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INMOVILIZACIN DE CLULAS DE Pseudomonas spp PARA LA

DEGRADACIN DE CLORUROS DE AGUAS DEL RIO PAMPLONITA


Hernndez, Deissy; Jaimes, Jessica; Torres, Erika
Biotecnologa Facultad de Ciencias Bsicas - Departamento de
Microbiologa
Universidad de Pamplona, 2015
INTRODUCCIN
El abastecimiento de agua para uso y consumo humano con calidad
adecuada es fundamental para prevenir y evitar la transmisin de
enfermedades, por este motivo
se requiere establecer lmites
permisibles en cuanto a sus caractersticas bacteriolgicas, fsicas,
organolpticas, qumicas y radiactivas. Un parmetro de calidad
importante es la concentracin de cloruros que se encuentran en el agua
natural que proceden de la disolucin de suelos y rocas que los
contengan y que estn en contacto con el agua, o de la descarga de
aguas residuales domsticas, agrcolas e industriales a aguas naturales
(). En el caso de una zona rida el aumento de cloruros en un agua se
debe al lavado de los suelos producido por fuertes lluvias. Adems a
veces puede presentarse un incremento espordico del contenido en
cloruros como consecuencia de contaminaciones domsticas (Grupo de
Tratamiento de Aguas Residuales, 2015). Las heces humanas, por
ejemplo, suponen unos 6 g de cloruros por persona y da. En lugares
donde la dureza del agua sea elevada, los compuestos que reducen la
dureza de aguas tambin son una importante fuente de aportacin de
cloruros, y la infiltracin de agua subterrnea en las alcantarillas
contiguas a aguas saladas constituye tambin una potencial fuente de
cloruros y sulfatos.
El ion cloruro es uno de los iones ms difundidos en las aguas naturales.
No suele ser un ion que plantee problemas de potabilidad a las aguas de
consumo, aunque s que es un indicador de contaminacin de las aguas
debido a la accin del hombre. Esto es as porque, aunque la
concentracin de cloruro en aguas naturales es muy variable pues
depende de las caractersticas de los terrenos que atraviesan, dicha
concentracin es menor comparada con la concentracin del ion en
aguas residuales ya que la actividad humana incrementa
necesariamente dicha concentracin (Oyala, 2006).

Puesto que los mtodos convencionales de tratamiento de las aguas no


contemplan la eliminacin de cloruros en cantidades significativas,
concentraciones de cloruros superiores a las normales pueden constituir
indicadores de que la masa de agua receptora est siendo utilizada para
el vertido de aguas residuales. Uno de estos cloruros es el cloruro de
vinilo, compuesto orgnico extremadamente voltil de gran importancia
por una serie de razones, una vez dichos compuestos se hallan en
estado gaseoso, su movilidad es mucho mayor, con lo que aumenta la
posibilidad de su liberacin al medio ambiente; la presencia de algunos
de estos compuestos en la atmsfera puede conllevar riesgos para la
salud pblica; y contribuyen al aumento de hidrocarburos reactivos en la
atmsfera, lo cual puede conducir a la formacin de oxidantes
fotoqumicos.
El uso de procedimientos biolgicos para limpiar suelos y agua
contaminada (biorremediacin) ha recibido especial atencin, por ser de
bajo costo y ambientalmente amigable, comparado con los
procedimientos qumicos y fsicos. Como alternativa de limpieza de
aguas contaminadas se ha acudido a la utilizacin de elementos
biolgicos que contribuyen a la oxidacin, degradacin, transformacin y
completa mineralizacin de estos contaminantes. Los mtodos de
tratamiento biolgico dependen de la capacidad de los organismos para
degradar los contaminantes, dentro de estos microorganismos destacan
las bacterias del genero Pseudomonas spp las cuales poseen la habilidad
de utilizar diversos substratos, Pseudomonas spp es una bacteria
productoras de biosurfactantes como los ramnolipidos involucrados en
procesos de remocin de aceites y productos relacionados, Bushnell y
Hass fueron de los primeros en describir bacterias productoras de
biosurfactantes, (29,35). Debido a que contienen enzimas degradadoras
()
El gnero Pseudomonas spp representa un grupo grande e importante
de bacterias gram negativas el cual incluye especies de gran
versatilidad metablica as como de propensin patolgica, de ah su
importancia tanto clnica como ambiental. Muchos estudios sobre este
gnero bacteriano enfatiza en su notable capacidad para degradar una
gran cantidad de compuestos orgnicos, aromticos, derivados
halogenados y una variedad de residuos orgnicos recalcitrantes que
rara vez son degradados o pobremente degradados por otros grupos
microbianos. Las especies de Pseudomonas spp son una fuente rica en
plsmidos catablicos y de resistencia, con genes que codifican para

