Ano III - Ed.

13 - Jan/Fev/2006 - Circulao Bimestral

INFORMATIVO CEFAR DE MICROBIOLOGIA

ATUALIDADES CIENTFICAS
PROCEDIMENTOS PARA A CONSERVAO DE MICRORGANISMOS
INTRODUO

A preservao ou conservao de microrganismos por longos

perodos de tempo tem sido sempre uma parte importante da microbiologia. Este procedimento, que na verdade se traduz pelo
uso das mais variadas tcnicas, permite o uso no imediato e s
vezes bastante tardio dos microrganismos em pesquisas, na prtica clnica, em estudos epidemiolgicos, etc.
Considera-se uma preservao ecaz quando esta mantm o microrganismo num estado vivel, livre de contaminao e sem mudanas em caractersticas fenotpicas e genotpicas.
Existem vrios mtodos para a preservao microbiana. Estes
mtodos tem sido geralmente desenvolvidos atravs do estudo
de apenas uma espcie ou observando-se um pequeno grupo de
microrganismos.
Na escolha do mtodo mais adequado de preservao dos microrganismos devem ser considerados os seguintes pontos:
a. Tamanho estimado do acervo;
b. Importncia do acervo;
c. Necessidade de acesso e uso da cultura;
d. Disponibilidade de equipamentos recursos humanos e
nanceiros.
Neste trabalho apresentamos mtodos que podem ser utilizados
para a preservao de bactrias, protozorios, fungos e vrus.

Mtodos de Preservao por Curto Prazo:

1. Repique Contnuo

O subcultivo ou passagem de colnias para meios estreis, o

mtodo mais simples para se obter viabilidade a curto prazo de
organismos, e o mais freqentemente utilizado em bactrias. Infelizmente, a cada transferncia para uma nova subcultura aumenta a possibilidade de mutao, com indesejveis mudanas
nas caractersticas do microrganismo. Alm disso, o espao requerido por organismos preservados desta maneira pode se tornar
um problema dependendo do nmero de espcimes e do perodo
de tempo em que caro armazenados desta forma.
O intervalo entre transferncias tambm varia entre microrganismos, portanto deve-se observar o comportamento de cada espcie
com a qual se trabalha e evitar fazer estimativas atravs de outras
espcies.
importante frisar que a taxa de mutao bastante varivel. Alguns organismos aparentam estabilidade indenida mesmo depois
de repetidas transferncias enquanto outros apresentam mudanas
fenotpicas em poucas passagens, como duas ou trs.

1.1 Meio de Conservao

O meio de cultivo a ser usado deve permitir a sobrevivncia do
organismo, mas minimizar os processos metablicos e reduzir a
taxa de crescimento. O organismo no deve ser colocado em um
ambiente estressante, pois isso pode induzi-lo a mutar para se tornar mais compatvel com o seu novo habitat. Um meio de cultivo
com altos ndices de nutrientes ir induzir uma rpida replicao
que necessitar de transferncias mais freqentes.

1.2 Condies de Armazenamento

Muitos laboratrios armazenam microrganismos, normalmente
bactrias, por pequenos perodos em meio de cultura de uso geral
(Ex: Nutriente Agar). Culturas mantidas desta forma tendem a
desidratar. Para minimizar o efeito da desidratao os organismos devem ser transferidos para um tubo de ensaio com tampa
de rosca e armazenados de maneira ordenada, protegidos da luz
e de variaes de temperatura. Para aumentar a proteo contra
a desidratao, as tampas podem ter uma camada de borracha ou
podem ser vedadas com lme de pvc antes ou depois da tampa
ser rosqueada.
A conservao em temperaturas baixas (5 a 8C) reduz a velocidade dos processos metablicos e auxilia a manter a viabilidade
por perodos mais longos.

1.3 Freqncia de Transferncias

No existe um protocolo estabelecido para a freqncia de transferncias, uma vez que as condies de armazenamento, o meio
usado e os organismos preservados variam de um laboratrio para
outro. Cada laboratrio deve conduzir estudos para cada espcie
de organismo para estabelecer intervalos aceitveis entre transferncias nas condies utilizadas para o armazenamento. Estes estudos envolvem a realizao de subculturas em intervalos
pr-estabelecidos at que um intervalo aceitvel com recuperao
completa do organismo seja identicado.
Quando as transferncias so realizadas, 5 a 10 colnias representativas devero ser usadas para evitar a possibilidade de introduo de uma caracterstica fenotpica ou genotpica alterada.

1.4 Procedimentos para Controle de Qualidade

A cada transferncia, anlises peridicas devero ser realizadas
para se vericar as condies atuais das espcies. Pureza, caractersticas morfolgicas e siolgicas dos espcimes devero ser
determinadas e registradas de maneira adequada.

