You are on page 1of 26

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas
rahmat dan karunia-Nyalah kami dapat menyelesaikan laporan praktikum “isolasi
DNA” ini. Laporan ini disusun berdasarkan praktikum yang dilaksanakan Jumat,
20 Mei 2011 yang diberikan dengan mengacu pada standar kompetensi yang akan
dicapai oleh modul Biologi Molekuler. Langkah-langkah pada laporan ini
diuraikan secara rinci dan sistematis. Melalui laporan ini diharapkan kita semua
dapat mengetahui hal-hal mengenai isolasi DNA dan manfaatnya.
Akhirnya kami sebagai penulis mengucapkan terima kasih kepada dr. Virhan
Novianry selaku dosen yang telah membimbing kami dalam praktikum, dan
teman-teman angkatan 2010 program studi Pendidikan Dokter yang telah
memberi support dalam penyelesaian laporan ini.
Besar harapan kami agar laporan ini dapat memberikan manfaat bagi para
pembacanya. Namun demikian, kami menyadari bahwa masih ada beberapa
kekurangan dalam makalah ini. Untuk itu, kritik dan saran yang bersifat
membangun sangat kami harapkan.

Pontianak, Mei 2011

Kelompok

BAB I
PENDAHULUAN

3

1.1 Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya
adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein
histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas
memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.
Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.
Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon
dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki
protein histon.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari
materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu
sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002:
115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu

1.  Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.  Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR. Terdapat sejumlah tujuan dari isolasi DNA. antara lain:  Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.2 Tujuan Mengisolasi DNA dari darah vena dengan menggunakan kit Wizard Genomic DNA purification 1.  Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern  Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.3 Manfaat Menambah pengetahuan mahasiswa Program Studi Pendidikan Dokter Universitas Tanjungpura dalam praktek isolasi DNA .komponen dari campuran.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2. dan basa nitrogen.1 Asam Nukleat Asam nukleat adalah makromolekul biologis yang dibangun dari rantai panjang dari monomernya yaitu nukleotida. Nukleotida berikatan dengan nukleotida lainnya untuk membentuk polimer dengan ikatan 3I-5I fosfodiester yang menghubungkan gugus fosfat 5I pada satu nukleotida dengan gugus 5I hidroksil pada nukleotida lainnya. RNA memiliki gula ribosa yang memiliki gugus hidroksil pada atom c2. a. Ada 2 tipe asam nukleat yaitu DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid). . dua untai nukleotida dihubungkan dengan ikatan hidrogen pada basa nitrogen. Asam nukleat memiliki peran yang penting dalam kehidupan karena asam nukleat berperan dalam penyimpanan dan transmisi informasi genetik. gugus fosfat. Seluruh infirmasi genetik yang ada pada makhluk hidup terkode di dalam genom DNA dalam kode yang terdiri dari 4 tipe basa nitrogen yaitu adenin dan guanin dari golongan purin dan timin dan sitosin dari golongan poromidin. Pada asam nukleat untai ganda (DNA). b. Gula pentosa Gula pentosa adalah molekul yang menjadi inti struktur asam nukleat. Basa nitrogen Jenis basa nitrogen digunakan sebagai unit informasi dasar asam nukleat. DNA lebih berperan sebagai penyimpan materi informasi genetik sementara RNA berperan dalam transmisi dan ekspresi informasi genetik. Terdapat dua jenis gula pentosa yaitu deoksiribosa yang tidak memiliki gugus hidroksil (OH) pada atom c2 dan berperan dalam menyusun dalam menyusun DNA. Monomer dari asam nukleat adalah nukleotida yang terdiri dari gula pentosa.

