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REACCIONES DE CARACTERIZACION DE AMINOCIDOS Y

PROTEINAS
OBJETIVOS:

Efectuar algunas reacciones para comprobar la presencia de protenas.


Comprobar la presencia de algunos aminocidos en forma libre o haciendo parte de las
protenas con base en las reacciones caractersticas de los grupos funcionales de esos
aminocidos .

FUNDAMENTOS:
Para escudriar si en una determinada muestra biolgica hay protenas pueden utilizarse numerosas
reacciones, unas relacionadas con la presencia en la cadena polipeptdica de determinados
aminocidos generalmente triptfano y tirosina o bien basarse en la misma estructura polipeptdica,
como es el caso de la reaccin del Biuret, propia de las series de al menos 2 enlaces peptdicos
contiguos y que, por tanto, permite valorar casi todos los tripptidos y todos los pptidos del orden
superior incluidas lasprotenas.
Reaccin de la ninhidrina:
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con el grupo amino de aminocidos libres y
con los grupos amino de la molcula protenica para dar un compuesto azul violeta.
Los aminocidos prolina e hidroxiprolinatambin reaccionan con la ninhidrina pero en este caso se
obtiene un color amarillo en lugar del violeta. La reaccin es muy sensible por lo cual se utiliza en
cromatografa y en la deteccin de amino cidos y protenas en muestras biolgicas.
Reaccin del Biuret:
Cuando una disolucin alcalina de sustancias que co ntienen enlaces peptdicos tales como el
Biuret, la oxamida, los polipptidos y las protenas, se aade sulfato cprico ,se forman sales
complejas de color violeta.
El nombre de reaccin del biuret proviene de un d erivado de la urea, el biuret, que, en
condiciones apropiadas, da esta reaccin. El biure t se forma en el curso del calentamiento de la
urea, con desprendimiento de amoniaco:
El biuret contiene en su molcula dos enlaces amidasucesivos, de modo anlogo a las protenas,
donde se presentan numerosos enlaces peptdicos sucesivos. Este biuret en medio alcalino forma
unos complejos de coordinacin con el cobre, de co lor azul morado caracterstico. La reaccin es

cuantitativa y permite valorar la presencia de protenas con bastante exactitud e


independientemente del tipo de protena.

H2N -C- NH2 + H2N -C- NH2

O
Urea

O
Urea

H2N-C NH -C- NH 2 + NH3

O
biuret

amoniaco

Reaccin xantoproteca
La reaccin xantoproteca (del griego xanthos, amar illo) permite descubrir en la molcula de
protena la presencia de aminocidos aromticos (fenilalanina, tirosina, triptfano).
Estos aminocidos, al nitrarse, producen un compuesto de color amarillo, caracterstico de los
nitrobencenos. No todas las protenas dan positiva esta reaccin ya que en unas pocas la presencia
de tirosina, triptfano y fenilalanina es extremadamente baja o nula. Este es el caso de la gelatina
derivada del colgeno.
Reaccin de Millon
Esta reaccin se debe a la presencia, en la molcula de protena, de la tirosina, que tiene en su
composicin un grupo fenlico. Este, por calentami ento con el reactivo de Millon (una mezcla de
nitrato y nitrito mercrico disueltos en cido tricon concentrado), produce una coloracin roja que
se debe a la formacin de nitrotirosina que, po r adicin de mercurio en el curso del calentamiento,
se transforma en una sal mercrica de color rojo.
Reconocimiento de arginina
La arginina, en presencia de -naftol, se oxida con hipobromito, perdiendo un grupo imino.
La arginina oxidada, al combinarse con otra molcula de -naftol, forma una sustancia de color
rojo que permite reconocerla.
Reconocimiento de triptfano.
El triptfano en presencia de iones de magnesio y d e cido oxlico (reactivo de Hopkins-Cole) y con
la presencia de un cido mineral, como el cidosulfrico, produce coloraciones violeta en la interfase
que se forma, debido a la formacin de co mplejos con el grupo indol del triptfano.

Determinacin de la presencia de aminocidos azufrados en las protenas


La determinacin de la presencia de aminocidos sulfurados se realiza mediante una hidrlisis
(puede ser incompleta) de la protena en un medio fuertemente alcalino, que conlleva a la
destruccin de los aminocidos sulfurados liberando el azufre que contienen en forma de sulfuro,

ion que se puede poner de manifiesto con la adicin


+

NH3

HS CH 2 CH COO
Cisteina

de una sal soluble de plomo, con el que


NH3

+ 2 NaOH

Na2S + (H3C COO) 2Pb

HO CH 2 CH COO + Na2S + H2O


2 H3C COONa + PbS negro

precipita el sulfuro de plomo, de color negro fcilmente reconocible:

MATERIALES Y REACTIVOS:
Bao mara
Hielo
casena 0.5%
gelatina 0.5%
glicina 0.1%
prolina 0.1%
metionina 0.1%
fenilalanina 0.1%
tirosina 0.1%
triptfano 0.1%
NaOH 30%
Pipetas de 5 ml.

sulfato cprico 1%
cido ntrico concentrado
reactivo de Millon
reactivo de Hopkins-Cole. 10 g de Mg en
polvo diluirlos en agua, se agrega 250 ml de
cido oxlico fresco. Se agita y se filtra. Se
acidifica el filtrado con cido actico y diluir
hasta 1 litro con agua.
cido actico glacial.
-naftol 0.05% en etanol-agua (1: 1)
24 tubos de ensayo a cada grupo.

