa (HRP).
EIA/RIA placas Stripwell (Corning CoStar Inc., Nuevo York, NY) fueron recubiertos con
20 g/ml protena Core/E1/E2 poly recombinante disuelto en agua estril destilada /
desionizada para 4 horas y se incub toda la noche a 4C. Despus del lavado, las placas
fueron bloqueadas con 1% de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PBS durante 1 h a
37 C.
Luego se lavaron las placas y las diluciones de los sueros fueron se incuba durante 2
horas a 37 C. Los anticuerpos fueron detectados con una dilucin 1/1000 en 1%
BSA/PBS de la necesaria Conjugado HRP anti-species-specific de cabra (IgG H+L:
Laboratorios Jackson Immunoresearch, West Grove, PA; IgG1, IgG2a: Serotec, Oxford,
Reino Unido).
Despus de cada tirmpo de incubacin, las placas se lavaron seis veces con PBS /
0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich). Se utilizaron para desarrollar la reaccin de color
FenilenediaminaDiclorhidrato (Sigma-Aldrich) y perxido de hidrgeno. La densidad ptica
(OD) fue ledo a 490 nm despus de la reaccin parada con 1 N HCl.

Un anticuerpo monoclonal de IgG2a especfico para ncleo protena aminocidos 1-120


(clon 0126, Ltd. de la biognesis, Poole, Inglaterra) y sueros pre inmunizacin o
negativos a a hepatitis C se corren en paralelo con todas las muestras como controles
negativo.
Valores de OD de por lo menos 2 desviaciones estndar por encima de la media de valors
de preimmunization se consideraban positivos para una Respuesta de anticuerpos de
VHC.
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Tincin intracelular de IFN gamma

Respuestas CTL por clulas CD8 + de raton se evaluaron por medicin de la produccin
IFN- gamma utilizandose una tincin intracelular. Se realizaron los procedimientos
intracelulares segn Protocolo de Caltag Laboratories. Brevemente, PBMCs aislados de
sangre fresca o los esplenocitos de ratones inmunizados fueron cultivados en medios
RPMI completo en la presencia de 10 brefeldin g/ml (Sigma) y estimulados con ncleo,
protenas E1 y E2, pptidos del core o polivinlico de vaccinia VHC (NIH SIDA, Cat #
9426) que expresan el ncleo del VHC-1, E1 y E2, P7, NS2 truncado.
Celulas sin estimular o estimuladas con vaccinia vaco fueron utilizadas como control
negativo. PMA/ION clulas estimuladas se utilizaron como control positivo.
Dieciocho horas despus de la incubacin a 37 C, las clulas se lavaron con azida de
sodio PBS/2% FCS/0.01% y la superficie del posillo enjuagada durante 15 min con
anticuerpo monoclional PE marcado contra ratn CD3 +, y anticuerpo marcado con TC a
CD 8 + y CD 4+. (Caltag Laboratories, Hornby, ON). Las clulas fueron lavadas como
arriba, fijadas y permeabilized con Caltag reactivo A y B de fijacin y permeabilizacin
soluciones (Caltag Laboratories). Las clulas se tieron intracelulamente con anti-ratn
IFN-g FITClabeled Ab y se incubaron durante 30 min (en la oscuridad) a 4 C. Despus
de lavado, las clulas fueron analizadas en un citmetro de flujo FacScan (Becton
Dickinson, Mississauga, ON). Las clulas con un aumento de 0,1% en la produccin de
IFN-g sobre el control sin estimular o estimuladas por virus de la vaccinia vaco se
consideraban como respuesta positiva a la vacunacin.
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IFN-g ELISPOT