penelitian dan analisis mengenai DNA sangat penting dalam memecahkan misteri bagaimana sifat suatu makhluk hidup dapat diwariskan dan disimpan. Teknik analisis DNA memiliki banyak kegunaan bagi berbagai bidang kehidupan seperti forensic. Gugus fosfat Gugus fosfat menghubungkan beberapa nukleotida menjadi untai asam nukleat. Sebagai pembawa informasi genetic. Sejak pertama kali didemonstrasikan sebagai molekul pembawa informasi genetic pada tahun 1944 dengan eksperimen oleh Avery. Macleod dan Mc. Variasi sekuens basa nitrogen pada suatu individu memberikan variasi antar mahluk hidup. nukleotida. Beberapa jenis virus memiliki DNA sebagai asam nukleatnya sementara beberapa jenis lainnya menggunakan RNA sebagai materi genetiknya. gugus fosfat c5 berikatan dengan gugus hidroksil pada atom c3 nukleotida lainnya membentuk ikatan fosfodiester yang mengikat nukletida menjadi polimer asam nukleat. basa adenin berikatan dengan timin dengan dua ikatan hidrogen sementara basa guanin berikatan dengan sitosin dengan 3 ikatan hidrogen. Pada asam nukleat. c. terdiri dari tiga komponen .1 Struktur DNA DNA tersususn dari dua untai polinukleotida yang diikat dengan ikatan hidrogen.Asam nukleat disusun oleh dua golongan basa nitrogen yaitu basa purin dan pirimidin. telah banyak dikembangkan metode dan teknik untuk dianalisis molekul DNA. Carty. Urin beranggotakan basa adenin dan guanin sementara pirimidin beranggotakan sitosin dan basa timin pada DNA yang digantikan basa urasil pada RNA. Monomer DNA.2. diagnosis penyakit. analisis kekerabatan dan hal lain yang berkaitan. Gugus fosfat terdapat pada atom c5. 2. Dalam DNA.2 DNA DNA (deoxyribonucleic acid) adalah asam nukleat pembawa informasi genetic pada seluruh makhluk hidup. 2.

2 Letak DNA DNA berperan sebagai materi genetic baik pada sel prokariotik maupun sel eukariotik. Adenin berpasangan dengan timin dengan 2 ikatan hidrogen dan guanine berpasangan dengan sitosin dengan 3 ikatan hidrogen. inti sel terpisah dari sitoplasma dengan membrane inti sebagai batasnya. kromosom akan terurai kembali untuk menjadi kromatin. Plasmid dapat ditransfer dari satu bakteri ke bakteri lain untuk mentransfer sifat tertentu ke bakteri target. Electron pada pasangan basa yang berikatan berinteraksi dan menimbulkan gaya penumpukan (stacking force) yang dengan ikatan hidrogen pasangan basa ikut menstabilkan heliks.dasar yaitu gula deoksiribosa. Selain DNA utama yang sirkuler. materi genetik bakteri juga dapat tersimpan di elemen yang lebih kecil di luar DNA utama yang disebut plasmid. G. DNA terlaetak pada kromosom yang terdapat di dalam inti sel . kromatin akan menggumpal dan saling berdekatan membentuk struktur kromosom. Setelah pembelahan sel. Untai ganda DNA pada inti sel memiliki struktur bertumpuk dan membentuk tangga spirall double heliks yang mengelilingi sepanjang aksis sentral molekul. Pada sel eukariotik.2. Pada inti sel. DNA eukariotik terikat dan tergulung ke protein histon membentuk suatu kompleks yang dikenal sebagai kromatin. fosfat dan basa nitrogen (A. Pada sel prokariotik. Hubungan antar nukleotida dihubungkan dengan ikatan fosfodiester pada ujung 3’ OH dan 5’ fosfat. Hubungan antar dua untai diikat dengan ikatan hidrogen antar basa nitrogennya. Saat akan terjadi pembelahan sel. Bentuk . Heliks mengandung alur yang ukurannya berselang-seling yang dikenal sebagai alur mayor dan minor. T dan C). Basa dala alur tersebut dapat terpajan dan berinteraksi dengan protein atau molekul lain. DNA tidak terpisahkan dari isi sel karena sel karena sel prokariotik tidak memiliki system membrane internal. 2.

