BIOQUMICA II 2016 PRCTICA

Reporte N: 08
I.

Fecha de Entrega: 11/11/16

INFORMACION DE LA PRCTICA
a) Nombre: Bombeo de protones en Levaduras

Las levaduras son hongos microscpicos (unicelulares) son importantes por su

capacidad para realizar la descomposicin mediante fermentacin de diversos
cuerpos orgnicos. (Tortora, 2007) Las levaduras utilizan diversas fuentes de
carbono como los aminocidos, los carbohidratos, adems de cierta accin por
parte del nitrgeno y de algunas vitaminas. De la segunda fuente se pueden
mencionar a la glucosa, fructosa, galactosa y manosa; la maltosa y la sacarosa.
El metabolismo energtico es la base de las funciones celulares. Una
adecuada transferencia de electrones a travs de una serie de reacciones de
xido reduccin, garantiza la obtencin de sustratos energticos necesarios
para el ptimo funcionamiento de las clulas. Para su funcionamiento las
clulas requieren de energa bioqumica (ATP) la cual consiste en oxidar o
fermentar la glucosa y as obtener energa para la clula, lo cual se le conoce
como glucolisis, y de una fuente de potencial reductor (NADPH2 o NADH2). El
uso intensivo de ambas permite obtener el gran nivel de organizacin y
estructura que caracteriza a los organismos. La sntesis de ATP y potencial
reductor se acopla al metabolismo energtico de las clulas, es decir, depende
de la fotosntesis y la respiracin. En particular la generacin de ATP requiere
de la actividad de una clase especial de protenas asociadas a membranas
llamadas bombas de protones, cuya funcin es transportar protones (H+) hacia
volmenes especficos de las clulas. Esta actividad crea un gradiente de
concentracin de H+ lo bastante extenso como para establecer un diferencial
de potencial que produce energa libre capaz de desarrollar trabajo (Campbell,
2007)

Fig. 1.

Objetivos:
a) Estudiar el Bombeo de Protones, parte del proceso de Fosforilacin Oxidativa en
Levaduras a travs del cambio del pH del medio.
b) Estudiar el desacoplamiento de la Bomba de Protones utilizando 2,4 Dinitrofenol.

Materiales y reactivos:

Suspensin de levaduras 4%
2,4 dinitrofenol
Potencimetro
Glucosa al 12 %
Tubos de ensayo

Procedimiento:
1. Preparacin del Control
Preparar dos diluciones de 5 ml de la levadura con 10 ml de agua
destilada en tubos de ensayo A y B.
Al tubo B adicionar 4 mL de glucosa al 10% agitando y midiendo el pH
Determinar el pH de la solucin en intervalos de 3 minutos.

 Luego determinar el pH de la solucin en intervalos de 5 minutos por 20

minutos y luego en intervalos de 10 minutos por 20 minutos ms hasta 45
minutos aproximadamente
2. Preparacin del Desacoplamiento
Preparar un tubo C con 5 ml de la levadura con 10 ml de agua destilada y
por decantacin se adicion a la solucin 0.2 ml de dinitrofenol 40 mM.
Medir pH de la solucin a intervalos de 2 minutos luego cada 5 minutos.
Luego adicionar 4 ml de glucosa al 10% agitando y midiendo el pH en
tubos de ensayo A y B.
Luego determinar el pH de la solucin en intervalos de 5 minutos por 15
minutos.
Anotar los cambios de pH obtenidos en el tiempo y elaborar una grfica
Tiempo vs pH para cada tubo.

Resultados
En un intervalo de cada 5 minutos anotamos los cambios obtenidos en el
pH con ayuda del papel tornasol, siendo los resultados siguientes:

Tiempo

pH - A

pH - B

pH - C

T0

T1

5.8

5.5

5.5

T2

5.5

5.2

5.3

Grafica Tiempo vs. pH

6.2
6
5.8
5.6
5.4
5.2
5
4.8
0 min.