Este anlisis se realizan segn el protocolo de Mabtech. Brevemente, una placa de


microtitulacin de 96 pocillos fue recubierta con anticuerpos monoclonales de ratn antiIFN-g (10 g/ml en PBS). Las clulas (250.000/bien) fueron agregadas a la placa con
cross bonding estimulantes de enlaces cruzados (cross bonding). Clulas estimuladas con
CORE, protenas E1 y E2, pptidos del core o vaccinia poli HCV. Las clulas estimuladas
por Vaccinia vaco o sin estimular fueron utilizadas como controles negativo. Celulas
estimuladas por PMA / in fueron utiliza como controles positivos. Despus de 48 horas
de incubacin, las clulas fueron eliminadas por lavado y un anticuerpo biotinilado contra
IFN-g (10 g/ml en PBS) fue agregado. En la posterior, se aadi la estreptavidina

conjugada con la enzima fosfatasa alcalina. Finalmente, se aade un sustrato de la


precipitacin (BCIP) de ALK P y las placas se incubaron hasta que surgieron en el sitio
manchas producto de las clulas que respondieron a estos antgenos . Los puntos fueron
examinados y contados en un sistema analizador de imgenes. El nmero medio de
clulas formadoras de lugar especficos (SFCs) se calcul restando la media de nmero
de manchas de clulas sin estimular o estimulada por vaccinia vacia y la media del
nmero de puntos en las clulas estimuladas con core, E1 y E2 o base de pptidos o
vaccinia recombinantes de poli de VHC.

Ensayo de proliferacin de los linfocitos

La proliferacin de clulas T CD4 + el se evalu despus de etiquetado los linfocitos


derivados del bazo con tinte CFSE (sondas moleculares de Invitrogen).
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Etiquetado clulas con CFSE

Diez mM de solucin madre de CFSE se prepar agregando 90 l dimetil sulfxido


(DMSO) a 500 g de CFSE liofilizado.. La solucin se diluy en BSA estriles de
PBS/0.1% BSA para obtener la concentracin deseada de trabajo de 10 M. purificada
linfocitos fueron suspendidos a una concentracin de 50 millones de clulas por ml de
BSA PBS/0.1% antes de la adicin de colorante de la CFSE.Se agrega de la solucin de
10 M de CFSE un volumen igual a 6 veces mas que el volumen de la solucin celular en
un tubo y mezclar bien todo con un vrtex.
Los linfocitos marcados se incubaron durante 15 min a 37 C. La tincin CFSE se
suspende mediante la adicin de 5 volmenes de RPMI medios completo helado
seguidos por una incubacin de 5 minutos en hielo.
Las clulas se lavaron tres veces en los medios RPMI completo y resuspendidas en RPMI
completo (2 millones de clulas por ml para el ensayo de proliferacin y clulas 40
millones en 75 l PBS para inyectar a los ratones).
Para verificar las clulas marcadas con CFSE, muestras de las suspensiones celulares
fueron etudiadas en un citmetro de flujo y tambin se analizaron por microscopia
fluorescente. La proliferacin se evalu despus de la estimulacin de las clulas con
CORE, las protenas E1 y E2 (10 g/ml) o pptidos de la base (10 g/ml). PMA (10 ng/ml)
y ionomycine (1 g/ml) fueron agregados a las clulas como control positivo. Despus de
agregar el estimulante, las clulas se incubaron a 37 en 5% de CO2 durante 4 das. Las
clulas estimuladas entonces fueron cosechadas por centrifugacin a 1600 rpm por 5 min.
Los teidos celulares y manipulacin de la CFSE etiquetando clulas debe hacerse en la
oscuridad.
Superficie teida de cada clula estimulada con TC CD3 y CD4 PE por Citometra de flujo
de 3 colores.

Las clulas se incubaron 15 min en oscuridad a temperatura ambiente. Despus de lavar