Pemberian alkali digunakan untuk mengeluarkan RNA dari DNA dan memmisahkan untai DNA sebelum atau sesudah elektroforesis ada gel poliakrilamit atau agarosa.3.3 SALIVA 2.2. Diperkirakan bahwa mitokondria berasal dari sel prokariotik aerob yang melakukan endosimbiosis dengan sel eukariotik primordial. alkali tidak menyebabkan pemutusan ikatan fosfodiester DNA.5 liter oleh tiga kelenjar liur mayor (kelenjar parotis yang terletak dibagian bawah telinga dibelakang ramus mandibula. Selain pada inti sel. untai tunggal yang saling melengkapi (komplemen) dapat kembali menyatu dan membentuk pasangan basa untai ganda yang memiliki struktur heliks ganda yang identik dengan DNA asal. mukus dan enzim-enzim. kelenjar submandibularis yang terletak dibagian bawah korpus mandibula dan kelenjar sublingualis yang terletak dibawah lidah) dan minor (kelenjar . Panas juga dapat mengubah DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. 2. Saliva diekskresi hingga 0.1 %) dalam mitokondrianya. sementara proses penyatuan kembali (annealing) disebut renaturasi 2. Mitokondria sel eukariotik memiliki DNA untuk sintesis protein terutama sintesis enzim pernapasan.kromosom lebih berguna dalam pewarisan materi genetic sementara bentuk kromatin berguna dalam ekspresi gen. Apabila diturunkan suhu yang ada secara perlahan.1 Definisi Saliva merupakan salah satu dari cairan di rongga mulut yang diproduksi dan diekskresikan oleh kelenjar saliva dan dialirkan ke dalam rongga mulut melalui suatu saluran. Proses pelepasan dinamakan denaturasi. sel eukariotik juga memiliki DNA dalam jumlah yang sedikit ( < 0. tetapi tidak seperti pada RNA.5 – 1.3 Karakteristik DNA Alkali akan menyebabkan dua untai DNA terpisah. Saliva terdiri dari 98% air dan selebihnya adalah elektrolit.

Komponen Anorganik dari kation-kation.3.) adalah penting sebagai agen antibakterial yang bekerja dengan sisitem laktoperosidase. beberapa asam amino. dapat dibedakan atas komponen organik dan anorganik. protein kaya prolin. kelenjar Von Ebner dan kelenjar Weber). musin. Kadar Kalsium dan Fosfat dalam saliva sangat penting untuk remineralisasi email dan berperan penting pada pembentukan karang gigi dan plak bakteri. laktat. kelenjar Bladin-Nuhn. Bikarbonat. asam urat. Magnesium.labial. Namun demikian. Na+ menjadi jauh lebih rendah di dalam cairan mulut daripada di dalam serum dan K+ jauh lebih tinggi. Disebabkan perubahan di dalam muara pembuangan. Kadar Fluorida di dalam saliva sedikit dipengaruhi oleh konsentrasi fluorida dalam air minum dan makanan. Rodanida dan Thiocynate (CNS). kretinin. Protein yang secara kuantitatif penting adalah α-Amilase. Potassium dan Nitrat. dan beberapa hormon seperti testosteron dan kortisol. Ion Khlorida merupakan unsur penting untuk aktifitas enzimatik αamilase. Khlorida. Berikut adalah fungsi protein-protein dalam saliva: . Fosfat. yang dalam keadaan larut disekresi oleh kelenjar saliva. musin dan imunoglobulin. Kalium. Kalsium. Sedangkan komponen organik pada saliva meliputi protein yang berupa enzim amilase. lisosim. Sodium (Na+ ) dan Kalium (K+ ) mempunyai konsentrasi tertinggi dalam saliva. 2. maltase. kadar tersebut masih terhitung rendah dibandingkan dengan serum karena pada saliva bahan utamanya adalah air yaitu sekitar 99.2 Komponen Saliva Komponen-komponen saliva. kelenjar bukal. Komponen organik dalam saliva yang utama adalah protein.5%. vitamin C. serum albumin. Rodanida dan Thiosianat(CNS. Bikarbonat adalah ion bufer terpenting dalam saliva yang menghasilkan 85% dari kapasitas bufer. Komponen anorganik saliva antara lain : Sodium.

polisakarida mudah dicernakan. 2. 2. dan dengan demikian berguna bagi proses pembekuan darah. Beberapa faktor mempengaruhi sekresi saliva dengan merangsang kelenjar saliva melalui cara-cara berikut: 1.1. 4. Musin juga untuk membentuk makanan menjadi bolus. Protein kaya prolin membentuk suatu kelas protein dengan berbagai fungsi penting untuk membentuk bagian utama pelikel muda pada email gigi. Musin membuat saliva menjadi pekat sehingga tidak mengalir seperti air disebabkan musin mempunyai selubung air dan terdapat pada semua permukaan mulut maka dapat melindungi jaringan mulut terhadap kekeringan. Faktor kimiawi yaitu melalui rangsangan seperti asam. 3. Faktor mekanis yaitu dengan mengunyah makan yang keras atau permen karet. 6.3. . Faktor neuronal yaitu melalui sistem syaraf autonom baik simpatis maupun parasimpatis. manis. di antaranya faktor pembekuan darah XII. 4. pahit dan pedas. 2. Laktoperosidase mengkatalisis oksidasi CNS (thiosianat) menjadi OSCN (hypothio) yang mampu menghambat pertukaran zat bakteri dan pertumbuhannya. 3. 5. Kalikren dapat merusak sebagian protein tertentu. Faktor Psikis yaitu stress yang menghambat sekresi saliva. α-Amilase mengubah tepung kanji dan glikogen menjadi kesatuan karbohidrat yang kecil. Juga karena pengaruh α-Amilase.3 Faktor-faktor yang Mempengaruhi Sekresi Saliva Kelenjar saliva memproduksi saliva hampir setengah liter setiap hari. asin. Lisozim mampu membunuh bakteri tertentu sehingga berperan dalam sistem penolakan bakterial.