5 min.
pH - A

pH - B

Grfica 1. Tiempo vs. pH

10 min.
pH - C

Discusiones
Los cambios de pH que se presentaron son debido a la ATPasa tipo P
bombea K+ y protones en la membrana plasmtica, bombea estos ltimos
del citosol hacia afuera de la clula estableciendo una diferencia
electroqumica hasta 2 unidades de pH. Los protones fueron transportados
y eso logro el cambio de pH en la levadura.
Los cambios de pH en lo solucin de levadura-glucosa en el tubo pH - B se
debe a la protonacin de la glucosa, efecto sucedido por la reaccin de
levadura, la cual a nivel celular es encargada de los acoplamientos de
hidrolisis del ATP, el cual funciona como motor de bombeo de protones H+
hacia a fuera de la clula.
La liberacin de H+ por la accin de la formacin de ATP, acto conseguido
por la ATP sintasa ubicado en la mitocondria de la levadura, al obtener los
H+ de la glucosa para la formacin de ATP, as como el bombeo se genera
un gradiente electroqumico de protones que se utiliza para impulsar el
transporte de nutrientes al interior de la clula. Se observ entonces que el
pH se reduce al pasar de los minutos.
Por otra parte, en el tubo pH C al cual se le agrego 0.2 ml de dinitrofenol
40mM el cual es un agente desacoplante, siendo aquel que no detiene el
proceso, sin embargo, impide la comunicacin entre procesos que ocurren
por sinergia mutua, como lo son la sntesis de ATP y la creacin del
gradiente qumico y electroqumico segn el cual se impulsa la ATPasa en
la teora quimiosmtica. El DNP afecta la integridad de la membrana
mitocondrial permitiendo que los protones pasen a travs de sta y no
obligatoriamente por la ATPasa, tal y como se esperara la concentracin de
hidrogeniones aumenta, de mano de la disminucin en el pH, ya que stos
escapan indefinidamente al medio, lo que sustenta la tesis de que el DNP
es un agente desacoplante.

Conclusiones

En la operacin interna de varias enzimas, la clula mantienen una

concentracin de H+, por ellos, diferentes autores han tratado de
atribuirle un papel predominante a la bomba de protones, en el
control de pH interno , sin embargo la funcin de la bomba de
protones como reguladora del pH aun no es muy clara, Jaramillo
(2007) dice que por un lado es predominantes la participacin de
ATPasa para mantener una grande diferencia en el pH, pero no la
misma bomba estara a cargo del pH, pues ms all de esto se
explica que hay mecanismo propios del metabolismo que son
capaces de liberar o consumir una buena cantidad de protones que

hacen regular el pH de la clula aun cuando la bomba de protones

sea inhibida.
El mecanismo de la bomba de protones por parte de la ATPasa en
levadura da lugar no solo a que no se acidifique si no al contrario, en
presencia de glucosa, sea ms alto, dando lugar a una alcalinizacin,
resulta pues, que la ATPasa funciona ms como la responsable de
los cambios y no de la reguladora de pH.
Los desacoplantes qumicos como el DNP daan la relacin entre la
cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa por
que altera el gradiente protn-motriz, algo que es observable con las
medidas de pH ya que este disminuye por que la concentracin de
protones aumenta.

Referencias Bibliogrficas

Stryer, Beng, Lubert. Bioqumica 10taedicin, cap.18. Fosforilacin

oxidativa, 2008.
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Tortora. (2007).
Panamericana.

Introduccion

la

microbiologia.

Buenos Aires:

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http://www.acmor.org.mx/sites/default/files/1103.pdf

Cuestionario
1. Explique el acoplamiento fosforilacin oxidativa y transporte de
electrones.
La hiptesis del acoplamiento quimiosmtico, lo que le vali el Premio Nobel de
Qumica a Peter D. Mitchell, explica que la cadena de transporte de electrones
y la fosforilacin oxidativa estn acopladas por el gradiente de protones. El flujo
de protones crea un gradiente de pH y un gradiente electroqumico. Este
gradiente de protones es usado por la ATP sintasa para formar ATP va la
fosforilacin oxidativa. La ATP sintasa acta como un canal de iones que
"devuelve" los protones a la matriz mitocondrial. Durante esta vuelta, la energa
libre de Gibbs producida durante la generacin de las formas oxidadas de los
transportadores de electrones es liberada. Esta energa es utilizada por la
sntesis de ATP, catalizada por el componente F1 del complejo FOF1 ATP
sintasa.

