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CUESTIONARIO:

1. A qu se le denomina una centrifugacin diferencial?


Es el proceso que tiene como resultado la obtencin de un sobrenadante y un
material sedimentado. Se basa en la diferencia en la densidad de las molculas.
Esta diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar. Las
partculas que posean densidades similares sedimentarn juntas. Este mtodo es
inespecfico, por lo que se usa como centrifugacin preparativa para separar
componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de ncleos y
membrana) pero no es til para separar molculas.
2. En qu consiste una centrifugacin isopcnica?
Constituye un ejemplo de centrifugacin mediante un gradiente de densidades. La
centrifugacin isopcnica separa les partculas en un gradiente de densidades en
funcin de la densidad de las mismas. Las partculas se mueven en el gradiente
hasta que llegan a un punto donde la densidad de stas i la del gradiente son
idnticas (de aqu el nombre de isopcnico). En este caso, es condicin
fundamental que la densidad mxima del gradiente final ha de exceder siempre a
la densidad de las partculas. Por este motivo la sedimentacin final no se produce
si se controlan las condiciones de centrifugacin, ya que las partculas flotan sobre
un "colchn" de material que posee una densidad superior a la de stas. Esta
tcnica se utiliza, por ejemplo, para separar partculas similares en tamao pero
de diferente densidad. En este sentido, la centrifugacin isopcnica es un mtodo
adecuado para separar cidos nucleicos o diferentes orgnulos celulares.
3. Consulte y explique detalladamente otras tcnicas de centrifugacin.

Centrifugacin zonal o de velocidad de sedimentacin

La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de centrifugacin, que


es un gradiente de densidad. Bajo la fuerza centrfuga, las partculas sedimentan a
travs del gradiente concentrndose en zonas o bandas discretas. Su velocidad
de avance (y, por tanto, el mecanismo de la separacin) depende de su tamao,
forma y densidad; todos estos parmetros se combinan en el coeficiente de
sedimentacin,
Coeficiente de sedimentacin=s=

velocidad de sedimentacin
aceleracin centrfuga

que se mide en unidades svedberg (1 S = 10 segundos).

La centrifugacin debe terminar antes de que alguna de las partculas separadas


llegue al fondo del tubo. Los componentes separados se recogen individualmente
aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo
del tubo y recogiendo en fracciones el lquido que cae.

Puede verse una animacin de la separacin.

1. El

tubo se llena con un gradiente de 2. La muestra (aqu, una


densidad, formado mediante un gradiente de mezcla de protenas) se
concentracin de un soluto adecuado (en este aplica sobre el gradiente.
ejemplo, sacarosa, entre un 5% y un 30%).
5%

d=1.018

30%

d=1.127

muestra

3. Se coloca el tubo en un rotor basculante y se realiza la centrifugacin.

Las molculas sedimentan de acuerdo con su tamao, forma y densidad (todo ello
determina su coeficiente de sedimentacin).

Eje del rotor

Borde exterior

El coeficiente de sedimentacin, s,
se define como la razn entre la
velocidad V a la que sedimenta la
molcula (o partcula, en general) y
la
aceleracin
centrfuga
aplicada, C. Este coeficiente se relaciona con el radio r y la densidad d de la
molcula, y con la densidad do y viscosidad del medio, de acuerdo con la
frmula siguiente:

El coeficiente de sedimentacin, s (minscula), tiene unidades de tiempo y


habitualmente se mide en unidades Svedberg, S (mayscula), siendo 1 S = 1013
segundos.
El gradiente de densidad se crea mediante un gradiente de concentracin:
concentraciones crecientes, al bajar en el tubo, de un componente adecuado. Se
usan para ello sacarosa, cloruro de cesio, albmina, suero fetal bovino..., o medios
comerciales como Ficoll un polisacrido sinttico, Percoll, metrizamida
Se puede preparar:
a) un gradiente discontinuo o escalonado, manualmente
b) un gradiente continuo, empleando un dispositivo formador de gradientes
c) un gradiente continuo autoformado, si se crea mediante centrifugacin,
normalmente a la vez que se fracciona la muestra

Centrifugacin zonal.
A) Preparacin de un gradiente continuo de densidad usando un mezclador.
B) Aplicacin de la muestra sobre el gradiente.
C) Colocacin de los tubos en un rotor basculante y centrifugacin.
D) Recogida en fracciones de los componentes separados.

Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares
sanguneos, purificar espermatozoides viables, separar clulas viables y no
viables de tejidos desagregados y muestras con clulas en suspensin, etc.

Mtodos de barrera

Mtodo rpido, tpico por


ejemplo en la obtencin de
leucocitos
de
sangre
circulante libres del resto de
clulas sanguneas. Se trata
de una centrifugacin a
travs de un medio de
densidad
constante
(se
podra considerar como un gradiente escalonado de una sola etapa). La densidad
de este lecho debe ser intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren
separar. Se
emplean
para
ello
medios
comerciales
como FicollPaque, Lymphoprep y otros muchos, formados generalmente por mezclas
de Ficoll (un polisacrido sinttico) y metrizamida (un compuesto sinttico
yodado). Se dispone de varios medios con densidades adecuadas para la

separacin de tipos celulares concretos; por ej., Nycoprep 1.077 para clulas
mononucleares, Nycoprep 1.068 para monocitos, Polymorhoprep para clulas
polimorfonucleares, o Nycoprep 1.063 para plaquetas.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

Harvey Lodish. (2005). Biologa celular y molecular. Estados Unidos: Ed.


Mdica Panamericana.

WEB-GRAFA:
http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/anim/centrif/sep-grad.htm
(Consultado el 30 de Octubre del 2016)
http://www.personales.ulpgc.es/ecastro.dbbf/Descargas/Transparencias/Te
cnicas%20generales.pdf (Consultado el 30 de Octubre del 2016)