demineralisasi dan remineralisasi. epitel dan saraf. pembersihan mekanis. Selain itu lapisan protein pada elemen gigi geligi (acquired pellicle) memberi perlindungan terhadap keausan permukaan oklusal elemen gigi-geligi oleh kekuatan pengunyahan normal. Kalsium dan Fosfat memegang peranan penting dalam mekanisme penolakan terhadap dekalsifikasi email gigi dalam lingkungan asam (demineralisasi). 2. Rangsangan rasa sakit. gingivitis.4 Fungsi Fisiologis Saliva mempunyai fungsi yang sangat penting untuk kesehatan rongga mulut karena mempunyai hubungan dengan proses biologis yang terjadi dalam rongga mulut. pengeluaran virus-virus dan produk metabolisme organisme sendiri dan mikro-organisme. Secara umumnya saliva berperan dalam proses perlindungan pada permukaan mulut. 1. pencernaan makanan dan pengecapan serta diferensiasi dan pertumbuhan sel-sel kulit. aktivitas anti-bakterial dan agregasi mikro-organisme mulut. misalnya oleh radang. sedangkan ion-ion ini memungkinkan terjadinya remineralisasi pada permukaan gigi yang sedikit terkikis. Proses pembersihan mekanis terjadi melalui aktivitas berkumur-kumur menyebabkan mikro-organisme kurang mempunyai kesempatan untuk berkolonisasi di dalam rongga mulut. pengaturan kandungan air. Perlindungan Permukaan Mulut Saliva memberi perlindungan baik pada mukosa maupun elemen gigi geligi melalui pengaruh bufer.5. dan pemakaian protesa yang dapat menstimulasi sekresi saliva. Pengaruh bufer menyebabkan saliva menahan perubahan asam (pH) di dalam rongga mulut terutama dari makanan yang asam.3. .

Beberapa dari zat-zat ini dapat diresorpsi di dalam saluran pencernaan makanan. Pencernaan Makanan dan Proses Pengecapan Enzim saliva yang terpenting adalah α-Amilase yang terlibat pada pencernaan makanan. thiosianat. Pengaturan Kandungan Air Sekresi saliva sangat berhubungan dengan pengaturan kandungan air. meskipun kelihatannya infeksi melalui saliva jarang ditemukan. laktoperoksidase. Gejala ini timbul akibat produksi saliva yang kurang di dalam rongga mulut. Zat ini mampu untuk . Pengeluaran Virus dan Hasil Pertukaran Zat Berbagai jenis zat dikeluarkan ke dalam rongga mulut melalui serum seperti alkoloid tertentu. Apabila terjadi gejala kekeringan. alkohol. Agregasi mikro-organisme terjadi karena bakteri tertentu digumpalkan oleh komponenkomponen saliva seperti imunoglobulin. antibiotika.Di dalam saliva dijumpai berbagai komponen anorganik dan organik yang mempunyai pengaruh antibakterial dan antiviral. protein laktoferin dan imunoglobulin. sehingga para dokter gigi dan perawat gigi mempunyai risiko lebih besar terhadap infeksi hepatisis B.2 Pembasahan permukaan mulut diperlukan untuk menghindari dari gejala mulut kering atau disebut xerostomia. Misalnya. 3. 4. Kolonisasi bakteri di dalam rongga mulut akan terhalang dan selanjutnya dapat diangkut ke lambung. Hal yang sama pada prinsipnya juga berlaku juga untuk virus HIV pada penderita AIDS. hormon steriod dan virus. substansi reaktif kelompok darah dan musin. 2. Diketahui bahwa virus hepatisis B dapat ditemukan di dalam saliva pasien. enzim-enzim lisozim. sekresi saliva yang dihasilkan menjadi rendah dan timbul rasa dahaga.