1.5 Vantagens e Desvantagens

Vantagens:
- Baixo custo;
- No requer equipamentos especializados;
- O manuseio simples.
Desvantagens:
- Riscos de contaminao e possvel perda da linhagem;
- Perda de caractersticas morfolgicas, siolgicas e patogenicidade;
- Seleo de clulas atpicas (variantes ou mutantes);
- Superviso especializada;
- Mo de obra;
- Espao relativamente grande para o armazenamento;

2. Imerso em leo Mineral

Uma alternativa de conservao simplesmente fechar os tubos
aps adicionar uma camada de leo mineral sobre o espcime.
Muitas bactrias e fungos podem ser armazenados por 2 a 3 anos
por este mtodo, pois h uma diminuio da atividade metablica
e transferncias no so necessrias com tanta freqncia. Contaminao do espcime pode acontecer se o leo mineral no for
adequadamente esterilizado.
O leo mineral deve ser de grau medicinal com gravidade especca 0,865 a 0,890. Para esterilizao o leo dever ser aquecido
em um forno a 170C por 1 a 2 horas. A autoclavao no considerada aceitvel.
Para preparar o espcime, um inculo de 5 a 10 colnias do organismo dever ser colocado num agar inclinado ou num tubo
contendo meio em caldo. Uma vez que o crescimento identicado, uma camada de leo de 1 a 2 cm de profundidade dever
ser adicionada e o agar no poder car exposto ao ar. Testes de
viabilidade so realizados da mesma maneira que no mtodo de
transferncia direta (item 1 deste trabalho) para se estabelecer a
periodicidade de transferncias.
Vantagens:
- Baixo custo dos equipamentos;
- Evita contaminao por acaso;
Desvantagens:
- Necessidade de mais transferncias at que a cultura revigore;
- Requer espao para armazenamento.

3. Congelamento a -20C
O congelamento em freezers comuns a 20C usado em alguns
casos para se preservar organismos por um perodo mais longo
do que quele obtido pelas transferncias repetidas. Enquanto
a viabilidade de alguns organismos pode ser mantida por 1 ou
2 anos a maioria dos organismos no sobrevive em funo dos
danos causados pela formao de cristais de gelo e a da utuao
de eletrlitos nessa temperatura. Foi observado que o meio de
cultivo apresenta funo preponderante uma vez que o tempo de
preservao podia variar de alguns meses a alguns anos dependendo do tipo de meio de cultivo usado. importante observar que os freezers do tipo frost-free (livre de gelo) no devem
ser utilizados, pois neles ocorrem utuaes de temperatura que
destroem os organismos.

4. Secagem

4.1 Solo Estril

Enquanto a maioria dos organismos no sobrevive secagem, alguns, especialmente aqueles formadores de esporos e alguns fun-

gos, podem ser secos e armazenados por perodos prolongados.

Amostras de solo podem ser usadas como meio de armazenamento se tiverem sido previamente autoclavadas e dessecadas.
O solo esterilizado seco e transferido para tubos de ensaio estreis (aproximadamente 5 g), realizada a inoculao de 1 mL da
suspenso do organismo e a amostra estocada em refrigerador.

4.2 Slica Gel

A slica-gel comercial pode ser utilizada em tubos de ensaio
pequenos lacrados com algodo aps ser aquecida em forno por
175C por 1,5 a 2 horas, com um moderado sucesso de recuperao de fungos.

4.3 Discos ou Tiras de Papel

Alternativamente aos mtodos descritos anteriormente, uma suspenso de 108 organismos pode ser inoculada em discos ou tas
de papel-ltro estreis. O papel dessecado em ventilao forada ou a vcuo e colocado em frascos estreis. Esses frascos podem ser estocados no refrigerador por at 4 anos. Fitas ou
discos individuais podem ser utilizados conforme a necessidade.
Este mtodo comumente utilizado para o controle de qualidade
de microorganismos em geral.
Vantagens:
- Simples e de baixo custo;
- No requer equipamento especial;
- Estabilidade elevada;
- caros no sobrevivem.
Desvantagens:
- Mtodos limitados a bactrias e fungos lamentosos esporulados;
- Riscos de contaminao devido ao manuseio sucessivo.