enzimas involucradas en la degradacin de una amplia variedad de


compuestos que generalmente no son metabolizados por otro grupo de
bacterias (Garca, 2004).
Ya que Pseudomonas spp ha mostrado una respuesta positiva en la
degradacin de diferentes contaminantes incluso cloruro se han
implementado tcnicas como la inmovilizacin de clulas que se pueden
utilizar con este propsito, para aumentar la eficiencia del proceso con
una disminucin de costos. La inmovilizacin celular puede ser definida
como la ubicacin fsica de clulas en un espacio o regin especfica, de
forma natural o inducida, en la cual son capaces de mantener una
actividad cataltica deseada (Garzn, 2008). Korkoutas y colaboradores
(2004) indican que para lograr una inmovilizacin que sea eficaz para el
proceso a realizar, se deben tener en cuenta que los espacios que se
usarn como soporte de inmovilizacin cumplan con ciertos parmetros
tales como la presencia de una superficie de adherencia amplia, que sea
de fcil operacin y regeneracin; debe tener buena porosidad con el fin
de permitir un intercambio constante de sustratos, productos, gases,
etc.; debe tener una buena estabilidad qumica, biolgica, mecnica y
trmica, as como resistente a enzimas, solventes o cambios de presin.
En cuanto a las clulas a inmovilizar, afirman que estas deben ser
viables y deben mantener un metabolismo activo por periodos largos,
as como su metabolismo no debe verse afectado por los procesos de
inmovilizacin (Garzn, 2008).
Pseudomonas spp puede ser utilizada en la recuperacin de aguas
contaminadas, su inmovilizacin le conferira una mayor resistencia al
efecto toxico de algunos compuestos, mayor resistencia a variaciones de
temperatura y pH, ms eficiencia en el uso de clulas inmovilizadas
debido a mayor concentracin celular por unidad de volumen, lo que
deriva en mayor velocidad de degradacin. Adems puede usarse
repetidamente una misma poblacin de clulas inmovilizadas en una
matriz polimrica (Garca, 2004).
HIPTESIS
Debido a que diferentes cepas de Pseudomonas spp han demostrado su
efectividad para degradar compuestos que en su composicin contienen
cloruros como cloruro de tributilestao, bifenilos policlorados, cloruros
de benzalconio, tetraclorometano y cloruro de polivinilo que pueden
convertirse en contaminantes de aguas naturales afectando la
vegetacin natural. Se esperara que una cepa de Pseudomonas spp no

nativa inmovilizada pueda degradar iones cloruros o compuesto clorados


de menor complejidad molecular en un corto periodo de tiempo a nivel
de laboratorio y de esta manera tener una alternativa que pueda reducir
la concentracin de cloruros en aguas naturales que presentan
contaminacin domestica de estos compuestos como el rio Pamplonita.

OBJETIVO
General
Determinar la capacidad de clulas inmovilizadas de Pseudomonas spp
para degradar cloruros de aguas del rio Pamplonita.
Especficos.

Evaluar el efecto de Pseudomonas spp no nativa para degradar


cloruros en muestras de agua del rio Pamplonita.
Emplear a Pseudomonas spp en la biorremediacion de aguas para
la reduccin de cloruros.
Establecer la concentracin de cloruros que es capaz de degradar
Pseudomonas spp en determinados intervalos de tiempo.

METODOLOGA
Materiales: vaso de precipitados de 100 ml (10), bureta de 25 ml,
Erlenmeyer de 250 ml, pipeta de 10 ml, frasco lavador, pHmetro. Jeringa
estril (20 ml), 5 tubos falcn de 15 ml estriles, plancha de
calentamiento, agitador magntico estril, varilla de vidrio estril,
equipo de filtracin por membrana.
Reactivos: solucin reguladora de pH 4 y 7. AgNO 3 0,1 N. K2CrO4
(50g/L). 2 g de agarosa, 100 ml MMS, agua destilada estril, aceite de
soya.
Mtodos.
Toma de la muestra: se tomaron 3 muestras de 1000 ml de agua del
rio pamplonita en la zona de la plazuela Almeida (un vertedero y el rio) y
del hospital San Juan de Dios (vertedero), los cuales se depositaron en
recipientes de vidrio previamente esterilizados. El recipiente se sumergi
hasta una profundidad
de aproximadamente 20 cm con la boca