atau langsung sasaran. Penyelam skuba selalu melapisi kaca mata menyelam mereka dengan selapis tipis saliva untuk menghidari kabut. 5. Protease. 2.4 Teknologi DNA Rekombinan DNA merupakan molekul seluler yang paling sulit dianalsis karena strukturnya yang panjang dan monoton. Enzim-enzim ini berperan dalam proses pencernaan makanan. Sampai awal 70-an. Gustin yang terdapat dalam saliva berfungsi dalam proses pengecaan makanan. Musin dan air berperan untuk membuat makanan menjadi bolus sebelum ditelan. DNAse dan RNAse. Kedua protein saliva tersebut diresorpsi melalui saluran usus lambung. Diferensiasi dan Pertumbuhan Syaraf (NGF) dan Epidermal (EGF) Faktor pertumbuhan syaraf (Nerve Growth Factor) yang dihasilkan oleh glandula submandibularis dibutuhkan bagi diferensiasi dan pertumbuhan sel-sel syaraf adrenergik. glandula submandibularis juga menghasilkan faktor pertumbuhan epidermal (Epidermal Growth Factor) yang berperan pada perkembangan jaringan kulit. Selain itu. Selain itu saliva juga berperan efektif sebagai agen pembersih untuk memelihara lukisan. Fungsi Non-Fisiologi Saliva dapat berperan sebagai anti-kabut (anti-fog). 6.menguraikan makanan yang mengandung tepung kanji dan glikogen dan dengan demikian melarutkannya di dalam saliva dan mengangkutnya. Cotton swab yang dilapisi saliva disapukan pada lukisan untuk membuang kotoran yang melekat pada lukisan tersebut. DNA hanya dapat . epitel dan erupsi elemen gigi-geligi. Di samping itu terdapat juga enzim-enzim lain yaitu Lipase.

2.5 Isolasi DNA DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia. memproduksi jumlah kopi region tersebut dalam jumlah banyak dan melakukan determinasi urutan nukleotida dari region tersebut dengan kecepatan basa 1000 ukleotida perdetik. 3. Kloing DNA dengan vektor bakteri atau teknik PCR yang memungkinkan satu molekul DNA digandakan menjadi jutaan molekul identik. Hibridisasi Asam Nukleat untuk menemkan urutan DNA atau RNA yang spesifik dengan tingkat akurasi yang tingi berdasarkan kemamuan mengikat urutan asam ukleat komplemennya. 2. RNA dan analisis genetik. Aktivitas utama dalam teknik DNA rekombinan adalah sebagai berikut: 1. 5. Teknologi ini memberi banyak manfaat pada kehidupan manusia. Memotong DNA pada tempat (site) yang spesifik dengan enzim restriksi endonuklease sehingga dimungkinkan untuk mengisolasi dan memanipulasi gen secara individual. Saat ini telah dikembangkan teknik untuk ekstrasi dan isolasi region spesifik dari genom. Pemantauan (monitoring) tingkat ekspresi suatu gen di dalam sel dengan mengunakan teknik microarray asam nukleat.dianalisis secara tidak langsung melalui analisis urutan protein. seperti produksi vaksin dan hormon. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi . hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel. Pengurutan (sequencing) semua nukleotida dari fragmen DNA yang telah dipurifikasi untuk mengidentifikasi gen dan memperkirakan urutan asam amino yang membentuk protein. Isolasi dan manipulasi DNA . 4. termasuk menggabung ujung-ujung sekuen dari sumber DNA yang berbeda untuk membuat molekul chimerik adalah esensi dari penelitian DNA rekombinan. dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast.

rambut. DNA genom manusia yang ditemukan dalam air liur dapat digunakan dalam berbagai aplikasi di diagnosa termasuk deteksi biomarker untuk mendiagnosis penyakit. Oleh karena itu DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti. seperti darah. DNA penyusun kromosom dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Setelah sel mengalami lisis. Isolasi DNA dari air liur untuk diagnostik telah menjadi alternatif yang menarik untuk isolasi dari darah atau jaringan karena fakta bahwa pengambilan sampel adalah non-invasif. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel. Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel. beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. penyakit itu mengikuti kemajuan atau memonitor efek dari pengobatan tertentu. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi.asalnya. remukan-remukan sel harus dibuang. Pada organisme tingkat rendah. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. liur dan lain-lain. yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi. tekanan tinggi. tulang. DNaA genom kloroplast berasal dari kloroplast. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Langkah berikutnya adalah lisis sel. sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat . Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik. semen.