5. gua Destilada
A maioria dos organismos no apresenta recuperao em gua
destilada, porm alguns sobrevivem por perodos prolongados.
Muitos fungos e Pseudomonas sp sobrevivem por vrios anos
em gua destilada em temperatura ambiente. Pesquisas apontam
que com exceo de fungos que no esporulam facilmente, 93%
de leveduras, fungos e actinomicetos aerbicos podem ser facilmente preservados desta maneira, cujo baixo custo uma vantagem adicional.
Os microrganismos devero estar, ao serem conservados, em blocos de agar de 4-6 mm3, colocados em tubos de ensaio contendo
de 10-15 mL de gua destilada e armazenados em geladeiras.
Vantagens:
- Boa taxa de viabilidade;
- Evita a contaminao por caros;
Desvantagens:
- Limitado a organismos que aderem ao agar (Castellani);
- Diculdade de retirada dos cubos na reativao (Castellani);
- Crescimento durante a estocagem;
- Requer espao para armazenamento;
- Riscos de contaminao

No perca no prximo CEFAR EM NOTCIAS, a continuao

deste artigo com a apresentao dos mtodos de Preservao
a Longo Prazo, como o Congelamento a -70, em Nitrognio
Lquido e a Liolizao de Microrganismos.

A CEFAR INFORMA

Mudana da Srie Urinria do Multifar 15

Os discos de Ac. Pipemdico (PIP 20) e Peoxacino (PEF-5) no fazem mais parte da srie urinria do Multifar 15, estes foram substitudos pelos discos de Gatioxacino (GTF 5) e Levooxacino (LVX 5), conforme se verica na tabela abaixo.

Sistema Multidisco Uso Clnico

O sistema Multidisco CEFAR, disponibiliza uma seqncia de antibacterianos padronizada por grupos bacterianos e uma alternativa segura e pratica na rotina laboratorial. Composto de 2 mdulos: um circular, onde so inseridos 9 discos e um estrelar, onde so
inseridos 6 discos formando um conjunto de 15 antibacterianos.

O uso do Multifar garante:

1. Praticidade e agilidade em rotinas clnicas;
2. Sries especcas para organismos gram-positivos, gram-negativos e isolados do trato urinrio;
3. Seqncia em conformidade com os critrios do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute);
4. A codicao dos discos, com 3 letras maisculas, segue o padro da Farmacopia Brasileira;
5. A seqncia de antibiticos no favorece a interposio de halos, no havendo prejuzo na leitura do teste;
6. O p
do teste;
7. Cada lote do produto aprovado segundo uma rgida norma tcnica que visa:
a) Discos com 100 a 125% da potncia (testes por curva padro) para garantir a estabilidade durante o prazo de validade.
Os limites sugeridos pelo FDA, rgo americano, so de 67 150%, e os sugeridos pela Organizao Mundial de Sade (WHO)
so 75 a 135%.
b) O enquadramento dos discos dentro dos limites, em milmetros, perante cepas-padro (ensaio qualitativo).
c) Dado ao baixssimo ndice de umidade e, conseqentemente, estabilidade fsico-qumica, dispensa o uso de dessecantes e pode
ser transportado por at 15 dias sem uso de caixa refrigerada.
d) Fornecimento, mediante solicitao, de certicado de anlise por lote de produto.

MULTIFAR 12

O Multifar-12 um sistema prtico para confeccionar o antibiograma,

evitando a perda de tempo na deposio individual dos discos nas placas de Petri (15 cm) e na montagem de aparelhos de distribuio dos
mesmos.
O Multifar-12 contm 12 antibacterianos selecionados segundo recomendao do CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) para grupos de organismos de importncia clnica.

Mdulo Cicular

Os discos esto aderidos a um mdulo circular de 8 antibacterianos

variveis conforme seja o organismo (gram-positivo, gram-negativo ou
do trato urinrio), ligado a um mdulo estrelar de 4 pontas, contendo
antibacterianos bsicos, invariveis e complementares ao mdulo circular.
O Multifar-12, devido ao seu espaamento uniforme torna mais fcil a
leitura das zonas de inibio.

Mdulo Estrelar
MULTIFAR 12

Com intuito de manter informado o cliente, bem como os profissionais da rea da microbiologia clnica, a CEFAR os
convidam a visitarem seu site

www.cefar.com.br

O site dispe das seguintes informaes:

Manual de produtos (download)
Metodologias de conservao de cepas
Vantagens do Multifar
Antibiograma passo a passo
Edies do jornal CEFAR EM NOTCIAS
Nossos Distribuidores
Pesquisa de Satisfao de cliente

PARA MAIS INFORMAES, SUGESTES OU DVIDAS CONTATE-NOS:

Sacc Servio de Assessoria Cientfica ao Cliente
Dr. Vladimir Netto
e-mail: sacc@cefar.com.br

Depto. Comercial
Sr. Carlos Eduardo
e-mail: vendas@cefar.com.br

Consulte tambm outros produtos da linha Cefar: discos para antibiograma,

meios de cultivo, laminocultivos gerais e especcos, bactrias - padro,
sistemas para identicao bacteriana, indicadores biolgicos, entre outros.

Jardim Anhangera - SP
04675-902

Dr. Vladimir Netto

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