con PBS/0.1 azide/5% FCS, las clulas fueron inmediatamente analizadas en FacScan o
fijadas mediante la adicin de un volumen igual de 2% paraformaldehdo y almacenadas
durante la noche a 4 C antes del anlisis. Las clulas teidas con CFSE tienen
fluorescencia muy brillante. Cuando las clulas proliferan, disminuye la fluorescencia de
las poblaciones celulares de brillante a dim. Clulas hijas tienen la mitad la intensidad
fluorescente de la clula del madre.
Las clulas etiquetadas con CFSE de los ratones donantes (n = 7) fueron agrupados e
inyectado por las venas de la cola de los ratones receptores (n = 7). 20 millones clulas
suspendidas en 75 l de PBS por ratn fueron inyectados. Los ratones fueron sangrados
24 horas despus de la inyeccin y luego sacrificados 7 das ms tarde.
Los tejidos recogidos y procesados para su posterior anlisis fueron: sangre, ganglios
linfticos, bazo, timo y el hgado. Los tejidos para FACS fueron procesados para obtener
suspensiones celulares presionando suavemente el tejido a travs de la coladera de la
clula y recogiendo las clulas en PBS estril.
Los hemates de la sangre se lisaron (3 - 4 veces), bazo y los ganglios linfticos (1 vez).
Las clulas fueron contadas y alliquotadas. La superficie celular se tio con anticuerpos
con fluorescencia dirigidos CD3 +, CD4 + o CD8 + de raton para la diferenciacin celular.
La citometra de flujo se llev a cabo en un instrumento de la citometra de flujo de 4
colores (CEPICS XL flujo Cytometry Systems, Beckman Coulter, Inc.).
Se ajusta de modo que la fluorescencia de las clulas de controles no vacunados o
controles negativos dentro de la primera dcada de una escala logartmica de cuatro
dcada en la que se muestra emisin.
Parcelas de citometra de flujo demostradas fueron por lo menos 20.000 eventos. Los
datos fueron analizados por el software FlowJo (rbol de Star Inc., Ashland, Oregon)
segn las instrucciones del fabricante. Se analizaron los niveles de expresin de
marcadores de diferentes antgenos de superficie, as como un marcador de proliferacin
intracelular.
-

Microscopa de fluorescencia

Microscopia de fluorescencia de fue utilizado para localizar los linfocitos en los rganos
intactos. Secciones gruesas de uno o dos mm de hgado congelado fresco y bazo fueron
montadas en un portaobjetos de microscopio empotrado de montaje y examinadas bajo
microscopa de fluorescencia (excitacin a 491 nm y emisin a 518 nm). El anlisis
histolgico para el estudio de los cambios histolgicos, hgado de ratn fueron en
paraformaldehdo al 4% y embebidos en parafina. Cinco m espesor secciones fueron
teidas con hematoxilina y eosina (H & E), segn mtodos estndar utilizados en el
Departamento de patologa y medicina de laboratorio en la Facultad de medicina,
Universidad de Ottawa.
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Anlisis estadstico de datos

Anlisis estadstico utilizan software Instat para hacer un ANOVA, seguido por la prueba
post hoc de Student-Newman-Keuls. Diferencias significativas se basan en P < 0.05.

Resultados
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Respuesta inmune en ratones de donantes inmunizados por el VHC

En este estudio, se utiliz la misma estrategia para inmunizar los ratones donantes.
Ratones inmunizados con una combina la vacuna VHC mostr una respuesta inmune
humoral y celular antiviral consistente, (la vacuna consisten en dos HCVcore/E1 /E2 ADN
y protenas y el adyuvante montanide A51). El ensayo de ELISA demostr un aumento
significativo de ttulos de anticuerpos contra inmunogenos HCV.
Hubo un aumento significativo de IgG total, IgG1, y IgG2a despus de la tercera
inmunizacin en 1:900 anticuerpottulo (* P < 0.005) (Figura 1).

Asimismo, en respuesta a antgenos del VHC CD4+ Se demostr la proliferacin de


clulas T por la coloracin de la CFSE. Despus de la ltima inmunizacin los
esplenocitos fueron cultivados en presencia de CORE, E1 y E2 pptidos polyprotein o
CORE.

Hubo un marcado incremento en la respuesta de proliferacin de la esplenocitos de ratn


inmunizado cuando eran estimulados con pptidos de HCV Core/E1/E2 o ncleo, tal como
se indica por la disminucin en la intensidad de la mancha de la CFSE.
La clula cambia al proliferar fluorescencia con ms baja intensidad debido a la
disminucin de la coloracin de la membranas de las clulas hijas. Las clulas hijas tienen
la mitad la intensidad fluorescente de las clulas de la matriz (figura 2).