. Protein seluler dipisahkan dengan presipitasi garam yang akan mempresipitasi protein tetapi membiarkan DNA genomic dengan berat molekul lebih besar. 2. 5. Wizard Genomic DNA Purification Kit dirancang untuk isolasi DNA dari sel darah putih. 3. Dalam satu set Kit Wizard ini terdapat beberapa reagen yang digunakan dalam isolasi DNA yaitu: 1. langkah ini meliputi lisis sel darah merah dengan cell lysis solution diikuti dengan lisis sel darah putih dan inti selnya dengan nuclei lysis solution. ragi.dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl 2. jaringan hewan. 4. Tiap kit tersebut digunakan dalam tiap tahap isolasi DNA. jaringan sel kultur. Digesti DNA dengan RNase Solution. 3. 4.6 Wizard Genomic DNA Purification Kit Dalam percobaan kali ini digunakan kit isolasi DNA yaitu Wizard Genomic DNA Purification Kit. Langkah terakhir adalah pengkonsentrasian DNA dan rehidrasi dengan isopropanol. Langkah ini adalah langkah optional untuk beberapa aplikkasi. serta bakteri gram positif dan negatif. Cell Lysis Solution 600 µl Nuclei Lysis Solution 300 µl RNase Solution 1. 2. Lisis sel dan inti sel. Dalam isolasi DNA dari sampel darah.5 µl Protein Precipitation Solution 100 µl DNA Rehydration Solution 100 µl Kit tersebut cukup untuk melakukan isolasi DNA 500 kali dari sampel darah sebanyak 300 µl. jaringan tanaman. Wizard Genomic DNA Purification Kit ini bekerja berdasarkan proses 4 langkah yaitu: 1.

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .

3. Masukkan 900 µl cell lysis solution ke dalam tabung microcentrifuge steril 2. Alkohol 70% 3. Pipet larutan 5-6 kali untuk melisiskan sel darah putih dan inti sel. 4. Saliva 300µl 3. Microcentrifuge tube 1. 2-3 kali selama inkubasi) Sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm pada suhu ruang selama 1 menit Buang supernatan tanpa mengganggu pellet Tambahkan 600µl cell lysis solution ke pellet dan vortex sebentar Ulangi tahap 4 dan 5 sampai pellet terlihat putih Tambahkan 300 µl nuclei lysis solution ke pellet.1 Alat 1. Wizard genomic DNA purification a. Larutan harus benar-benar . Isopropanol 2. Tambahkan 300 µl saliva dan tabung diputar bolak balik 5-6 kali untuk homogenasi 3. kemudian uraikan atau rusakkan dengan protein precipitation solution c.5-10µl.2 Bahan 1. 5.5 ml Micropipet 0. 6. Melisiskan sel dengan cell lysis solution b. Urutan cara kerja: 1. 10-100 µl.1.1 Alat dan Bahan 3. 2.2 cara kerja Ada 4 tahap dalam proses isolasi/purifikasi DNA dari sel: a. Rnase solution d. 7. 6. Inkubasi campuran diatas selama 10 menit dalam suhu ruang (bolak-balik 4. 5. Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh.3.1. Melisiskan inti sel dengan nuclei lysis solution. Nuclei lysis solution c. 8. Cell lysis solution b. Protein precipitation solution 4. 100-1000µl Vortex Microcentrifuggator Inkubator Spuit disposable 5 ml 3.