ligeramente hacia arriba y ya que exista corriente en las zonas de


muestreo, la boca del frasco se orient hacia la corriente. Luego se
procedi a tapar los recipientes con las muestras para ser almacenadas
en refrigeracin a 4C. El muestreo se realiz por duplicado.
Determinacin de cloruros: Teniendo en cuenta el mtodo de Mohr,
se tomaron 10 ml de agua a la que se le ajusto el pH en un rango de 7
-10 utilizando NaOH 1N o H 2SO4 1N segn fuese el pH del agua, acido o
alcalino, por esto previamente se determin el pH de la muestra usando
un pHmetro. A la muestra con el pH ajustado se le adiciono 0.3 ml de
solucin indicadora de cromato de potasio (K2CrO4). Luego se titul la
muestra con la solucin estndar de nitrato de plata (AgNO 3) hasta
obtener un color amarillo rosado (curuba). En este punto se detuvo la
titulacin. Tambin se titul una muestra blanco (agua destilada) y la
concentracin del ion cloruro se calcul usando la siguiente formula:
cloruros (mgCl/L) = (A-B)*N *35450/V. Donde; A son los ml de AgNO 3
gastados para titular la muestra; B son los ml de AgNO 3 gastados para
titular el blanco; N es la normalidad del AgNO3; V es el volumen de la
muestra en ml; y 35450 son 35.45 mgCl/meq x 1000 ml/L (Oyala,
2006). Las interferencias en la lectura de la concentracin de cloruros
como la materia orgnica se eliminaron filtrando la muestra usando
filtracin por membrana. Los Br- , I- , y CN- se registraron como
concentraciones equivalentes de Cl. Los iones sulfuro, tiosulfuro y sulfito
se eliminaron con agua oxigenada, al 30% (Grupo de Tratamiento de
Aguas Residuales, 2015).
Microorganismo: se utilizara una cepa de Pseudomonas spp
suministrada por el Cepario de la universidad de Pamplona. La cual se
suspender en agua estril para determinar su concentracin a una
absorbancia de 600 nm usando en espectrofotmetro. Se elaborara un
medio mnimo de sales minerales (MMS) que contiene (en g/l) 0.5
KH2PO4, 1.0 NH4CI, 2.0 Na2SO4, 2.0 KNO3, 0.001 CaCI2.6H20, 1.0 MgSO4.
7H2O, 0.0004 FeSO4
Inmovilizacin de clulas en geles de agarosa: en un Erlenmeyer
con 100 ml de MMS se disolvieron 2 g de agarosa, este se suplemento
con Pseudomonas spp previamente suspendidas a una concentracin de
10 ufc/ml. Esta mezcla se llevara a un vaso de precipitado estril con
aproximadamente 300 ml de solucin de CaCl 2 estril con agitador
magntico para producir una agitacin suave de la mezcla. Por lo
anterior, la agarosa-clulas se transferir a una jeringa estril, haciendo

gotear la mezcla sobre la solucin de CaCl 2 al 3% para formar pequeas


geles esfricos. Luego se agita por 5 minutos ms y se lavan las perlas
con agua destilada estril para eliminar el exceso de iones Ca 2 +. Las
perlas se guardaran en una cantidad mnima de agua estril a 4C
(Chivita, 2003).
Determinacin de la degradacin de cloruros: dependiendo del
nmero de perlas formadas se dividirn en dos partes, para re
suspenderlas en 100 ml de muestras de agua en Erlenmeyer de 250 ml.
De esta manera se realiza el seguimiento en la degradacin de cloruros
por parte del microorganismo inmovilizado, determinando la
concentracin de cloruros por medio de una curva patrn basado en el
mtodo de Mohr, realizando este anlisis en cuatro tiempos (da 0, 5, 10
y da 15). Finalmente se realizara la grfica concentracin vs tiempo de
la degradacin de cloruros en la matriz de agarosa. Para determinar la
cantidad y viabilidad de clulas presentes en la matriz, se tomaran 10
esferas de agarosa del medio de cultivo y se colocaran en 9 ml de agua
estril. Se maceraran hasta deshacerlas y se agitaran en un vrtex para
terminar de deshacerlas para luego tomar 1 ml de la solucin con las
esferas de agarosa maceradas y diluirlas en agua estril. Finalmente se
har el recuento en placa en agar cetrimide y agar nutritivo (Chivita,
2003).

BIBLIOGRAFA
Chivita, L. D. (2003). Evaluacin de matrices para la inmovilizacin de
Pseudomonas spp. en biorremediacin de fenol. Bogot D.C.:
Universidad de los Andes.
Ferrera, R. R. (2006). Procesos de biorremediacion de suelo y agua
contaminados por hidrocarburos del petrleo y otros compuestos
orgnicos. revista latinoamericana de Microbiologia, 179-187.
Garcia, E. G. (2004). Pseudomonas en Biotecnologa. BioTecnologa, 2637.
Garzn, C. B. (2008). INMOVILIZACIN MICROBIANA: TECNICAS Y USOS
EN EL TRATAMIENTO DE RESIDUOS TOXICOS. Revista Sistemas
Ambientales, 23-34.

Grupo de Tratamiento de Aguas Residuales. (s.f.). Enciclopedia


Medioambiental. Recuperado el 18 de octubre de 2015, de
Universidad de Sevilla: http://www.ambientum.com
Oyala, R. (2006). Determinacin de Cloruro en una muestra por mtodo
de Mohr. laboratorio Quimica Analitica, 1-3.
Weinel, C. P. (2002). Complete genome sequence and comparative
analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida
KT2440. Environmental Microbiology, 799-813.