CD8+ actividad citoltica de las clulas T fue demostrado por INF- g produccin utilizando
tincin intracelular y ELISPOT.
La produccin de INF- g fue significativamente mayor en ratones inmunizados frente a los
controles (Figura 3, 4).

Aproximadamente el 2% de los CD8 + Las clulas T producen IFN- gcuando eran


estimulados con pptido de core del VHC y 1.75% de las clulas producen IFN- g cuando
estimulamos con la codificacin de protenas recombinantes del VHC (vacuna de vaccinia
Poli HCV) (Figura 3 c, d).

Estos resultados fueron confirmados por IFN- g Biolgico. Los esplenocitos de los ratones
inmunizados produjo significativamente ms IFN g cuando eran estimulados con VORE,
protenas E1 y E2, pptidos del Core o vaccinia recombinante HCV de codificacin
protenas (poly HCV de vaccinia) (P < 0.05) (Figura 4).

Anlisis por Citometria de flujo de tejidos de ratn receptor

Para el estudio de la cintica de esplenocitos en el ratones HCV transgnicos y evaluar


indirectamente la respuesta inmune generada despus de la vacunacin VHC,
esplenocitos de los ratones vacunados y no, contoles, fueron recogidos y etiquetados con
CFSE antes de realizar a la transferencia adoptiva.
-

Esplenocitos CFSE etiquetado fueron luego confirmados por Microscopa


inmunofluorescente

(Figura 5).

Estas clulas fueron inyectadas por va intravenosa en animales transgnicos y controles


y seguido abajo en la sangre en vivo despus de 24 hrs. Siete das despus de la

transferencia adoptiva, ratones receptores fueron sacrificados. La transfieren,


la
ubicacin y el nmero de las clulas fueron detectadas por citometra de flujo en la
sangre, ganglios linfticos, bazo y hgado de los ratones receptores. Todos los grupos de
ratones receptores tienen porcentajes similares de celualas donante de CD4 + y CD8 +
Las clulas T a las 24 hrs toda transferencia, indicando que todos los grupos recibieron
similar cantidades de esplenocitos de donante (Figura 6a).

Siete das de la despus de la transferencia adoptiva, el porcentaje de Clulas CD4 + y


CD8 + T de los donantes en la sangre diferenciaron en los ratones receptores que
recibiern inmunizan o los no inmunizados con clulas del donante (figura 6b). Hubo una
significativa aumento en el porcentaje de clulas T del donante en la sangre de tipo
salvaje ratones que recibieron clulas de donantes inmunizados. En contraste, hubo una
disminucin significativa en el porcentaje de clulas T del donante en la sangre de los
ratones transgnicos haber recibido vacuna las clulas donantes.

De hecho, entre los grupos de ratones estudiados, los animales transgnicos tenan el
menor porcentaje de clulas T del donante en la sangre (figura6B). No hubo diferencias
significativas en el porcentajes de clulas de donantes en los grupos que recibieron
clulas de donantes no inmunizados.
Un mayor porcentaje de las clulas T de donantes de los grupos no inmunizados Se
alojaron en el bazo en comparacin con los animales inmunizados. Haba cuatro a diez
veces mas clulas T CD4 + y CD8 + en los bazos de ratones que recibieron esplenocitos
de ratones no inmunizados.
(Figura 7a).

Las clulas donantes de animales inmunizados Se alojaron en los ganglios linfticos slo
en los ratones de tipo salvaje. Haba algunas clulas marcadas en la linfa de los nodos

de animales transgenicos. Esto puede ser debido a alteraciones en los receptores de


autoguiado hacia el blanco de las clulas T en los ganglios de ratn transgnico.
Los porcentajes de CD4+ y CD8+ las clulas T en los nodos de linfa de ratn receptores
no transgnicas fueron significativamente mayores que en los ratones transgnicos
cuando recibieron clulas de ratones donantes inmunizados (Figura 7b).