PROCEDIMIENTO:
Realice las diferentes pruebas con la solucin de p rotena obtenida en la practica de aislamiento
de protenas con la solucin de protena de los qu e se encuentran en la mesa de reactivos y con
los aminocidos que se mencionan en cada caso.
Reaccin de la ninhidrina
En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solucin de cada una de las protenas (la obtenida
por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y en otros 1 ml de la muestra
problema, glicina, metionina y prolina, agregue 1 ml de ninhidrina a cada tubo y caliente a
ebullicin en bao mara durante 10 minutos. La so lucin debe adquirir un color violeta azul o
amarillo, en el caso de la prolina.

Deteccin de aminocidos azufrados:


En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solucin de cada una de las protenas (la obtenida
por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y en otros 1 mL de la muestra
problema, glicina, metionina, cisteina y cistina y se aade a cada uno 1 ml de hidrxido de sodio al
30%, se calienta en bao mara durante 10 minutos. Se enfran los tubos en un bao de agua fra, se
aaden 2,5 ml de acetato de plomo al 5%, se agita bien, se calienta suavemente y se observa el
oscurecimiento progresivo de la solucin .
Reaccin del biuret
En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solucin de cada una de las protenas (la obtenida
por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y en otros 1 mL de la muestra
problema y glicina, se les aade 2 ml de hidrxido de sodio al 30%, se mezcla cuidadosamente y se
agregan tres gotas de sulfato cprico al 1%. Se mezcla de nuevo. La aparicin de una coloracin
rojiza violeta indica la presencia de en laces peptdicos.
Reaccin xantoproteca
En varios tubos de ensayo se toma 1 ml de la solucin de protena separada por usted y una
protena de la mesa y en otros tubos 1 ml de la muestra problema y 1 mL de la solucin de los
aminocidos (glicina, fenilalanina, tirosina, triptfano) agregue luego 1 ml de cido ntrico
concentrado. En el caso de las protenas se observa la aparicin de un precipitado blanco que
corresponde a la protena desnaturalizada. Caliente en bao mara durante 5 minutos. La solucin o
el precipitado se tien de amarillo.
En caso de duda se deja enfriar el tubo de ensayo y se aaden 2 ml de hidrxido de sodio al 30%.
El color amarillo vira a naranja fuerte.
Reaccin de Millon
Tome 6 tubos de ensayo en adicione en cada uno 1 ml de la solucin de protena problema, de la
protena de la mesa, de la muestra problema, y de los aminocidos glicina, tirosina y triptfano.
Adicione 0.5 ml del reactivo de Millon y agite. Posteriormente agregue 0,5 ml de nitrito sdico y
agite. En los tubos que contienen protenas se forma un precipitado blanco. Caliente los tubos en
bao mara durante 5 minutos. La tirosina y las protenas que la contienen adquieren un color rojo.
Reconocimiento de arginina
Tome 6 tubos de ensayo y adicione a cada uno 1 ml de protena problema, protena de la mesa, de
la muestra problema y de los aminocidos arginina,glicina y prolina. Aada 0.1 ml de hidrxido de
sodio al 30% y 0.3 ml de -naftol al 0.05%. Se agita y se deja 5 minutos en un bao de hielo.
A continuacin se aaden 1 ml de hipobromito sdico 1N. La reaccin es positiva indicando la
presencia de arginina u otra guanidina, al aparecer una coloracin roja viva que se desvanece con
relativa rapidez. La adicin de 0.3 ml de urea al 40% estabiliza el color.

Reconocimiento de triptfano.
a)Reaccin de Hopkins-Cole
Tome 6 tubos de ensayo y adicione 1 ml de solucin de aminocidos glicina, triptfano, metionina,
de protena problema, protena de a mesa y muestra problema y adicione 1 ml de reactivo de
Hopkins-Cole a cada uno. Agite y luego agregue cuidadosamente por las paredes del tubo
inclinado, 1,5 ml de cido sulfrico concentrado. La aparicin de un anillo violeta en la interfase de
los lquidos es seal de la presencia de triptfano.
b)Reaccin del cido glioxlico:
Se toma en diferentes tubos de ensayo 1 ml de los aminocidos arginina, metionina y triptfano, y
en otro tubo 1 ml de protena problema, protena de la mesa y muestra problema. Adicione a cada
tubo 1 ml de cido actico glacial; luego dejecaer lentamente por las paredes del tubo 1 ml de cido
sulfrico concentrado hasta que se formendos fases. Observe el cambio de color en la interfase. Si
en ella se forma un anillo violeta, la reaccin es positiva e indica la presencia del aminocido
triptfano.

RESULTADOS:
Prueba:
Aminocidos
Y protenas
protena 1*
protena 2*
Glicina
Prolina
Fenilalanina
Tirosina
triptfano
Arginina
Metionina
Cisteina
Cistina

ninhidrina

biuret

xantoproteca

Millon

arginina

triptfano azufrados