El acoplamiento con la fosforilacin oxidativa es un paso clave en la produccin

de ATP. Sin embargo, en ciertas ocasiones desacoplarlo puede tener usos
biolgicos. En la membrana interna mitocondrial de los tejidos adiposos
marrones existe una gran cantidad de termogenina, que es una protena
desacopladora, que acta como una va alternativa para el regreso de los
protones a la matriz. Esto resulta en consumo de la energa en termognesis
en vez de utilizarse para la produccin de ATP. Esto puede ser til para generar
calor cuando sea necesario, por ejemplo, en invierno o durante la hibernacin
de ciertos animales.
2. Menciones las caractersticas del Bombeo de Protones hasta la
formacin de ATP.
En la cadena de transporte de electrones se secuestra protones de la matriz
mitocondrial y se translocan al espacio intermembranal. Este transporte de
protones, que est acoplado a la propia cadena de transporte de electrones,
crea un gradiente tanto en pH como en carga elctrica y establece un potencial
electroqumico que acta como una batera o reserva de energa para la clula
(como condensador elctrico).
Las bombas encargadas de bombear los protones gracias al paso de los
electrones son las llamadas bombas redox (que se corresponden con los
complejos mitocondriales de la cadena de transporte: los complejos I, III y IV).
El bombeo de protones se realiza en contra gradiente, por lo que supone un
gasto de energa que es proporcionado por el flujo de electrones de la cadena
respiratoria.
La membrana mitocondrial interna funciona, pues, de manera similar a un dique
en un ro, bloqueando el flujo de protones hacia la matriz; los protones solo
pueden regresar a la matriz a travs de las ATP sintasas; lo hacen a favor de
gradiente y ello genera energa en forma de ATP.
3. Explique los complejos del sistema de transporte de electrones que
participan en la sntesis de ATP.

Complejo I
El complejo I o NADH deshidrogenasa o NADH: ubiquinona oxidoreductasa
(EC 1.6.5.3) capta dos electrones del NADH y los transfiere a un transportador
liposoluble denominado ubiquinona (Q). El producto reducido, que se conoce
con el nombre de ubiquinol (QH2) puede difundir libremente por la membrana.
Al mismo tiempo, el Complejo I transloca cuatro protones a travs de
membrana y produce un gradiente de protones.
El flujo de electrones ocurre de la siguiente forma:
El NADH es oxidado a NAD+, y reduce al FMN a FMNH2 en un nico paso que
implica a dos electrones. El siguiente transportador de electrones es un centro
Fe-S que slo puede aceptar un electrn y transferirlo a la ubiquinona

generando una forma reducida, denominada semiquinona. Esta semiquinona

vuelve a reducirse con el otro electrn que quedaba, generando el ubiquinol,
QH2. Durante este proceso, cuatro protones se translocan a travs de la
membrana interna mitocondrial, desde la matriz hacia el espacio
intermembrana.
Complejo II
El Complejo II o succinato deshidrogenasa; [1] EC 1.3.5.1 no es una bomba de
protones. Adems, es la nica enzima del ciclo de Krebs asociado a
membrana. Antes de que este complejo acte el FADH2 se forma durante la
conversin de succinato en fumarato en el ciclo del cido ctrico. A
continuacin, los electrones son transferidos por medio de una serie de centros
FeS hacia Q. EL glicerol-3-fosfato y el acetil-CoA tambin transfieren electrones
a Q mediante vas diferentes en que participan flavoprotenas.
Complejo III
El complejo III o complejo citocromo bc1; EC 1.10.2.2, obtiene dos electrones
desde QH2 y los transfiere a dos molculas de citocromo c, que es un
transportador de electrones hidrosoluble que se encuentra en el espacio
intermembrana de la mitocondria. Al mismo tiempo, transloca cuatro protones a
travs de la membrana por los dos electrones transportados desde el ubiquinol.
Complejo IV
El complejo IV o citocromo c oxidasa; EC 1.9.3.1 capta cuatro electrones de las
cuatro molculas de citocromo c y se transfieren al oxgeno (O2), para producir
dos molculas de agua (H2O). Al mismo tiempo, se translocan cuatro protones
al espacio intermembrana, por los cuatro electrones. Adems "desaparecen" de
la matriz 2 protones que forman parte del H2O.