La proporcin de CD8 + de clulas T fue superior que de CD4+ en los ganglios linfticos
de animales s de tipo salvaje receptores de ratones donantes inmunizados. No hubo
diferencias entre el receptor transgnico y no transgnicas en los grupos de ratn cuando
recibieron las transferencias de animales donantes no inmunizados.
En contraste con el raton -tipo salvaje, las clulas de los ratones inmunizados se alojaron
en el hgado de los ratones transgnicos segn lo demostrado por un triple aumento en la
ambos CD4 + y CD8 + de las clulas T en comparacin con los otros grupos de ratones
receptores (Figura 8). Esto puede indicar un mecanismo de captura o autoguiados hacia
el blanco para las clulas T en los higados de los animales transgnicos debido a la
expresin dominante de laTransgen de VHC.

Anlisis de la inmunofluorescencia y cambios histolgicos en los hgados de los ratones


receptores El anlisis de las secciones Immunofluoresientes de hgado de los ratones
transgnicos mostraron infiltracin de un nmero elevado de la clulas etiquetadas con
CFSE como son las clulas, cuando recibieron la transferencia los ratones inmunizados
(Figura 9a). Tincin H & E de secciones de hgado de un mismo grupo de ratones
receptores demostraron infiltracin de linfocitos al lado de los cambios histolgicos como
la esteatosis, debido a la expresin de transgenes (Figura 9b). Curiosamente, las clulas
del infiltrado se concentraron en las reas donde haba esteatosis.

Por otra parte, los ratones transgnicos que recibieron clulas de donantes no
inmunizados demostraron pocas clulas etiquyetadas CFSE en el hgado y no hay
infiltracin de clulas en las seccines heptica (figura10A, b).

Los ratones no transgnicos no demostraron cambios histolgicos y no hubo infiltracin


de clulas etiquetadas con CFSE, de donantes inmunizados (figura 9 c, d) o ratones no
inmunizados (Figura 10 c, d).

Discusin
En nuestro estudio anterior, mostramos un modelo de ratn HCV transgnicos con
expresin de protenas VHC estructurales (core, E1 y E2) en el hgado [17]. Estos
ratones transgnicos desarrollados formacin de esteatosis, hepatopata y tumores del
hgado debido a la expresin de la protena del VHC.
En este estudio,describimos una transferencia adoptiva de esplenocitos de ratones
inmunizado con VHC a ratones transgnicos de VHC. Como se mostr anteriormente [18]
as como como en este estudio, los ratones inmunizados con una combinacin de una
vacuna HCV de candidato de recombinante Plsmido de DNA de ncleo/E1/E2 HCV,
recombinante poliprotena del VHC y montanide demuestran una respuesta inmune
antiviral significativa humoral y celular.

En orden para confirmar la especificidad de la respuesta inmune antiviral esplenocitos de