Optional. Rehidrasi DNA pada suhu 650c selama 1 jam pada suhun 40c 21. Inkubasi campuran pada suhu 370c selama 15 menit. 9. inkubasi campuran tersebut pada suhu 370c sampai butiran tersebut hilang. Tambahkan 1. 17. 10.5 µl Rnase solution dan campurkan dengan cara membolak-balik tabung. 16. 19. ambil supernatant tersebut. Sentrifugasi pada kecepatan 13000rpm pada kecepatan 13000rpm pada suhu ruang selama 2 menit. pindahkan ke tabung microcentrifuge bersih. sampai DNA berubah menjadi transparan 18. Setelah divortex akan terlihat butiran-butiran protein halus. ulangi langkah 11 dan 12 13. Bolak balik tabung secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA) 15. 12. 11.jadi kental. lalu dinginkan pada suhu ruang. Buang supernatant. Simpan DNA pada suhu -200c . cuci dengan 400 µl alkohol 70% dingin. Jika masih terlihat butiran-butiran kecil setelah pencampuran. Tambahkan 100µl protein precipitation solution ke dalam lisate dan vortez selama 20 detik. Bila supernatan masih berwarna coklat. keringkan DNA pada suhu ruang. Sentrifugasi dengan kecepatan 13000rpm pada suhu ruang. Akan terlihat pellet putih. Pindahkan supernatant ke dalam tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 1 ml isopropanol 14. Larutkan DNA dengan 100µl rehydration solution 20. Sentrifugasi dengan kecepatan 13000rpm selama 3 menit pada suhu ruang. Buang supernatant. Akan terlihat pellet dengan warna coklat terang.

Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam. Raven & Johnson 2002: 94).1 Pembahasan DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon. sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4. DNA terdapat pada nukleus. struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. dan pasangan basa. sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315–316. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki . DNAmemiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya. gugus fosfat. yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. mitokondria dan kloroplas. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. yaitu basa purin dan pirimidin. yaitu gula pentosa (deoksiribosa). Selain itu. Dilihat dari organismenya. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular. DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas.

Lewiston 2002:1–3. Bikarbonat. Melisiskan sel dengan cell lysis solution 2. satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176– 178). yaitu: 1. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin. Tahap pertama yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan . Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. maltase. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball 2005: 4. DNA manusia dapat diisolasi melalui saliva. Kalium. Magnesium. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa. Rodanida dan Thiocynate (CNS). Mengkonsentrasikan DNA genom yang diperoleh. musin. asam urat. vitamin C. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan. baik pada manusia maupun pada tumbuhan. beberapa asam amino. Kalsium.struktur cincin-ganda. Fosfat. Khlorida. sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. LPCH 2005: 2). Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sedangkan komponen organik pada saliva meliputi protein yang berupa enzim amilase. Potassium dan Nitrat. lisosim. dan beberapa hormon seperti testosteron dan kortisol. Saliva terdiri atas Komponen anorganik saliva antara lain : Sodium. kretinin. laktat. (Human Genome Project 2005: 1) DNA juga dapat diisolasi. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2. sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Melisiskan inti dengan nuclei lysis solution juga menguraikan atau merusakkan molekul RNA dengan Rnase solution 3. serum albumin. maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen. Mempresipitasikan protein dengan protein precipitation solution 4.

Lewiston 2002: 1–2). Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm. . Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. kemudian larutkan DNA dengan rehydration solution dengan maksud untuk mengawetkan DNA. Tahap berikutnya yaitu presipitasi. Sentifugasi ini bertujuan untuk memisahkan bagian sel dengan sitoplasma. Tahap selanjutnya yaitu pelisisan inti sel menggunakan nuclei lysis solution. Lanjutkan kembali dengan sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. putar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenasi. dan simpan DNA dalam suhu -20 0C(Harley 2005: 409–410. Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah. kemudian rehidrasi DNA pada suhu 650C selama 1 jam. Harley 2005: 410). Keringkan DNA pada suhu ruang. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu ruangan selama 10 menit. Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Setelah dilakukan inkubasi. saliva yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 3 menit dengan kecepatan 15000 rpm. sehingga menyebabkan protein mengendap. larutan pelisis sel darah putih ini terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur (Rybicki & Purves 2005: 1.pelisis sel (cell lysis solution). Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein (protein precipitation solution) dan kemudian divortex selama 20 detik yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Sentrifugasi kedua ini berfungsi untuk memisahkan bagian DNA dari inti sel. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel dari zat-zat lainnya.