ratones vacunados fueron transferidos a ratones transgnicos de VHC. Siete das
despus de la adopcin hubo una disminucin significativa en el porcentaje de cellas
CD4 marcados con CFSE + y CD8 + en sangre perifrica de los ratones transgnicos que
recibi las clulas de los donantes inmunizados , mientras que en los ratones no
transgnicos mantiene un alto porcentaje de las clulas T transferidos en su sangre. Esto
indica que las clulas inyectadas migraron de la sangre perifrica a diferentes rganos.
Por ejemplo, el nmero de clulas T etiquetadas CFSE de los ratones inmunizados fue
significativamente mayor en el hgado de los ratones transgnicos receptores en
comparacin con los recibi celual;st T etiquetadas CFSE de animales no inmunizados.
Las clulas T del raton inmunizado con VHC son selectivamente alojados en el hgado
de ratnes transgnico, es probable que debido al reconocimiento de los transgenes de
VHC o los antgenos que son expresados preferencialemente en este rgano.
Las respuestas inmunes contra los patgenos y la capacidad de los linfocitos para migran
a los rganos donde existen los antgenos del patgeno est demostrado. Aqu hemos
estudiado la Cintica de los linfocitos transferidos en diversos rganos de ratones
receptores. Los linfocitos derivados de VHC ratones inmunizados con VHC alojados en
los hgados de los ratones transgnicos VHC donde predominante se expresan los
antgenos HCV.
En contraste, los linfocitos de los ratones no inmunizados se alojan en el bazo de los
ratones receptores no transgnicos mientras que los linfocitos de los donantes
inmunizados se alojan preferentemente en los nodos de linfa en destinatarios no
transgnicas.
Hay mas clulasde de los animales inmunizados alojadas en el higado que clulas de
animales no inmunizados , sugiriendo una especificidad inmunolgica contra los
antgenos virales.
Se demostr que durante respuesta inmune adaptativ los dos tipos de clulas de T fueron
producidas; y generaron efectos de breve duracin Las clulas T, van a los sitios donde
el patgeno esta presente y tambin las T de memoria , que podra ofrecer proteccin
contra el patgeno que estuvo durante las respuestasinmune anterior.
La hiptesis de que los linfocitos de los ratones inmunizados incluira tanto clulas de T
effector que producen IFN- g y la T memoria . Sin embargo, deberan realizarse ms
estudios. Las clulas efectoras y las clulas T memoria con antgenos HCV son el
clulas que ms probablemente harian su hogar de los hgados transgnicos.
Otra fraccin linfocitos de memoria T permanecen en los ganglios nodos. HCVexperimentada o activada las clulas de T alojadas en los ganglios linfticos de ratones
no transgnicos porque all no es ningn destino especfico en los donantes notransgnicas.
El mayor conocimiento sobre los mecanismos que regulan linfocito autoguiado hacia el
blanco dara aplicaciones claras en el diseo ms eficaz de regmenes de inmunoterapia.

Hay fuerte evidencia de la importancia de ambos CD4 virus especficos + y CD8 + Clulas
de T en VHC remocin de virus, as como mediadores de dao celular heptico en la
infeccin de la hepatitis crnica C [20,21]. Los dos principales mecanismos de lisis
mediada por clulas T son perforina-granzima - Citotoxicidad mediada y Citotoxicidad
mediada por Fas. Ambos mecanismos pueden matar directamente las clulas infectadas.
El sistema Fas Fas ligando se piensa asociado a la muerte de la hepatocitos en pacientes
infectados crnicamente con hepatitis C virus. [23,24]. Los linfocitos infiltrantes de hgado
expresan Ligando de FAS que se unir con el receptor Fas en la superficie de hepatocitos
y se iniciara uan muerte mediada por Fas.
En estudios previos se ha demostrado las clulas T CD8 + pueden matar a los objetivos
en vivo por citlisis mediante por perforina y TNF- o requieren IFN- g. Hay varios
modelos experimentales de dao heptico inmune-mediado en la hepatitis crnica.
Modelos de transferencia adoptiva a animales transgnicos expresando HBV ha sido
descrito previamente.
Estos ratones desarrollan tolerancia las protenas codificadas por el virus, pero la infusin
de celuals no tolerantes puede causar inflamacin del hgado. A pesar de algunos
estudios in vitro mostraron que las pptidos VHC estructural, core y protenas E2, fueron
capaces de causar inmunosupresin [28-30], no existe evidencia que muestra que ratones
transgnicos que expresaban core VHC, E1 y las protenas E2 tienen inmunosupresin
global.

Conclusiones
Hemos sido capaces de transferir clulas T no tolerantes en ratones transgnicos que
expresan el transgn de VHC en los hepatocitos. La transferencia resulta en una rpida y
selectiva acumulacin de clulas T activadas en el hgado de los ratones transgnicos,
pero no el bazo o los ganglios linfticos.
En este estudio no estudiamos el destino de la clulas transferidas; sin embargo, parece
ser que estas clulas tienen el potencial de tener un efecto antiviral con inflamacin del
hgado y, por consiguiente ms lesiones graves.
Por otra parte, sugerimos que la transferencia adoptiva de esplenocitos de ratones
inmunizado con VHC en Ratones transgnicos HCV es un buen modelo para el estudio de
los mecanismos de lesin heptica en la hepatitis crnica por hepatitis C. Este estudio
puede ayudar potencialmente a la desarrollo de una estrategia de inmunoterapia para el
VHC.