Alkohol 70 % yang ditambahkan dalam keadaan dingin.3 Hasil Percobaan Pada akhir dari praktikum. d. Fungsi dari penambahan isopropanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. 4. Cell lysis solution adalah senyawa larutan konsentrasi tinggi (hipertonis). DNA terlihat seperti untaian benang halus di dasar tube. kemudian dilarutkan dalam rehydration solution hingga DNA tidak terlihat. c.4. mitokondria. baik dari inti. Selain itu jika alkohol yang dingin yang diberikan maka konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin pekat.2 Fungsi Bahan Praktikum Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang digunakan untuk memisahkan DNA dari sel . Nuclei lysis solution adalah senyawa yang mengandung detergen digunakan untuk melisiskan barier sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel. Strand strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat. Bila bercampur dengan sel maka akan terjadi proses osmosis yang mengakibatkan sel akan mengalami lisis b. RNAse Solution adalah senyawa yang berisi enzim pemutus RNA. sehingga menyebabkan protein mengendap. Karena pada detergen mengandung sodium dodesil sulfat ( SDA ) yang dapat menyebabkan hilangnya molekullipid pada membran sel sehingga struktur membrane akan rusak dan melisiskan isi sel. DNA rehydration solution berfungsi untuk pengawetan DNA e. Selain itu alkohol juga berfungsi mempurifikasi DNA. Protein Presipitation solution adalah senyawa yang mengandung amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah. . maupun kloroplas. karena pada alcohol yang dingin dapat membentu mempercepat proses mempurifikasi DNA. Kit Wizard DNA Purification (Promega) terdiri dari : a.

jaringan.5 Kesimpulan Teknik isolasi DNA merupakan langkah awal dalam proses pengidentifikasian DNA. Oleh karena itu.4 Analisis Percobaan DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti seperti pada sampel: darah. serum/plasma. Sentrifuge ketiga bertujuan untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitasi 4. Pencucian dengan menggunakan alkohol. akar rambut. Sentrifuge kedua bertujuan untuk memisahkan DNA dari isi nukleus 3. Teknik utama dari isolasi DNA adalah: 1. 5. sehingga DNA yang diharapkan dapat secara sempurna terisolasi.4. 4. Lisis sel dengan menggunakan deterjen keras (SDS atau Triton X). . Sentrifuge pertama bertujuan untuk memisahkan nukleus dari sitoplasma 2. Teknik isolasi DNA memiliki beberapa tahap. 2. sehingga meningkatkan keakuratan untuk mekanisme pengidentifikasian DNA berikutnya. 2. Penghancuran dinding sel. diperlukan kesempurnaan dalam mekanisme kerja. 4. Penghancuran membran sel dengan Cell Lysis Solution (CLS) Penghancuran membran inti dengan Nuclei Lysis Solution (NLS) Pengendapan protein dengan Protein Precipitation Solution (PPS) Pencucian DNA dengan isopropanol dan alkohol 70% Rehidrasi DNA dengan Rehidration Solution Tujuan sentrifugasi: 1. 3. 3. Membersihkan debris sel dengan proteinase. sperma. yaitu: 1.

Yuwono. Tribuwono.DAFTAR PUSTAKA tambahkan biokimia harper y !! Poedjiadi. Jakarta: Universitas Indonesia.ac.doc diunduh tanggal 20 Mei 2011 http://staff. Jakarta : Erlangga http://teachingteam.ac.unpad.id/wpcontent/uploads/2011/04/deteksi_dna_wssv.files. 2008.com/document_downloads/direct/48017024? extension=pdf&ft=1305878517&lt=1305882127&uahk=E85qAcTPqACziApDF GXa+GOEamY diunduh tanggal 20 Mei 2011 DOKUMENTASI PRAKTIKUM Proses Inkubasi campuran cell lysis Proses pengambilan supernatan setelah sentrifugasi I dengan mikropipet .com/kq/groups/21704042/1442093640/name/Pertanyaan+biot ekmol!.doc diunduh tanggal 20 Mei 2011 http://pustaka.ui. Biologi Molekuler. 1994.id/internal/132127781/publikasi/EksistensiDNAEBVPadaP enderitaKNFPublishedpadaSeminarPBIMalang2009.digilib.com/2010/05/isolasi-dna-nelektroforesis.doc diunduh tanggal 20 Mei 2011 http://xa.docx diunduh tanggal 20 Mei 2011 http://www.wordpress.pdf diunduh tanggal 20 Mei 2011 http://www.wordpress.012-08Deteksi%20Fragmen-Metodologi. Dasar-dasar Biokimia.ui.com/2010/05/laporan-isolasi-dnajadi2.ac.files.yimg.doc diunduh tanggal 20 Mei 2011 http://teachingteam.scribd.id/Lontar/file?file=digital/124134-BIO.

Proses pengambilan supernatan setelah sentrifugasi II dengan mikropipet Isi dari Kit Wizard Genomic DNA purification .

Alat Sentrifugator Alat Mikropipet .